Facultatea de Antreprenoriat Ingineria si Managentul Afacerilor

Biotehnologii
- Insulina -

Studenti:
 Neagu Lavinia
 Nicula Cristina
 Scortanu Vlad
 Sisu Veronica
 Soare Cristina
 Spataru Simina
 Stoica Alin
 Zahiu Beatrice
Cuprins:
1. Insulina – definitie
2. Istoric
3. Structura insulinei
4. Metabolismul si functiile
5. Reglarea secretiei
6. Sinteza
7. Cum se obtine insulina ?
8. Formulari farmaceutice ale insulinei
9. Efecte nedorite ale farmacoterapiei cu insulina
10. Bibliografie
 Insulina
- o proteina mica cu efecte mari -

1. Definitie

Insulina este un hormon, secretat de insulele lui Langerhans, ce

participa la metabolismul glucidelor. Insulina este cel mai important
hormon în metabolismul glucidelor. Insulina contribuie în primul rând
la micsorarea concentratiei glucozei în sânge. Aceasta mareste
permeabilitatea membranei celulare pentru glucoza. Insulina are o
actiunea antagonista glucagonului.

2. Putina istorie

Insulina este considerata primul medicament

important, rezultat al cercetarilor medicale de la
începutul secolului al XX-lea.

► înainte de anul 1922, diabetul era o boala

mortala, pentru care singurul tratament
cunoscut era înfometarea bolnavului, furni-
 zându-i exact atâtea calorii cât avea nevoie pentru a
supravietui,inca cativa ani.

► în anul 1921, un tânar medic, numit

Frederick Banting, asistat de un student,
Charles Best, a lucrat gratuit în
laboratoarele Profesorului John
MacLeod de la universitatea din
Toronto. Primele lor lucrari, legate de
reglarea glicemiei la câinii adusi în
starea de a fi diabetici, au condus la
obtinerea fondurilor pentru continuarea
cercetarilor. Un profesor de biochimie,
James Collip, li s-a alaturat, pentru a rafina si apoi produce un
extract purificat al pancreasului care parea capabil sa scada
glicemia.

3. Structura
Imagine computerizata a moleculei de insulina

Insulina este un hormon, ce este compus din 2 lanturi peptidice,

formate din 20 - 30 aminoacizi, unite între ele prin 2 legaturi
bisulfidice. Moleculele de insulina sunt asemanatoare la mamifere,
astfel încât multi bolnavi de diabet sunt tratati cu insulina extrasa de la
porci. Aceste molecule tind sa formeze dimeri în solutie.

Insulina este o proteina mica cu masa de 5734 daltoni si cuprinde 51

resturi aminioacidice. Este alcatuita din doua lanturi, un lant A (cu 21
resturi aminoacidice) si unul B (cu 30 resturi aminoacidice) legate prin
doua punti disulfurice (A7-B7 si A20-B19); o a treia legatura
disulfurica leaga restul Cys-A6 cu Cys-A11.Insulinele altor specii
difera de cea umana. Diferenta cea mai mica exista între insulina
umana si cea de porc, acesta deosebindu-se numai prin natura
restului C-terminal al lantului B. La om este treonina, la porc alanina.
Insulina de porc din care s-a detasat treonina terminala este practic
lipsita de antigenicitate si este folosita în tratamentul diabetului. Prin
tehnologia ADN recombinant s-a obtinut insulina umana pentru uz
terapeutic. Insulina formeaza cu ionii Zn2+ agregate, dimeri, tetrameri,
hexameri. În pancreas insulina se afla sub forma de hexameri. Forma
activa circulanta este probabil monomerul.

4. Metabolism

Timpul de înjumatatire al insulinei este de 3-5 minute.Insulina este

inactivata în principal în ficat, prin doua mecanisme:

a) desfacerea legaturilor disulfidice interlant printr-o reactie de

schimb cu glutation, catalizata de glutation-insulin
transhidrogenaza.Lanturile A si B sunt degradate rapid prin proteoliza;

b) o proteaza specifica ataca molecula de insulina ce atare.

