Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mureș
LP6 MD

Diagnosticul de laborator al infecțiilor cauzate de enterobacterii

Enterobacterii condiționat patogene

 Escherichia coli, Klebsiella

Enterobacterii patogene

 Tulpini de E. coli patogene pe tract intestinal: EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, EAEC
 Shigella, Salmonella, Proteus, Yersinia

1. Produse patologice
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
Klebsiella rhinoscleomatis
Klebsiella ozenae
 Materii fecale  Spută
 Bilă  Secreții nazale
 Alimente  Materii fecale
 Vărsături  Bilă
 Urină  Vărsături
 Puroi  Alimente
 LCR  Urină
 Sânge  Puroi
 LCR
 Sânge
Shigella dysenteriae Salmonella enterica subsp. Proteus mirabilis Yersinia
Shigella flexneri - enterica Proteus vulgaris enterocolitica
Shigella boydii - typhi
Shigella sonnei - paratyphi
 Materii fecale de la  Materii fecale  Urină  Materii fecale
purtători o emise spontan  Secreție din plăgi  Conținut
o După administrarea o pe sondă postoperatorii și apendicular
unui purgativ Nelaton, de la arsuri  Ganglioni
 Bilă purtători  Puroi din infecții mezenterici
 Materii fecale  Vărsături ORL (sinuzite, otite)  Lichid sinovial
 Vărsături  Alimente  LCR  Sânge
 Alimente  Sânge  Sânge
o  În febra tifoidă, de la  Materii fecale
bolnavi:
o În săpt. 1 – sânge
o În săpt. 2 – materii
fecale, bilă, suc
duodenal
o În săpt. 3 – materii
fecale, sânge
pentru
serodiagnostic
În săpt. 4 - sânge pentru
serodiagnostic
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

2. Examen direct

 Nu se efectuează examen direct din materii fecale (excepție – vizualizarea elementelor

celulare: hematii, leucocite; NU se urmărește morfologia bacteriilor)
 se efectuează doar din produse patologice normal sterile
o urină, LCR, sânge din hemocultură
o colorația Gram: bacili Gram negativi
 Klebsiella – cocobacili, dispuși predominant în diplo
 Proteus – bacili polimorfi

3. Izolare

 Din materii fecale

o Însămânțare primară prin epuizare pe medii selective și diferențiale pentru
enterobacterii:
 MacConkey, Leifson sau SS
o Din alte produse patologice
 Leifson, geloză lactozată
 ! posibilitate de invazie a mediilor neselective în cazul Proteus spp.
 Izolarea coloniilor suspecte
o geloză lactozată
o geloză sânge
o bulion
 incubarea mediilor
o 37°C, aerobioză
o 24 ore

4. Identificare

a. Caractere morfo-tinctoriale

 Preparat nativ
o Bacili mobili: E. coli, Salmonella, Proteus
o Bacili imobili: Klebsiella, Shigella
 Colorație Gram:
o Bacili Gram negativi, dispuși neregulat, nesporulați
o Bacili scurți Gram negativi, dispuși în diplo (Klebsiella)
o Bacili polimorfi, de dimensiuni variabile, pot fi prezente forme filamentoase
(Proteus)
 Colorație negativă: evidențiază capsula pentru Klebsiella spp.

b. Caractere de cultură
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

 Colonii tip „S” pentru majoritatea enterobacteriilor, cu aspect aproximativ identic

o Alb-cenușii pe geloză sânge
o Beta-hemolitice pentru anumite tulpini de E. coli
o Pe mediile lactozate
 Colonii lactozo-pozitive pentru E. coli și Klebsiella
 Colonii lactozo-negative pentru Shigella, Salmonella, Yersinia, Proteus (pe
medii selective, cu săruri biliare)
o Pe medii cu săruri de fier
 Colonii „în ochi de pisică” pentru bacteriile producătoare de H 2S (Salmonella,
Proteus)
 Colonii tip „M” pentru tulpinile încapsulate (Klebsiella și unele tulpini de E. coli)
 Fenomen de cățărare
o pentru Proteus, pe medii neselective, fără săruri biliare
o fenomenul Dienes
 dacă tulpinile provin de la aceeași specie și sunt însămânțate pe aceeași
placă, prin creștere se suprapun
 dacă tulpinile sunt diferite, între ele rămâne o zonă de demarcație

