BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

LUCRAREA PRACTICĂ NR.6

FAMILIA CLOSTRIDIACEAE

GENUL CLOSTRIDIUM

Genul include bacteriile Gram pozitive sporogene anaerobe, catalază negative, mobile și
necapsulate cu excepția specie Cl. perfringens, care este este lipsită de cili dar posedă capsulă .
Sporul este dispus central, subterminal sau terminal și depășește diametrul transversal al
celulei vegetative pe care o deformează.
Genul include peste 120 specii, care în funcție de patogenitate și de mecanismele patogenității
pot fi clasificate în:
• Specii patogene, predominant sau exclusiv toxigene: Cl. tetani și Cl. botulinum
• Specii patogene prin toxicitate și virulență: Cl. perfringens, Cl. chauvoei, Cl. novyi, Cl.
septicum.
• Specii accidental patogene: Cl. histolyticum, Cl. sordelli , Cl.sporogenes, Cl. bifermentas.
• Specii saprofite nepatogene: Cl. butyricum, Cl. tetanomorphum, Cl. putrefaciens

SPECII PREDOMINANT sau EXCLUSIV TOXIGENE

CLOSTRIDIUM TETANI

I. Istoric și taxonomie
Nicolaier (1884), a demonstrat originea telurică a tetanosului și a reprodus boala la iepuri,
cobai și șoareci prin inocularea acestora cu pământ de grădină.
Behring și Kitasato (1889) au izolat bacteria în cultură pură și au demonstrat efectul imunizant
al toxinei tetanice și efectul neutralizant al serului antitetanic.

II. Ecologie
Cl. tetani este o bacterie saprofită, prezentă sub formă de spori în sol și în tubul digestiv al
diferitelor specii de animale, mai ales la ierbivore.

61
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

III. Infecția naturală

Cl. tetani este agentul etiologic al tetanosului (nume comune: boala cerbului, fălcăriță).
Speciile cele mai sensibile sunt omul și solipedele, urmate în ordinea descrescândă a receptivității de
suine. Relativ rezistente sunt taurinele, datorită anticorpilor circulanți specifici sintetizați ca urmare a
absorbției toxinei tetanice de la nivelul compartimentelor gastrice, unde, o parte din sporii ingerați se
transformă prin germinare în celule vegetative, metabolic active. Boala este rar întâlnită la ovine,
caprine, carnasiere și extrem de rar la păsări. Calea de infecție o constituie așa numitele ,,plăgi
tetanigene", - profunde, cu țesuturi necrozate, murdărite cu pământ, care asigură anaerobioza necesară
germinării sporilor și multiplicării formelor vegetative. Tabloul clinic este dominat de tetania
musculaturii striate produsă de toxina tetanică, moartea survenind prin asfixie în urma tetaniei
mușchilor respiratori sau spasmului glotei.

IV. Conduita diagnosticului bacteriologic

Deoarece simptomatologia în tetanos este foarte caracteristică, diagnosticul nu necesită
investigații de laborator, încât examenul bacteriologic se practică rar, de obicei în caz de litigiu.
➢ examenul bacterioscopic direct al materialului recoltat din plaga tetanigenă este
neconcludent.
➢ examenul bacteriologic propriu-zis
1. Condiții de cultivare
Bacterie strict anaerobă, dezvoltă culturi pe medii uzuale anaerobe ( V.F., V.L., Veillon, Kitt-
Tarozzi) incubate în anaerostat, la 37°C, în 4-7 zile. Pentru a stimula producția de toxină tetanică
(necesară pentru prepararea vaccinului antitetanic), se folosește mediul V.F glucozat 8% cu pH 5,8 iar
incubarea se face la temperatura de 33°C.
2. Caractere culturale
Culturile în medii lichide prezintă turbiditate uniformă și degajă miros de corn ars.
Pe suprafața mediilor solide, Clostridium tetani formează colonii mari, cu diametrul de 4-6
mm, gri, opace, cu margini neregulate, rizoide.
În profunzimea mediilor solide, dezvoltă colonii caracteristice cu aspect de puf de păpădie:
globuloase, cu centrul opac și periferia difuză.
3.Caractere morfologice
Clostridium tetani este un bacil Gram pozitiv lung și subțire, mobil (cili dispuși peritrich),
necapsulat, sporulat. Sporii sunt ovali sau sferici și, deoarece sunt așezați terminal, imprimă bacililor
aspect de băț de chibrit (fig.6.1.).

62
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

4.Caractere biochimice:
Bacteria manifestă o slabă activitate glucidolitică și proteolitică, reduce nitrații în nitrați și este
hemolitică.