Functiile insulinei

► Actiune asupra glucozei din sânge

Insulina este (împreuna cu somatos-tatina), principalul hormon

hipogli-cemiant, actiunea sa scazând nivelul glucozei din sânge, sau
glicemia. Glicemia, care, pe stomacul gol, este situata între 0,9 si 1,1
g/l la un subiect sanatos, creste, în mod normal, pâna la 1,60 g/l,
dupa fiecare masa sau consum de bauturi îndulcite. Aceasta crestere
stimuleaza eliberarea de insulina în sânge de catre pancreas, dar
excesul de acizi grasi sau de aminoacizi are acelasi efect stimulant.
Insulina eliberata actioneaza asupra celulelor de stocare (celulele
adipoase, celulele musculare) si asupra leucocitelor, unde faciliteaza
intrarea glucozei. Dar insulina nu accelereaza intrarea în ficat, creier
sau rinichi, care sunt permanent aprovizionati din abundenta cu
glucoza. în plus, insulina blocheaza transformarea în glucoza a
glicogenului, prezent în ficat si în muschi, precum si transformarea în
glucoza a aminoacizilor si a glicerolului continut în trigliceride. Astfel,
ea împiedica cresterea spontana a glicemiei cu producerea endogena
de glucoza.
 ► Actiunea în celula

Atunci când insulina intra în contact cu celulele de stocare, ea se

leaga de un receptor specific si traverseaza membrana celulara.
Acolo, ea stimuleaza enzime, care:

► accelereaza combustia glucozei, pentru a produce energie sub

forma de ATP.

► unesc moleculele de glucoza, pentru a forma glicogen.

►transforma glucoza în acizi grasi si glicerol (celule adipoase).

De asemenea, ea induce captarea ami-noacizilor si sinteza

proteinelor în muschi: astfel, ea este necesara cresterii si repararii
tesuturilor. Pe scurt, insulina favorizeaza producerea de energie si
orienteaza surplusul spre formele de stocare (grasimi) sau sinteza
proteinelor.

► Reglarea glicemiei

Glicemia nu este fixa, ci este rezultatul unui echilibru instabil între

actiunea insulinei, mai ales dupa mese, si actiunea glu-cagonului, mai
ales pe stomacul gol sau dupa un efort prelungit. Glucagonul este un
alt hormon secretat de pancreas. Aceasta protida mica de 29 de
aminoacizi determina transformarea glicogenului sau a aminoaci-
zilorîn glucoza, în ficat, de unde se varsa în sânge. Astfel, el are o
actiune practic inversa celei a insulinei, iar actiunile lor asociate, în
functie de nivelul glicemiei la un anumit moment, mentin glicemia la
un nivel compatibil cu buna functionare a organismului. Un exces de
insulina poate fi cauzat de o injectie care nu a fost bine dozata sau de
o eroare dietetica (o masa sarita, un efort prea mare dupa o injectie,
în cazul diabeticilor), dar si, mai rar, de o tumoare secretanta de
insulina a pancreasului numita insulinom. Ea se manifesta imediat
prin indispozitie sau coma hipo-glicemica (în cazurile extreme), care
dispare încet sub efectul glucagonului natural si mai repede dupa
consumarea de glucoza sau dupa injectarea de glucagon (prezent în
trusa de urgenta a oricarei persoane care sufera de diabet de tip 1).
 Diabetul

► Tip 1

Responsabila pentru acest tip de diabet este o carenta aproape

completa de insulina. Ea debuteaza la copii sau la adultii tineri, atunci
când celulele beta sunt distruse de proprii anticorpi ai organismului. O
carenta partiala de insulina se observa si în cazul diabetului de tip 2
evoluat, atunci când celulele beta sunt epuizate dupa o perioada de
câtiva ani de lupta împotriva unei hiperglicemii permanente sau a
antidiabeticelor de tipul sulfamidelor. Injectia de insulina, în doze
corecte, este singurul tratament la aceste carente.

► Tip 2

în cazul acestui tip de diabet, se observa un exces de insulina, timp

de mai multi ani, dar ea este ineficienta în tesuturile adipoase sau
musculare. Se constata acest hiperinsulinism atunci când glicemia pe
stomacul gol este situata între 1,10 si 1,26 g/l (diabet care nu se
manifesta) sau în primii ani ai unui diabet de tip 2 care se manifesta.
Medicii vorbesc despre „rezistenta la insulina" sau despre „intoleranta
la glucoza". Injectarea de insulina nu are nici un efect benefic: este
necesara modificarea tesuturilor receptoare prin pierderea în greutate
si activitate fizica.

