CURS NR.

2-ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC

FUNCTIILE MATERIALULUI GENETIC
ADN - ul NUCLEAR

ADN MITOCONDRIAL, un singur tip de ADN circular, bicatenar format din

16.569 pb.
 catenă "grea" (H) este mai bogată în guanină iar cealaltă catenă "uşoară" (L) în
citozină.
 mică regiune, bucla D, AND-mt este alcătuit din trei catene, prin sinteza unei piese
scurte adiţionale la catena H, cunoscută ca ADN 7S.
 se caracterizează printr-o mare densitate de secvenţe codante
 Nu contine histone
 nu conţine ADN repetitiv
 genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci de la mamă, fapt
ce determină un tip particular de transmitere maternală a genelor mitocondriale: de
la mamă la toţi copiii săi.
 Genomul mitocondrial este extrem de compact: circa 93% din ADN esre format din
secvenţe codante (absente doar în bucla D), ce formează 37 de gene (28 pe catena H
şi 9 pe catena L): 13 gene codifică polipeptide (constituienţi ai sistemului de
fosforilare oxidativă), 22 gene codifică ARNt şi 2 gene ARNr
 Restul proteinelor mitocondriale sunt codificate de gene nucleare, sintetizate în
citoplasmă şi importate în mitocondrii
 Genele mitocondriale sunt aproape totdeauna contigue iar unele chiar suprapuse;
ele nu conţin introni
 ADN mitocondrial poate suferi mutaţii producând o serie de boli degenerative care
sunt transmise într-un mod specific, de la mamă la toţi descendenţii; bărbaţii bolnavi
nu transmit boala.
 rezultă în mitocondrie un amestec de molecule mutante şi normale, numit
heteroplasmie.
 in diviziune ADNul mitocondrial mutant va fi împărţit la întâmplare între celulele fiice
şi astfel, în timp, procentajul de ADN mit mutant între diferite linii celulare şi ţesuturi
va fi diferit, fenomen numit segregare replicativă.
 Studiul familiilor în care există heteroplasmie cu ADN mitocondrial mutant, relevă că
procentajul ADNmt mutant creşte şi producţia de energie scade treptat, până sub un
prag minimum necesar funcţionării normale a ţesutului, moment în care
manifestările clinice devin evidente

 Fiecare celulă umană conţine câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt) şi de
aceea cantitatea lui totală, raportată la ADN unei celule somatice, poate reprezenta
până la 0.5%. În cursul diviziunilor celulare mitotice, moleculele de ADN mitocondrial
ale celulei iniţiale segregă la întâmplare în celulele fiice

CROMATINA
  Asocierea obligatorie dintre ADN nuclear şi proteine formeaza cromatina. În diferite
stadii ale ciclului celular cromatina prezintă diferite grade de condensare şi se
prezintă sub două tipuri morfo-funcţionale distincte: eucromatina şi
heterocromatina

Deşi inactivă genetic (transcripţional), heterocromatina îndeplineşte cu siguranţă anumite

funcţii celulare:
- heterocromatina stabilizează centromerul şi telomerele cromosomului,
- intervine în desfăşurarea meiozei (în sinapsa cromosomilor omologi)
- şi, probabil, în diferenţierea celulară.
- § Heterocromatină constitutivă se găseşte constant sub formă condensată; nu
conţine gene funcţionale, şi este formată din ADN înalt repetitiv (ADN satelit);
se află în regiunea centromerului, pe braţul lung al cromosomului Y, pe braţele
scurte ale acrocentricilor şi în constricţiile secundare
 - § Heterocromatină facultativă
- heterocromatinizarea ar interveni în reglajul genic
- cromatina sexuală

CORPUSCULUL BARR

La femeie (XX), cromatina sexuală se formează prin inactivarea unuia din

cei doi cromosomi X, care formează un corpuscul de heterocromatină
numit corpuscul Barr sau cromatină X.
La bărbat (XY) cromatina sexuală reprezintă heterocromatina braţului
lung al cromosomului Y, se numeşte corpusculul F sau cromatina Y.

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

Primul nivel de organizare supramoleculară a ADN este filamentul cu
nucleosomi, cu diametrul de 10 nanometri (nm).
Nucleosomul este alcătuit dintr-un complex de ADN şi histone : o
secvenţă de ADN (de 146 p.b.) se înfăşoară (1 tur şi 3/4) în jurul unui
"miez" histonic, cilindric, formată din 8 molecule de histone (câte 2
molecule din H2A, H2B, H3 şi H4).

