O metodă eficientă de fabricare a

anticorpilor monoclonali umani din

celulele B de memorie: neutralizarea
puternică a coronavirusului SARS
Seroterapia pasivă poate conferi protecție imediată împotriva infecției microbiene, dar nu
sunt încă disponibile metode de generare rapidă a anticorpilor monoclonali neutralizanți
pentru om. Am dezvoltat o metodă îmbunătățită pentru transformarea virusului Epstein-Barr
a celulelor B umane. Am folosit această metodă pentru a analiza repertoriul de memorie al
unui pacient care s-a recuperat de la infecția cu sindrom respirator acut sever coronavirus
(SARS-CoV) și pentru a izola anticorpii monoclonali specifici diferitelor proteine virale,
inclusiv 35 de anticorpi cu activitate de neutralizare in vitro variind de la 10 −8 M la 10-11 M. Un
astfel de anticorp conferă protecție in vivoîntr-un model de șoarece de infecție cu SARS-
CoV. Aceste rezultate arată că este posibil să se interogheze repertoriul de memorie al
donatorilor imuni pentru a izola rapid și eficient anticorpii neutralizanți care au fost selectați
în cursul infecției naturale.

Apariția și răspândirea de noi agenți patogeni și riscul de bioterorism

reprezintă amenințări continue pentru sănătatea umană. Vaccinarea poate
conferi protecție activă și susținută, dar dezvoltarea de noi vaccinuri este
un proces lent, iar vaccinurile sunt eficiente numai într-un cadru
preventiv. Practica administrării imunoglobulinelor policlonale din seruri
hiperimune de origine animală sau umană, introdusă de Behring și
Kitasato 1 , a fost folosită pe scară largă atât în condițiile profilactice, cât și
în cele terapeutice 2 . Cu toate acestea, există mai multe probleme asociate
cu utilizarea serurilor policlonale, cum ar fi antigenicitatea proteinelor
heteroloage, dificultatea de a găsi donatori imuni și riscurile legate de
utilizarea produselor sanguine umane.

Anticorpii monoclonali reprezintă o alternativă ideală la serurile

hiperimune 3 . Lucrările timpurii au arătat că anticorpii monoclonali umani
pot fi produși prin imortalizarea celulelor B cu virusul Epstein-Barr
(EBV) 4 , 5 , 6 sau prin fuzionarea celulelor B cu un partener adecvat pentru a
produce hibridomi 7 , 8 . Cu toate acestea, aceste metode au o eficiență foarte
scăzută și, prin urmare, au fost dezvoltate strategii alternative. Acestea
includ (i) umanizarea anticorpilor monoclonali murini prin ingineria
proteinelor 9 , (ii) selecția anticorpilor din bibliotecile de afișare a fagilor de
fragmente de anticorpi umani 10și (iii) imunizarea șoarecilor transgenici
care poartă loci de imunoglobulină umană, urmată de producerea de
anticorpi monoclonali utilizând tehnologia hibridomului 11 . Deși aceste
metode au condus la dezvoltarea mai multor anticorpi monoclonali
terapeutici împotriva citokinelor sau a moleculelor de suprafață, impactul
lor asupra terapiei bolilor infecțioase a fost mai puțin pronunțat 12 . Într-
adevăr, numărul anticorpilor terapeutici împotriva agenților infecțioși este
încă limitat și doar unul este utilizat în prezent, pentru a preveni infecția cu
virusul sincițial respirator (VRS) la nou-născuți 13 .
Rezultate

Răspuns serologic și celular la SARS-CoV

Răspunsul anticorpului unui pacient care s-a recuperat de la infecția cu
SARS-CoV a fost analizat folosind trei teste: (i) ELISA utilizând proteine
virale extrase din SDS, (ii) colorarea celulelor rinichiului de hamster
bebeluș (BHK) transfectate cu ARNm cu vârf SARS-CoV și (iii)
neutralizarea infecției SARS-CoV a celulelor Vero. Serul colectat de la
pacient la diferite momente de timp după infecție a fost pozitiv în toate cele
trei teste (vezi Tabelul 1 suplimentaronline), în timp ce serurile de la
indivizi neinfectați nu au fost reactivi. Anticorpii detectați prin ELISA și
colorarea transfectanților cu vârf au fost mai mari la 2 luni după infecție și
au scăzut la aproximativ o treime cu 8 luni. În schimb, anticorpii
neutralizanți au rămas constante cu un titru de 1/128. Izotipul anticorpilor
detectați de ELISA și testul de legare a vârfurilor a fost doar IgG1.