5. Reglarea secretiei

Glicemia este factorul reglator principal al secretiei de insulina.O

valoare a glicemiei (80-100 mg/dl) este suficienta pentru a declansa
secretia de insulina.

Eliberarea insulinei creste odata cu glicemia, raspunsul maxim

obtinându-se la 300-500 mg/dl.

În afara de glucoza multi alti factori influenteaza secretia de insulina:

- alte monozaharide usor metabolizabile ca fructoza, manoza au

efect stimulator;

- aminoacizii, în special arginina, lizina si leucina, stimuleaza

puternic secretia de insulina;
 - agonistii α-adrenergici inhiba secretia de insulina; adrenalina prin
α-receptie este un inhibitor fiziologic al secretiei de insulina;

- somatostatina, produsa de celulele D din pancreas, prin actiune

paracrina, inhiba secretia de insulina;

- GIP (Gastric Inhibitory Polypeptide), polipeptid eliberat de

mucoasa duodenala si jejunala la ingestia de glucoza, stimuleaza
eliberarea de insulina; actiunea GIP explica constatarea mai veche ca
glucoza administrata oral este un secretagog mai puternic pentru
insulina decât glucoza administrata intravenos.

6. Sinteza

Insulina este sintetizata în insulele lui Langerhans, pancreas, de catre

celulele-beta. Sinteza acesteia cuprinde câteva etape:

1. dupa gena insulinei, aflata în cromozomul al 11-lea, se

formeaza ARn-ul corespunzator;

2. dupa mARN-ul dat (ARN mesager), este translat un lant

peptidic, care introdus în reticulul endoplasmatic, se transforma în
proinsulina;

3. dupa expunerea proinsulinei la unele endopeptidaze, apare

forma matura a insulinei.

Insulina, ca si alte proteine secretorii, este sintetizata sub forma unui

precursor, pre-pro-insulina.Segmentul N-terminal, pre, cu 23
aminoacizi, peptidul semnal hidrofob are rolul de a conduce
polipeptidul nascând în cisternele reticulului endoplasmatic unde este
îndepartat. Proinsulina, polipeptid cu 86 resturi aminoacidice,
cuprinde lanturile A si B ale moleculei virtuale de insulina legate prin
punti disulfurice.

Capatul N-terminal al lantului A este legat de capatul C-terminal al

lantului B prin intermediul unui peptid de legatura.

Proinsulina este transportata din reticulul endoplasmatic în aparatul

Golgi unde este transformata în insulina. Prelucrarea proinsulinei are
loc sub actiunea unei endopeptidaze care rupe doua legaturi peptidice
flancate de resturi aminoacidice bazice.Rezulta trei fragmente asupra
carora actioneaza o carboxipeptidaza care detaseaza resturile de
arginina si lizina de la capatul C-terminal al lantului B (din insulina) si
la peptidului de legatura. Complexitatea structurala a proinsulinei este
necesara stabilirii corecte a puntilor disulfurice din insulina. Lanturile A
si B separate nu se pot organiza spontan în molecula activa a
insulinei.

Insulina, peptidul C si o cantitate mica de proinsulina sunt încorporate

în granule secretorii si sunt eliberate împreuna în circulatie.

7. Obtinerea insulinei

Din 60 de milioane de diabetici, circa 4 milioane necesita un tratament

cu insulina.

În 1916, E.Sharpy-Schafer a descoperit ca insulina este secretata de

celule care alcatuiesc insulele Langherhans din pancreas, ceea ce l-a
determinat sa numeasca hormonul insulina. În 1921, F.Banting si
H.Best, la Toronto, au izolat din pancreasul de câine hormonul
insulina, demonstrând actiunea lui antidiabetica. În 1923, firma
farmaceutica americana “Eli Lilly” pune deja în vânzare prima insulina
animala (în prezent, pentru a obtine circa 100 grame de insulina, este
nevoie de 800 kg de pancreas de bou (greutatea medie a unui
pancreas de bou este de 200-250 grame)).

