LP 3: Prelevarea produselor patologice pentru diagnosticul virusologic.

Cultivarea virusurilor, inclusiv cuantificarea.

Reacţii antigen-anticorp (RIH, ELISA, RFC)

Prelevarea produselor patologice pentru diagnosticul virusologic. Cultivarea virusurilor,

inclusiv cuantificarea

1. Virusuri = particule infecţioase formate dintr-un singur tip de acid nucleic

(ARN/ADN), metabolic inerte, lipsite de orice mecanisme necesare producerii şi stocării
de energie.

Parazite intracelulare absolute

nu cresc
nu se divid
=
Cultivă numai în celule receptive capabile să le replice

Reguli de prelevare a produselor patologice

- Alegerea produsului patologic → în funcţie de sindromul investigat putem examina :
 aspirate (exsudate, secreţii, excrete)
 lichid de spălătura nazala sau/şi faringiena
 materii fecale
 secretii prelevate cu tamponul de pe mucoase şi din leziuni cutanate
 fragmente de ţesuturi
 sânge
- Alegerea metodei de recoltare şi a momentului prelevării
→ probele pentru examene virologice trebuie examinate cât mai precoce în faza
acută a bolii (primele 2-3 zile de boală)
- Asigurarea condiţiilor optime de transport şi conservare:
→ menţinerea viabilităţii virusurilor
→ împiedicarea dezvoltării altor microorganismo (¡Necesitatea mediilor de transport
(la care se adaugă antibiotice)
Refrigerarea probelor (cu unele excepţii)

3. IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA VIRUSURILOR

Sisteme de diagnostic:
- culturi de organ sau culturi de celule;
- cultivarea pe embrioni, în dezvoltare;
- izolarea pe animale de laborator susceptibile;
I. Izolarea virusurilor în culturi de celule
Tipuri de culturi de celule:
obţinute din ţesuturi adulte
Culturi primare  supravieţuiesc 5-6 cicluri de subcultivare

obţinute din ţesuturi embrionare

Linii de celule diploide  au morfologie şi cariotip normale
pot fi subcultivate 40-50 de generaţii
Linii permanente  provin din tumori canceroase
au morfologie alterată
pot fi subcultivate indefinit
Etape:
Pregătirea suspensiei virale
Inocularea filmului celular
Incubarea

Depistarea şi cuantificarea virusului replicat:

a. efectul citopatic – rotunjirea şi desprinderea celulelor de pe suport, apariţia de sinciţii

→ cuantificarea virusurilor prin metoda plajelor  unităţi formatoare de plaje
b. apariţia în supernatant a unor proteine codificate de virus (e.g., hemaglutinine)
c. adsorbţia eritrocitelor pe membrana modificată a celulelor care au replicat virus
d. incluziuni virale = acumulări de virioni sau componente virale în aria celulară de
replicare şi asamblare a unor virusuri (citoplasmă, nucleu) ; ex.: formaţiuni rotunde sau
ovalare, bazofile sau acidofile, IC sau/şi IN.
e. interferenţa virală = replicarea virusurilor care cultivă fără efect citopatic este
depistată indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut
citopatogen.
f. transformarea celulelor normale în celule canceroase printr-un virus oncogen.

II. Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare

Indicată pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusuri.
Etape:
Pe membrana corioalantoidă
Inocularea embrionilor
În cavitatea amniotică (adaptare)
(în vârstă de 6-14 zile)
În cavitatea alantoidă (LA –produs final pentru indentificare)
– pasaje repetate

Incubare la 35 ºC, 3-5 zile

Depistarea virusului replicat:

 moartea embrionului (viabilitatea embrionilor a fost verificată anterior la ovoscop)
 apariţia de pustule pe membrana corioalantoidă (MCA)
 acumularea de virus (hemaglutinine) în lichidul amniotic / alantoidian – RH
(evidenţiere şi titrare de antigen hemaglutinant)
Cuantificarea virusului replicat:
- titrarea antigenului viral (H) în fluidul amniotic/alantoidian
- numărul de pustule formate pe MCA
Identificarea virusului = prin reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIH) sau, in cazul unei
tulpini noi: ME (ex. SARS – un nou coronavirus)
III. Izolarea pe animale de laborator de mici dimensiuni (şoarece alb, hamsteri, etc sau
gazde unice: maimuţe, cimpanzei); rar utilizate (vezi dezavantaje)

Produsul patologic recoltat in funcţie de sindromul clinic, prelucrat, se inoculează prin diferite
metode (de regulă la fel ca poarta naturală de intrare): ic, sc, im, etc
Urmărirea replicării virusului:
  Moartea animalului
 Reproducerea bolii la animal (ex.: paralizii, tremor determinat de enterovirusuri)
 Evidenţierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor ţintă; in
lichidele sau pp recoltate de la animal se evidenţiază prezenţa virusului prin reacţii Ag-Ac,
ME (pentru virusurile nou izolate, cercetare, etc)
Cuantificarea virusului replicat → măsurarea dozei infectante sau letale 50% pentru animale
(DI50 / DL50)= reciproca diluţiei de suspensie virală care determină efectul urmărit
(infecţie/moarte) la 50% din animalele inoculate.