c. Caractere biochimice

 Sunt singurele care asigura în mod cert diferențierea enterobacteriilor

 Se pot studia pe
o mediile diferențiale clasice (TSI, SIM, uree, Simmons)
o teste de identificare tip API
o sisteme automate, prin carduri de reacție Vitek, Microscan, etc.

TSI SIM Uree Simmons

Glucoză Lactoză Zaharoză H2S Indol Mobilitate Urează Citrat
E. coli + + + - + + - -
Klebsiella + + + - + - + +
-
Shigella + - - - + (S. flexneri) - - -
-
Salmonella + - - + - + - +
Proteus + - - + + (P. vulgaris) + + +
-
Yersinia + - + - - + (32°C) + -
- (37°C)

d. Identificare antigenică

 prin reacții de aglutinare pe lamă, cu seruri polivalente, apoi monovalente pentru:

o E. coli enteropatogen EPEC – numai la copii sub 2 ani
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

o E. coli enteroinvaziv EIEC

o E. coli enterohemoragic EHEC, serotipul O157H7
o Klebsiella - reacția de umflare a capsulei: determină prezența antigenului capsular
o Shigella, Salmonella – stabilirea serogrupei și serotipului
o Yersinia – serogrup O3 și O9

e. Determinarea patogenității

 Inoculare la animale de laborator

o Klebsiella pneumoniae – inocularea intraperitoneală la șoareci produce septicemie
o Escherichia coli, Shigella - testul keratoconjunctivitei la cobai (Sereny)

f. Diagnostic serologic

 în febra tifoidă: detectarea și titrarea anticorpilor față de Ag O și H ale S. typhi și S. paratyphi

(reacția Widal), sau detectarea IgM și IgG prin metode moderne

5. Antibiograma

 Este obligatorie pentru toate enterobacteriile

o Metodă difuzimetrică
o E-teste
o Microdiluții
o Sistem automat
 Posibilitate de rezistență extinsă prin producere de beta-lactamaze cu spectru extins (BLSE)
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

Diagnosticul de laborator al holerei

Vibrio cholerae

1. produs patologic
 este considerat potențial periculos și letal – măsuri de protecția muncii riguros respectate
o materii fecale, lichid de vărsătură
o probe de apă, alimente

2. Examen direct
 macroscopic: scaun cu conținut fecaloid minim, aspect riziform
 microscopic
o colorația Gram – bacil Gram negativ, subțire, încurbat, sub formă de virgulă, prezintă
un cil la un capăt, necapsulat, nesporulat
o examen microscopic pe fond întunecat
 germeni foarte mobili
 testul de imobilizare cu ser imun anti O1, anti O139. Imobilizarea germenilor
din preparat ridică suspiciunea prezenței vibrionului în preparat. Diagnosticul
definitiv se confirmă în laboratoare de referință.

3. Izolare
 pe apă peptonată alcalină
 pe medii selective specifice BSA (bile, salt, agar), TCBS (tiosulfat, citrat, bilă, sucroză)
 pe geloză sânge

4. Identificare
a. caractere morfo-tinctoriale
 bacil Gram negativ, subțire, încurbat, sub formă de virgulă
 colorație pentru cili: prezintă un cil la un capăt
 necapsulat, nesporulat

b. caractere de cultură
 în mediu lichid crește foarte rapid și formează un văl la suprafață, mediul rămâne clar
 pe geloză sânge – colonii de tip „S”, mici, mate, alb-cenușii, nehemolitice

c. caractere biochimice
 oxidază pozitiv
 pe mediul SIM: mobilitate pozitiv, indol pozitiv
 urează negativ

d. identificare antigenică
 identificarea antigenului O (O1, O139)
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