Insulina umana este alcatuita din doua catene polipeptidice A si B,

compuse respectiv din 21 si 30 de aminoacizi, a caror secventa a fost
stabilita în 1955 de F.Sanger.

În perioada 1963-1965, trei grupe de cercetatori (americani, germani

si chinezi) au reusit sinteza artificiala a insulinei prin intermediul a 170
de reactii chimice, lucru ce facea imposibila producerea insulinei pe
cale industriala.

Noile tehnologii industriale de obtinere a insulinei umane au fost

posibile odata cu extragerea genei insulinei (W.Gillbert si colaboratorii
sai, 1980) si crearea moleculelor recombinate de ADN în baza
plasmidelor .
 Schema obtinerii insulinei umane.

Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în colibacili

(Escherichia coli), unde are loc realizarea informatiei genetice
codificate în molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice
bacteriei, se sintetizeaza si insulina. Pentru a proteja insulina umana
(ea nu este proprie colibacililor si este distrusa de enzimele
bacteriene), în molecula recombinata de ADN se încadreaza, pe
lânga gena insulinei, si o gena reglatoare care codifica o proteina
specifica colibacililor (de exemplu galactozidaza). Ca rezultat al
manifestarii informatiei genetice a moleculei recombinate de ADN, se
obtine o catena polipeptidica hibrida, din care mai apoi se separa
insulina.

Datorita utilizarii tehnologiei ADN-ului recombinat, se obtin

aproximativ 200 grame de insulina de pe 1 m3 de mediu de cultura,
adica tot atâta cât se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas
de bou sau porc.

Probele clinice efectuate cu insulina umana, produsa prin tehnici de

inginerie genica, au demonstrat ca ea nu are efecte secundare si ca
poate fi comercializata, adica folosita la tratarea bolnavilor de diabet
(din 1982 în SUA, din 1983 în Marea Britanie).

Un hormon de mare importanta biologica este hormonul de crestere

sau somatotropina (HGH – Human Growth Hormone), secretat de
lobul anterior al hipofizei. Molecula hormonului cuprinde 191 de
aminoacizi. Absenta lui provoaca nanismul hipofizar, ce are o
frecventa de 7-100 per milion de persoane. Tratamentul cu acest
hormon se realizeaza începând cu vârsta de 4-5 ani si pâna la
puberitate, în doze de minimum 6 mg pe saptamâna per persoana.
Somatrotopina este un hormon cu o specificatie înalta si nu poate fi
utilizat de la animale. Din hipofiza unui cadavru se extrag doar 4-6 mg
de hormon, heterogen si impurificat. Iata de ce, producerea acestui
hormon prin tehnici de inginerie genica prezinta un interes deosebit.

Sinteza acestui hormon pe cale artificiala s-a început cu producerea

de ADNc (ADN-ul copie) cu ajutorul revers-transcriptazei, având ca
matrice ARNm din hipofize (transcriptie inversa). Acesta a fost clonat,
apoi taiat cu enzime de restrictie pentru obtinerea secventei
nucleotidice corespunzatoare somatotropinei, cu exceptia
fragmentului ce determina primii 23 de aminoacizi. Fragmentul în
cauza era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele
doua segmente unite, la ele se adauga segmente reglatoare si pe
baza plasmidelor se obtine plasmidiul recombinat cu gena HGH (a
somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat,
sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultura se obtine 2,0-
2,5 mg somatotropina).
În prezent, cu ajutorul bacteriilor recombinate sunt obtinuti si alti
hormoni, de exemplu, thimopoietina ce contine 49 de aminoacizi si
este secretata de timus.

În ce priveste hormonii cu molecule mai mici (sub 20 de aminoacizi),

este preferabila sinteza lor pe cale chimica.

8. Formulari farmaceutice ale insulinei

In terapeutica, insulina se masoara in unitati. O unitate de insulina se

defineste ca fiind cantitatea necesara pentru a scadea glicemia la
iepure, pe nemancate, la 45 mg/100mL. Pentru preparatele purificate,
unitatea se raporteaza la greutate. 1 mg de insulina standard contine
24-28 de unitati. Preparatele utilizate in terapeutica au un continut de
40 sau 100 unitati/mL.