Fig. 6.1. Clostridium tetani, colorația Gram, MO, x 1000

5.Caractere antigenice și de patogenitate

Structură antigenică somatică (Ag. O) este omogenă dar antigenul flagelar (Ag. H) diferă de la
o tulpină la alta, identificându-se 10 serovariante (serotipuri).
Patogenitatea se datorează în exclusivitate toxicității, Clostridium tetani fiind lipsit de factori
antifagocitari și agresine. El se multiplică și rămâne cantonat la nivelul porții de intrare (plaga
tetanigenă), unde eliberează o toxină de natură proteică cu un grad de toxicitate foarte ridicat (1mg de
toxină conține 4 800 000 DLM pentru cobai). Toxina tetanică difuzează pe cale nervoasă sau sanguină
către centrii neuromotori, la suprafața cărora se fixează prin intermediul unor receptori chimici,
blocând acțiunea colinesterazei, - enzimă care reglează nivelul acetilcolinei la nivelul SNC și a
sinapselor neuromusculare. Acumularea în exces a acetilcolinei este responsabilă de instalarea tetaniei
(contracții musculare susținute, de lungă durată) .
Toxina tetanică este constituită din 2 fracțiuni:
- tetanolizina, cu acțiune hemolitică, cardiotoxică și necrotică și,
- tetanospasmina- , neurotoxică, responsabilă de sindromul tetanic.
6.Infecția experimentală
Testarea toxicității tulpinilor de Cl.tetani se face pe cobai și pe șoarece, prin inoculare
intramusculară la unul din membrele posterioare.
După 1-2 zile apare tetania membrului inoculat, care ia poziția de extensie forțată, apoi
contracțiile se extind la membrul pereche, animalul adoptând poziția caracteristică de focă. Treptat,
tetanosul avansează spre trenul anterior, moartea fiind determinată de tetania diafragmei și muschilor
intercostali . Această evoluție a bolii (tetanosul ascendant) este patognomonică pentru identificarea
toxinei.

63
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

VI. Sensibilitatea față de factorii de mediu și substanțele antimicrobiene

Formele vegetative sunt distruse la 60-65°C și sunt sensibile la penicilină, cloramfenicol,
tetraciclină, eritromicină. Tulpinile de Cl. tetani sunt sensibile la bacteriocinele produse de Cl.
perfringens.
Sporii sunt foarte rezistenți la temperaturile crescute și desicație. Rezistă o oră la 100°C și 15-
20 minute la 120°C, iar în sol și materialele patologice uscate rămân viabili zeci de ani .
Substanțele dezinfectante uzuale sunt mai puțin eficiente în comparație cu efectul lor asupra
sporilor altor specii, iar dintre antiseptice, doar apa oxigenată are un puternic efect bactericid datorat
eliberării oxigenului în contact cu lichidele tisulare din plagă.

VII.Imunoprofilaxie
Vaccinul antitetanic (anatoxina tetanică) este preparat din toxina tetanică detoxifiată prin
tratare cu formol și căldură, la care se adaugă un adjuvant pentru stimularea imunogenității (obișnuit,
hidroxid de aluminiu). Se vaccinează omul și cabalinele.
Serul hiperimun antitetanic (antitoxina tetanică) se prepară pe cal și este utilizat în scop
profilactic (înaintea intervențiilor chirurgicale și în plăgile accidentale) și curativ în faza incipientă a
bolii , asociat cu penicilina.

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

I. Istoric:
În 1870, Müller a numit ,,botulism", intoxicația care apărea la om consecutiv consumului de
cârnați (lat. botulus =cârnat), iar în 1897, Von Ermengen izolează și descrie agentul etiologic,
demonstrând rolul determinant al toxinei botulinice în apariția paraliziilor caracteristice acestei
intoxicații.

II. Ecologie
Clostridium botulinum este o bacterie saprofită răspândită sub formă de spori în sol, de unde
poate contamina furajele sau alimentele. Ea este prezentă și în tubul digestiv al ierbivorelor.

III. Infecția naturală

Intoxicația botulinică (botulismul) apare la om și animale (mamifere și păsări) consecutiv
consumului de alimente, respectiv furaje contaminate cu Cl. botulinum , în care bacteria a sintetizat și
eliberat toxina. La om, în cazurile de botulism sunt incriminate conservele și preparatele în membrană
64
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

(mezeluri, caltaboși, pateuri etc,) iar la animale, furajele însilozate deoarece acestea asigură condițiile
de anaerobioză necesare multiplicării bacteriei și producției de toxină.

IV. Conduita diagnosticului bacteriologic

➢ examenul bacterioscopic direct - neconcludent, nu se practică
➢ examenul bacteriologic propriu-zis urmărește izolarea și identificarea agentului
cauzal și detectarea toxinei botulinice în alimentul sau furajul suspect și în prelevatele
patologice de la pacienți (vomismente, fecale, urină, sânge, ficat – în cazul
cadavrelor). Izolarea bacteriei din conținutul intestinal al animalelor purtătoare de Cl.
botulinum , nu are valoare de diagnostic
1. Condiții de cultivare
Cl. botulinum se dezvoltă în condiții stricte de anaerobioză, la temperaturi cuprinse între 25 și
30°C pe medii uzuale anaerobe (bulion VF, agar VF, geloza Veillon). La izolare, este indicată
utilizarea mediilor de îmbogățire (bulioane anaerobe cu adaos de glucoză și tripsină sau/și lizozim, -
enzime cu rol în activarea toxinei și destresarea sporilor din alimentele tratate termic). Culturile din
mediile de îmbogățire se transferă pe agaruri selective, care conțin gălbenuș de ou (ingredient care
favorizează recuperarea sporilor injuriați termic) și antibiotice: cicloserină, sulfadiazină, acid nalidixic,
kanamicină, gentamicină (Bărzoi D., 1999).
2. Caractere culturale