Pe baza acestor date, ne-am concentrat asupra limfocitelor de

memorie IgG + B. Aceste celule au fost izolate printr-o combinație de sortare
celulară magnetică și activată prin fluorescență și au fost imortalizate cu
EBV în prezența celulelor mononucleare iradiate 6 , 21 și a unei
oligonucleotide CpG (CpG 2006; ref. 22 ) care acționează ca un activator
policlonal al memoriei Celule B 23 . Am constatat că adăugarea de CpG
2006 crește eficiența imortalizării celulelor B de la 1-2% la 30-100%. Au fost
înființate culturi replicate care conțin 10 celule B cu memorie IgG + și
supernatante de cultură au fost analizate pentru prezența anticorpilor
specifici după 2 săptămâni ( Tabelul 1). Fracțiunea culturilor care produc
anticorpi detectați de ELISA a fost foarte mare la 2 luni după infecție
(practic fiecare a doua cultură a obținut rezultate pozitive, în concordanță
cu o precursor de frecvență de ± 1 la 20) și a scăzut cu 6 și 8 luni. Frecvența
culturilor care produc anticorpi care colorează celulele transfectate cu
vârfuri ar putea fi măsurată numai la 4, 6 și 8 luni și a fost mai mică, dar
mai susținută. Majoritatea supernatanților care au colorat celulele
transfectate cu vârfuri au prezentat activitate de neutralizare, dar, în
general, a existat o corelație slabă între colorare și neutralizare (vezi Fig. 1
suplimentară ). Aceste rezultate indică faptul că doar o mică parte din
celulele B de memorie specifice antigenelor SARS-CoV sunt îndreptate
împotriva epitopilor neutralizanți prezenți pe proteina spike.

Izolarea anticorpilor monoclonali împotriva SARS-CoV

Celulele EBV-B din culturi care produc anticorpi cu specificitatea dorită au
fost donate prin limitarea diluării în prezența celulelor mononucleare
iradiate, cu adăugarea de CpG 2006 pentru a crește eficiența donării. Din 56
de încercări, 43 (76%) au condus la izolarea uneia sau mai multor clone care
produc anticorpi cu specificitatea selectată ( Tabelul 2 ). Clonele EBV au
fost stabile, iar anticorpii monoclonali au fost recuperați în supernatantul
de cultură la concentrații de 3-20 μg / ml.

Mai multe dintre clonele care au obținut rezultate pozitive prin ELISA au
produs anticorpi specifici pentru nucleoproteina SARS (NP), în timp ce
altele nu au recunoscut NP, dar au colorat celule infectate cu SARS-
CoV. După cum era de așteptat, niciunul dintre acești anticorpi nu a
prezentat activitate neutralizantă.

Încercările inițiale de a izola anticorpii monoclonali neutralizanți au fost

limitate de utilizarea unui test de neutralizare virală care necesită un
laborator de nivel 4 de biosecuritate. Cu toate acestea, o cultură care
prezintă titru de neutralizare a fost identificată din primul screening și
clonată, iar o clonă rezultată, S3.1, produce un anticorp monoclonal IgG1,
neutralizant κ. Când a fost purificat din supernatantul de cultură și testat
pentru capacitatea sa de a neutraliza SARS-CoV, anticorpul S3.1 a
neutralizat 75 TCID 50 SARS-CoV la o concentrație de ~ 300 ng / ml, o
potență de până la 300 de ori mai mare decât cea a ser convalescent ( Fig.
1a). Mai mult, S3.1 a neutralizat cu aceeași eficiență atât izolatele de
Frankfurt, cât și cele de Urbani (datele nu sunt prezentate) și au decorat
vârfurile SARS-CoV așa cum au fost detectate prin microscopie
imunoelectronică ( Fig. 1b ).

Figura 1: Caracterizarea anticorpului monoclonal S3.1 neutralizant

SARS-CoV.

( a ) Colorarea celulelor BHK transfectate cu mARN de vârf SARS-CoV prin

anticorp S3.1 purificat (cercuri) și cu serul convalescent de 6 luni
(pătrate). Simbolurile umplute indică concentrația anticorpului la care a
fost observată neutralizarea completă. ( b , c ) Colorarea SARS-CoV
detectată prin microscopie imunoelectronică. Stânga sus, control
negativ; trei panouri din dreapta sus, ser convalescent; în partea stângă jos,
supernatantul unei clone de celule B ne-neutralizante; trei panouri din
dreapta jos, anticorp monoclonal S3.1. Bară, 100 nm.