Formularea farmaceutica a insulinei a prezentat probleme la inceput,

din cauza instabilitatii sub forma de solutie la conservare, pe o
perioada mai mare de timp. Molecula de insulina are o sarcina
negativa la pH neutru, iar formulata ca solutie cu pH acid devine
instabila in timp, din cauza unui proces de dezamidare, cu pierderea
activitatii biologice. Deoarece in celulele pancreatice este stocata sub
forma de hexameri cu zinc, s-a recurs la stabilizarea chimica a
acesteia prin adaugarea a aproximativ 0,4% zinc si a conservantilor
fenolici.

Formularile normale (simple) neutre, numite INSULINA REGULAR,

prezinta o activitate maxima a insulinei dupa 2-3 ore, cu o durata
maxima de 6-8 ore.

INSULINA LISPRO, obtinuta prin schimbarea pozitiilor lizinei si a

prolinei din structura acesteia, prezinta un profil mai rapid de actiune,
avand activitate maxima dupa aproximativ o ora. Au fost concepute si
formulari solubile care pot fi utilizate in pompe externe sau implantate.

O alta formulare farmaceutica a insulinei este insulina cu actiune

intermediara, INSULINA NPH sau INSULINA LENTE. Insulina NPH
se gaseste co-cristalizata cu protamina, proteina cu caracter puternic
bazic. Prezinta o stare latenta de 1-2 ore si o durata de actiune de 18-
24 de ore, variind in functie de doza, locul injectarii si temperatura.
Insulina NPH poate fi amestecata ex tempore cu INSULINA
REGULAR in raport de 70/30 sau 50/50, oferind un mai bun control al
glicemiei.

INSULINA ULTRALENTE este singura insulina cu actiune prelungita,

avand o durata de actiune de pana la 28 de ore. Insulina recombinata
se gaseste pe piata farmaceutica in flacoane de 10 mL, cu o
concentratie standard de 100 unitati/mL.

9. Efecte nedorite ale farmacoterapiei cu insulina

Uneori, efectul insulinei poate scadea sau chiar disparea, fenomen
numit insulino-rezistenta. Acest lucru este provocat de aparitia
anticorpilor specifici, mai ales la insulina bovina insuficient
purificata. Substantele care se pot regasi ca impuritati sunt fie
produsi secundari rezultati pe parcursul procesului de obtinere
(dezamidoinsulina), fie compusi intermediari sau agregate de
insulina sau proinsulina. Un preparat purificat este considerat cel
care nu contine mai mult de 10 ppm de proinsulina.
Ca orice medicament, insulina poate provoca reactii adverse. O
reactie frecvent intalnita este hipoglicemia. Aceasta se poate
instala brusc, cu transpiratii reci, paloare si hipotermie, dureri de
cap, tahicardie, slabiciune, stare de confuzie. Din aceasta pricina,
trebuie informat medicul curant de aparitia starilor hipoglicemice,
deoarece acestea pot provoca leziuni cerebrale si chiar moarte. In
cazul aparitiei unei hipoglicemii severe, pacientul isi va reveni mai
repede din starea de inconstienta daca i se administreaza o injectie
cu glucagon, precedata de o gustare dulce, cat mai repede posibil
dupa recapatarea cunostintei.
Administrarea insulinei concomitent cu alte medicamente poate
necesita o ajustare a dozei. Este necesara informarea medicului
diabetolog de orice alta medicatie care implica antidiabetice orale,
inhibitori MAO, inhibitori ai enzimei de conversie, glucocorticoizi,
beta-adrenergice, hormoni tiroidieni si chiar aspirina.
10. Bibliografie:
 Cristea A. N., Tratat de farmacologie, Editura Medicala,
2008;
 Note de curs, Biotehnologii si industrie farmaceutica;
 Chang X., Jorgensen A. M., Bardrum P., Led J. J. (August
1997), Solution structures of the R6 human insulin hexamer,
Biochemistry 36(31).
 www.rxlist.com/humalog-drug.htm;
 www.medical-dictionary.thefreedictionary.com
 http://www.medscape.com/pharmacists