Identificarea = prin reacţii Ag-Ac (RN, RIH)

Dezavantaje:
- Costuri ridicate
- Timp îndelungat pentru rezultatul final
- Infecţii virale latente cu propriile virusuri
- Reactivităţi diferite
- Producerea de Ac care împiedică expresia clinică.

Reacţii antigen-anticorp (RIH, ELISA, RFC)

Antigen  substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină răspuns imun
(imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca rezultat al acestui răspuns
(specificitate).

Anticorp  imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are proprietatea
de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.

Reacţia antigen-anticorp este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt
aproximativ egale).

Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi  rezultat fals negativ.

Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp

 se bazează pe specificitatea cuplării celor două elemente
 Se pot urmări:
- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini izolate în
laborator) prin anticorpul omolog prezent în seruri imune de referinţă
- identificarea unui anticorp necunoscut prin antigenul omolog (diagnostic serologic)
 Se pot obţine:
- relaţii calitative  simpla identificare a unui reactiv
- relaţii cantitative  determinarea titrului reactivului cercetat

Titru  inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia cu cantităţi constante şi
definite ale reactivului omolog.

Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp:

A. Reacţii de precipitare- sensibilitate scăzută

Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil.
B. Reacţii de aglutinare - Reacţii sensibile
Principiu  cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui aglutinat
sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede.
 Ag de referinţă – Ac necunoscut
C. Reacţia de fixare a complementului
Ag necunoscut – Ser imun
Principiu  două complexe antigen-anticorp îşi dispută complementul
Cuplu hemolitic
Hematii de oaie – Ser antihematii

 complexul format în prima reacţie fixează complementul, încât a doua reacţie nu mai are
loc şi hematiile rămân intacte.

reacţie () = lipsa hemolizei

reacţie () = hemoliză

D. Reacţii de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este urmată de
efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe receptorii
celulari, sunt neutralizate.
Clasificare:
 Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului imunoser-virus /
toxină.
 Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante
→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de virusuri
hemaglutinante
hemaglutinine  hematii  hemaglutinare ()
hemaglutinine  Ac omologi  hematii  sedimentare ()

Principiu RIH (reacţia de inhibare a hemaglutinării): unele virusuri posedă capacitatea

de a aglutina hematii (RH). Reacţia este împiedicată de prezenţa Ac prezenţi în serul de
testat (post-infecţie sau post-vaccinare), în prezenţa antigenului omolog.
RIH:
- oferă posibilitatea identificării unui virus hemaglutinant (diagnostic direct);
- permite stabilirea diagnosticului unei viroze, prin evidenţierea anticorpilor specifici
inhibitori ai hemaglutinării în serurile testate (seruri perechi: acut si de
convalescent); dezavantajul legat de timp (scop epidemiologic si mai putinpentru
pacienti)
- permite aprecierea eficientei vaccinarii si studierea Ac-lor anamnestici, dupa
trecerea prin infectie, pentru populatii largi (serograme) – seroarheologie (istoria
circulatiei virusurilor gripale, de-a lungul timpul, prin determinarea Ac-lor in seruri
obtinute de la varstnici)
Necesar:
- seruri pacient (serul I şi serul II, recoltate la 10-14 zile interval);
- antigene hemaglutinante;
- hematii.
Tehnică de lucru (pentru titrarea antigenelor prin RH):
- se realizeaza diluţii duble succesive din serul imun specific, cu titru cunoscut, în
soluţie tampon (0.25 ml);
 - se adaugă virusul la titrul cunoscut (intentionam sa reproducem titrul) (0.25 ml); nr
de untitati hemaglutinante cu care se va lucra: se imparte titrul obtinut la 8 (se
lucreaza cu 8U antigenice)
- se adaugă suspensia de hematii (câte 0.25 ml).
RIH:
- dilutii duble succesive de ser (dupa tratarea serului pentru indepartarea inhibitorilor
nespecifici, dilutia serului devine 1/7 – un volum ser, 3 volume periodat de potasiu,
3 volume glicerol = 1/7)
- un volum antigen (la titru cunoscut)
- un volum hematii

Martori RIH:
 martor hematii;
 martor antigen (titrat anterior reacţiei prin RH);
 martori seruri de referinţă.

Interpretare: - reacţie pozitivă (sedimentarea hematiilor -buton);

- reacţie negativă (hemaglutinare).

E. Reacţii cu anticorpi marcaţi:

 Imunofluorescenţa
 Reacţiile imunoenzimatice (EIA)
Principiu: anticorpul poate fi marcat cu o enzimă; după formarea complexului cu antigenul
şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activităţii enzimatice, se adaugă
substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare dezvoltată este apreciată vizual sau
spectrofotometric.
- ELISA
a. pentru detectarea antigenului – direct

Ac specific adsorbit pe suport insolubil  proba în care urmărim Ag  Ac marcat cu enzimă

b. pentru detectarea anticorpului – indirect

Ag adsorbit pe suport insolubil  ser în care urmărim Ac anti-Ag  Ac anti-Ig marcat cu enzimă

c. competitiv

- Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei cu HIV