Disponibilitatea ulterioară a transfectanților cu vârf SARS-CoV a furnizat o

metodă eficientă de screening. Aproximativ 50% din anticorpii care
colorează celulele transfectate cu vârf au neutralizat, de asemenea, virusul
omolog. Am izolat 35 de anticorpi monoclonali care au neutralizat SARS-
CoV (a se vedea exemplele din Tabelul 2 și Fig. Suplimentară 1). Unii
transfectanți colorați eficient la concentrații scăzute de imunoglobulină, în
concordanță cu legarea cu aviditate ridicată și au prezentat un titru
neutralizant proporțional cu nivelul de colorare. În schimb, alți anticorpi s-
au colorat slab și numai la concentrații ridicate de imunoglobulină, în
concordanță cu legarea cu aviditate scăzută, dar au arătat o neutralizare
eficientă, chiar și la concentrații de imunoglobulină la care colorarea
vârfurilor a fost greu de detectat. Concentrația finală de anticorpi capabili
să neutralizeze complet infecția SARS-CoV in vitro a variat de la 850 la 1
ng / ml ( Tabelul 2 ).

Aceste rezultate arată că metoda descrisă pentru imortalizarea EBV

îmbunătățită poate produce rapid o baterie de anticorpi monoclonali
umani cu capacitate de neutralizare puternică în domeniul subnanomolar.

Anticorpul S3.1 inhibă infecția cu SARS-CoV la șoareci

Activitatea de neutralizare in vivo a anticorpului S3.1 a fost testată pe un
model de șoarece de infecție acută cu SARS-CoV 24 . Cantități gradate de
anticorp monoclonal S3.1 purificat au fost transferate la șoareci naivi prin
injecție intraperitoneală pentru a determina dacă anticorpul singur ar putea
preveni replicarea SARS-CoV în tractul respirator. Un martor negativ a fost
utilizat un anticorp monoclonal IgG1 uman cu specificitate irelevantă
(M12). După 2 zile, șoarecii au primit o doză de provocare intranazală de
10 4 TCID 50 de SARS-CoV ( Tabelul 3 ). Șoarecii care au primit anticorp
monoclonal S3.1 au fost protejați de replicarea virusului provocator, în
special în tractul respirator inferior. Semnificativ ( P<0,05) restricționarea
replicării virusului în tractul respirator superior a fost observată la șoarecii
care au primit cea mai mare doză de anticorp monoclonal S3.1. Aceste
rezultate arată că transformarea EBV îmbunătățită a celulelor B de memorie
poate duce la izolarea rapidă și eficientă a anticorpilor monoclonali
terapeutici candidați.

Discuţie

În acest studiu am demonstrat o metodă îmbunătățită de imortalizare a

celulelor B prin EBV care implică adăugarea unui activator policlonal de
celule B și am demonstrat că, cu această metodă, este posibil să interogăm
repertoriul de celule B de memorie al unui pacient SARS convalescent și se
izolează cu clone de celule B de înaltă eficiență producând anticorpi
monoclonali neutralizanți. Această procedură este rapidă - poate fi
finalizată în mai puțin de 3 luni - și permite screeningul unui repertoriu
larg de celule B de memorie specifice antigenului pentru cei cu afinitatea și
specificitatea celei mai favorabile.

Eficiența ridicată a imortalizării EBV și clonarea obținută în prezența unui

activator policlonal au fost esențiale în izolarea mai multor anticorpi
monoclonali specifici pentru SARS-CoV. Majoritatea anticorpilor
monoclonali pe care i-am izolat utilizând ELISA au recunoscut NP sau alte
proteine virale, dar nu au neutralizat virusul. Într-adevăr, fracția de celule
B de memorie care a recunoscut proteinele virale denaturate a depășit de 5
până la 10 ori fracțiunea celulelor B care au recunoscut proteina spike
nativă. Mai mult, doar 50% din anticorpii care au colorat celulele
transfectate cu vârf au prezentat activitate neutralizantă, posibil pentru că
au recunoscut epitopi care nu sunt disponibili pe trimerii cu vârf. Aceste
descoperiri indică faptul că cea mai mare parte a răspunsului celulelor B
umane este îndreptată împotriva epitopilor neprotectori.

Figura 2: Capacitatea de legare și neutralizare a anticorpilor monoclonali

specifici pentru vârful SARS-CoV.
Se arată colorarea celulelor BHK transfectate cu mARN-ul SARS-CoV prin diluții
seriale a zece anticorpi monoclonali neutralizanți. Simbolurile indică titrul de
neutralizare: adică diluția anticorpilor adăugată în testul de neutralizare care a dat
neutralizarea virală completă.