În mediile lichide pentru anaerobi, cultura are o

Fig. 6.2. Clostridium botulinum –cultură
pe mediul AEY.
commons.wikimedia.org
turbiditate intensă, depozit omogenizabil și miros rânced
caracteristic.
Pe mediile solide, Cl. botulinum formează colonii
mari (3-4 mm), mate, gri, cu margini rizoide, asemănătoare
cu cele de Cl. tetani (fig.6.2.). Prin însămânțare în
profunzimea mediului, se dezvoltă colonii cu aspect de
grenadă în explozie.

3. Caractere morfologice
Cl. botulinum este un bacil Gram pozitiv de dimensiuni mari (2-10/0,5-2,4 µ), drept sau ușor
încurbat, mobil cu cili dispuși peritrih, necapsulogen. Sporul este dispus subterminal și deformează
celula vegetativă, conferindu-i aspectul de lampă de petrol (fig. 6.3 ).

65
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

Fig. 6.3. Clostridium botulinum –col. Gram, MO, X1000

commons.wikimedia.org

4. Caractere biochimice
Clostridium botulinum este hemolitic și manifestă activitate gelatinolitică și lecitinazică. Nu
produce indol, fermentează glucoza, zaharoza, maltoza și fructoza, nu fermentează lactoza.
5. Caractere antigenice și de patogenitate
Sunt cunoscute 7 tipuri antigenice de toxină, notate cu A,B,C,D,E,F.G, ultimile două fiind mai
rar întâlnite. Identificarea acestora se realizează prin reacția de seroneutralizare.
Patogenitatea bacteriei este dată de toxina botulinică care, împreună cu toxina tetanică,
constituie cele mai puternice toxine naturale; 1mg toxină botulinică reprezintă 1200000 DLM pentru
cobai (omoară 1200 tone cobai) iar aproximativ 200g toxină ar fi suficiente pentru suprimarea vieții pe
pământ (Răducănescu H., 1986).
Toxina este sintetizată odată cu multiplicarea bacteriei în condiții de anaerobioză, fiind decelată
în culturi din a 5-a zi și atingând concentrația maximă în zilele 11-13 (Țogoe I., 2006) .
Este o exotoxina de natură proteică, termolabilă (distrusă în 5 minute la 800C sau în 20 minute
la 1000C), inactivată de sol. Lugol, permanganatul de potasiu și alcool.
Similar toxinei tetanice, toxina botulinică acționează la nivelul sinapselor neuromusculare dar
blochează activitatea acetilcolinei și nu colinesteraza, determinând paralizii flasce ale musculaturii,
care diferă ca localizare în funcție de specie.
➢ Izolarea și identificarea toxinei botulinice
Deoarece izolarea bacteriei este dificilă (prelevatele pot să conțină numai toxina nu și bacteria
care, după multiplicarea și eliberarea toxinei în aliment se poate autoliza sau este distrusă de aciditatea
gastică după ingerare), diagnosticul etiologic al botulismului se bazează pe identificarea toxinei în
alimentele suspecte și în produsele patologice.

66
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

În acest scop, din proba de analizat se face un broiaj în ser fiziologic sau în soluție tampon
fosfat cu pH 6, care se păstrează 24 de ore la frigider, la 4°C, apoi se centrifughează la 3000
turații/min., timp de 40 de minute. Supernatantul obținut se filtrează, apoi se inoculează câte 1 ml
intravenos sau intraperitoneal la șoareci. Dacă animalele inoculate mor în câteva ore, pentru a exclude
intervenția altor toxice eventual prezente în aliment, se impune efectuarea unei reacții de
seroneutralizare pe șoarece cu ser antibotulinic polivalent, iar în cazurile în care este necesară și
identificarea tipului de toxină care a produs intoxicația (tratamentul este mai eficient cu antitoxina
specifică serotipului), se procedează la efectuarea seroneutralizării cu seruri antibotulinice de tip
(A,B,C,D,E,F).
Animalele inoculate se țin sub observație 5 zile.
Intoxicația botulinică este confirmată de supraviețuirea șoarecilor inoculați cu supernatant și
ser antibotulinic polivalent și a celor imunizați cu serul antibotulinic corespunzător tipului de toxină.

V. Imunoprofilaxie
Vaccinul antibotulinic anatoxina botulinică (anatoxina botulinică) se administrează numai
lucrătorilor din laboratoarele de profil cu risc foarte ridicat.
Serul hiperimun antibotulinic (antitoxina botulinică) se administrează în scop terapeutic i.m.
sau i.v. , cu rezultate bune în primele stadii ale bolii când poate neutraliza toxinacirculantă, neabsorbită
pe țesuturile asupra cărora acționează.

67
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

68