Al doilea nivel de organizare supramoleculară a cromatinei este fibra de

cromatină de 30 nm. Ea rezultă din spiralizarea în solenoid a filamentului
cu nucleosomi. Această structură (cu pasul de 6 nucleosomi) este
stabilizată de histona H1 şi realizează o compactare de 5:1. Fibra de
cromatină de 30 nm este unitatea fundamentală de organizare a
cromatinei în nucleul interfazic.
Fibra pliată în bucle laterale cu un diametru de 300 nm (grad de
compactare 10:1). Buclele sunt ataşate, prin anumite situsuri de ancorare
la un "schelet" sau matrice proteică (nonhistonică ) , care are o formă
identică cu cea a cromosomului metafazic. ; buclele au deci atât o
semnificaţie structurală cât şi un rol funcţional important in structura
fibrei de ADN, Se consideră că fiecare buclă sau domeniu (ce conţine
câteva gene) ar putea fi o unitate funcţională de transcripţie şi replicare.
Fibra pliată în bucle laterală formează la începutul profazei, printr-o
puternică spiralizare şi condensare (grad compactare 20), cromatida unui
cromosom
La sfârşitul diviziunii, în telofază, se produce despiralizarea/decondensarea cromosomilor

CROMOZOMII UMANI
Cromosomii = organite nucleare care fixează intens coloranţii bazici
("chroma" - culoare; "soma" - corp) şi îndeplinesc două funcţii
importante: 1. transportă materialul genetic de la părinţi (prin gameţi) la
descendenţi, precum şi de la o celulă "mamă" la celulele "fiice" în cursul
multiplicării celulare, asigurând stabilitatea proceselor ereditare;
2.realizează amestecul materialulului ereditar între generaţii succesive,
prin procesele de recombinare ce au loc în meioză, sursa principală de
variabilitate
 Elemente morfologice comune unor cromosomi

1. Sateliţii
2. Constricţiile secundare
3. Situsurile fragile
4. Benzile cromosomiale, elemente specifice fiecărui cromosom

Analiza cromozomior
Analizele citogenetice se pot realiza pe cromosomii metafazici sau prometafazici,
1. Metodele citogenetice de rutină folosesc culturi de limfocite din
sângele periferic
2. Metodele speciale folosesc culturi din : măduvă osoasă; fibroblaste ;
celule fetale
3. Metodele directe (fără cultură) pe ţesuturi ce se divid activ: măduvă
osoasă în leucemii; tumori solide; vilozităţi coriale; spermatocite.
Tehnici de analiză cromosomică
(1) Tehnicile de generaţia I-a (1956). Cromosomii sunt uniform
coloraţi ("solid staining")
(2) Tehnicile de generaţia II-a (1970) sunt tehnici de marcaj cromosomic în benzi
evidenţiază 300-400 benzi pentru un set haploid
(3) Tehnicile de generaţia III-a (1977) sunt tehnici de marcaj de
înaltă rezoluţie identifica 550 sau 850 de benzi, corespunzător
prometafazei sau profazei
(4) Tehnicile de generaţia IV-a (1991=tehnici de citogenetica moleculară;
folosesc "sonde" de ADN monocatenar.
Sondele se fixează (hibridizează) prin complementaritate = hibridizare
fluorescentă in situ, FISH (Fluorescence In Situ Hybridization).

CICLUL CELULAR: - INTERFAZA, MITOZA

REPLICAREA SEMICONSERVATIVA =biosinteza unor noi molecule de ADN identice cu
molecula iniţială – prin replicare semiconservativă – care va conduce la dublarea cantităţii de
ADN
 dubla spirală a ADN se separă în cele două catene componente
(asemenea deschiderii unui fermoar), formând o structură în
formă de Y numită “furcă de replicare”.
 Fiecare catenă serveşte apoi ca matriţă sau tipar pentru
aranjarea complementară (A-T, G-C) şi secvenţială (în direcţia
5’→3’) a deoxiribonucleotidelor activate, care vor fi polimerizate
sub acţiunea ADN polimerazei
 Astfel, o moleculă bicatenară de ADN va forma două molecule
noi, identice între ele precum şi cu molecula “parentală”, fiecare
formată dintr-o catenă "veche" şi o catenă "nou sintetizată";
ADN polimerazele.
 La om au fost identificate cinci tipuri de ADN polimeraze, α, β, γ, δ şi ε;
 în replicarea ADN nuclear sunt implicate ADN polimeraza δ, enzima replicativă
majoră, şi ADN polimeraza α;
 ADN polimeraza γ realizează replicarea ADN mitocondrial

 asimetria furculitei de replicare” în procesul de replicare:

  pe catena matriţă 5’-3’ sinteza catenei noi este continuă şi
rapidă (“leading strand”)
 pe catena 3’®5' sinteza ADN este discontinuă, sub forma unor
secvenţe scurte ( 100-1000 nucleotide) de ADN numite
şi”piese Okazaki” , fiind mult mai lentă (“lagging strand” sau
catenă întârziată)
 ADN helicazele desfac dublu helixul de ADN (folosind energia
furnizată de ATP
 ADN topoisomerazele I şi II despiralizează helixul ADN
 Proteinele de replicare A
 Complexul ADN primază– ADNpolimerază α este implicat în sinteza
amorselor şi replicarea catenei “întârziate” a ADN.
 Datorită lungimii mari a genomului, asocierii cu proteine în
nucleosomi şi organizării în fibre de cromatină, viteza de replicare a
ADN la eucariote este redusă (circa 50 nucleotide pe secundă
comparativ cu 500 nucleotide pe secundă la procariote, unde ADN
este “gol”, neasociat cu proteine).
 ADN trebuie însă să fie replicat integral în circa 8 ore; de aceea
replicarea ADN la eucariote debuteză în mai multe puncte de origine,
ce corespund unor mici unităţi de replicare numite repliconi.
 Replicarea progresează bidirecţional pentru fiecare replicon şi, după
ce se termină, repliconii fuzionează treptat până ce întreagul
cromosom este duplicat. Fiecare cromosom uman are puncte de
origine multiple, situate la 150-200 kb iar întregul genom posedă
circa 30.000 de puncte de origine.

Reglarea replicării ADN - se realizează prin interacţiuni coordonate

între diferite proteine: ciclinele, CDK, inhibitoriii CDK , precum şi anumiţi
factori de transcripţie (care activează punctele de origine ale replicării)
(vezi 5.B.1):
§ Ciclinele D şi E facilitează trecerea G1/S iar ciclina A asigură
progresia prin faza S;
§ CDK4 este o protein kinază activatoare;
§ Factorii de transcripţie: RLF (inclus în complexul de pre-replicare) -
activează punctele de origine a replicării şi împiedică re-replicarea în
cursul aceluiaşi ciclu iar E2F stimulează expresia genelor necesare intrării
în faza S;
§ Inhibitorii kinazelor dependente de cicline sau CKI (proteinele P21,
P27 ş.a.) formează al doilea nivel de reglare al intrării şi progresii celulelor
prin faza S; ei blochează aceste procese (inhibând complexele CDK-cicline
şi PCNA) fie atunci când apar leziuni în ADN fie în cursul diferenţierii
terminale a unui ţesut (însoţită de pierderea capacităţii de replicare şi
diviziune).

- un fenomen caracteristic telomerelor este pierderea inexorabilã a unor secvenţe

de ADN la fiecare replicare (diviziune celularã).
- la capãtul 5' al catenelor de ADN nou sintetizate replicarea este incompletã şi la
fiecare ciclu celular se pierd 25-200 pb.  scurtarea progresivã a telomerelor şi,
dupã un numãr de replicãri, la oprirea replicãrii şi diviziunii (în Go, prin acţiunea
proteinelor P53).
Pierderea secvenţelor telomerice va fi compensatã prin adiţia de novo a secvenţelor
TTAGGG la capătul 3enzima telomerazã

Telomeraza este exprimatã în celulele germinale tinere (din gonade), în blastocist şi cele
mai multe ţesuturi embrio-fetale în sãptãmânile 16-20 ale dezvoltãrii;
Activitatea telomerazei scade progresiv în viaţa fetalã şi dispare postnatal, în aproape
toate celulele somatice normale; excepţie fac celulele stem din mãduva oaselor.
=>scurtarea progresivã a telomerelor (dupã fiecare divizune), odatã cu vârsta.
la o vârstã înaintatã o lungime criticã minimã diviziunea celularã se opreşte  începe
senescenţa.
Pierderea telomerelor genereazã instabilitatea genomica si creşterea frecvenţei
rearanjamentelor cromosomice.
Telomeraza poate fi reactivatã în procesele inflamatorii dar mai ales în celulele
canceroase.
Concluzie = lungimea telomerelor un indicator ce mãsoarã capacitatea proliferativã
restantã a celulei iar scurtarea progresivã a telomerelor (prin replicarea incompletã) -
un biomarker al îmbãtrânirii.
în sindroamele de îmbãtrânire acceleratã - în sindromul Werner, sindromul Hutchinson-
Gilford şi alte stãri progeroide - telomerele sunt mult mai mici decât la persoane normale de
aceeaşi vârstã
Numeroase mecanisme determină ca rata erorilor de împerechere (“mismatch”) apărute
în cursul procesului de replicare să fie extrem de redusă, de circa o încorporare greşită la
109 – 1010 nucleotide
.
Stoichiometria reacţiei de aşezare pe bază de complementaritate permite împerecheri
greşite (în special unele precum G-T) cu o probabilitate de 1 la 10.000.
Repararea :

prin ADN polimeraze care ajută la cresterea fidelităţii replicarii prin

inserţia corectă a bazelor în catena ADN nou sintetizată.
Recunoaşterea erorii se face pe seama distorsiunii pe care o produce în
diametrul constant de 2nm al moleculei de ADN
împerecherea greşită a două nucleotide activitatea de autocorecţie (sau
editare de la proofreading) a ADN polimerazelor; este rezultatul capacităţii
exonucleazice 3' – 5

ARN de transfer

Transcriptia
ARN polimeraza II