Diagnosticul de laborator în infecții cu Helicobacter

H. pylori

1. Produse patologice
 biopsie gastrică
 sânge pentru serologie

2. Diagnostic
Metode invazive de recoltare
a. gastroscopie cu recoltarea mai multor fragmente de mucoasă gastrică
 Conservarea probelor recoltate se face la 4°C pentru maximum 4 ore sau se folosesc medii de
transport în care proba poate fi menținută maximum 24 de ore.
 Din fragmentul recoltat se efectuează
o testul ureazei
 plasarea fragmentului bioptic într-un mediu cu uree și roșu fenol.
 ionii de amoniu rezultați din hidroliza ureei alcalinizează mediul și determină
virarea culorii indicatorului
 se citește la 30 minute, o oră, 3 ore și 24 de ore
 specificitatea testului este de aproape 100% la 4 ore
o microscopie directă
 frotiu efectuat din fragmentul bioptic colorat Gram sau secțiune histologică
colorată Giemsa
 bacterii Gram negative
 încurbate sau spiralate
 prezintă 4-6 flageli localizați la un pol
 ! atenție la Campylobacter cu morfologie asemănătoare
o Imunofluorescență directă
o cultivarea bacteriei
 Fragmentul bioptic recoltat se omogenizează cu ser fiziologic
 Două picături din omogenizat se însămânțează pe medii de cultură
suplimentate cu sânge 10% și care conțin agenți antimicrobieni pentru a
preveni contaminarea fungică și bacteriană.
 incubare la 37°C, în microaerofilie (CO2 10%, N 85%, O2 5%), peste 7 zile, cu
prima citire la 3 zile.
 H. pylori produce colonii de tip „S”, translucide, de 1-2 mm
 se continuă identificarea prin studierea caracterelor biochimice
 oxidazo-pozitive
 produce urează în cantități mari
 cultivarea permite testarea sensibilității la antibiotice
 nu există metodă standardizată
 determinarea CMI utilizând E-test sau metoda microdiluției
b. diagnosticul serologic
 evidențiază prezența anticorpilor specifici, de tip IgG
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

 se folosește testul ELISA, latexaglutinare

 specificitatea este de 85-95%, și sensibilitatea de 80-95%

Metodele neinvazive
a. testul respirator cu uree marcată
 administrarea unei soluții de uree marcată cu 13C (neradioactiv) sau 14C (radioactiv)
 sub acțiunea ureazei se va elibera CO2 marcat, care se va absorbi în circulație
 CO2 va fi eliminat prin plămâni, putând fi astfel detectat și cuantificat în aerul expirat
 Sensibilitatea testului variază între 90-98%, iar specificitatea ajunge la 99%
 Este indicat ca metodă de apreciere a eficacității tratamentului

b. alte metode
 Detectarea antigenelor H. pylori în materiile fecale
o test rapid imunocromatografic folosind anticorpi monoclonali
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureș
LP6 MD

Diagnosticul de laborator în infecții cu Campylobacter

C. jejuni

C. coli

1. Produse patologic
 Materii fecale
 Lichid de vărsătură
 Probe de alimente

2. Examen direct
 În preparat nativ: bacterii spiralate mobile

3. Izolare
 Pe medii selective cu sânge, pe membrane filtrante
 În condiții de microaerofilie, la 42°C (nu crește sub 37°C)
 Izolare pe medii selective; ex: mediul MacConkey, CAMPY, Skirrow, CSM (charcoal-based
selective medium agar)

4. Identificare
a. Caractere morfo-tinctoriale
 Bacterii spiralate, Gram negative

b. Caractere de cultură
 Colonii S, translucide, tendință de curgere (picătură de miere)

c. Caractere biochimice
 NU produc urează
 Oxidază +
 Catalază +
 C. coli produce H2S

5. Antibiograma
 metoda difuzimetrică nu este standardizată
 se determină CMI prin E-test sau microdiluții