Metode de

analiz a genelor
 Expresia genelor
ADN ARNm Protein Caracter
5-ATTGCAAGATTACCATGT-3 Catena codogen (netranscris)
3-TAACGTTCTAATGGTACA-5 Catena anticodogen (transcris)
Transcripie
5-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3 ARNm

Translaie

Leu Ala Arg Leu Pro Cys polipeptid

Maturizare
Caracter fenotipic normal
 Expresia genelor
ADNmut ARNmmut Proteinan Caracteran

5-ATTACAAGATTACCATGT-3 mutaie G4A

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
Transcripie
5-AUUACAAGAUUACCAUGU-3 ARNmmut

Translaie

Leu Thr Arg Leu Pro Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

 Analiza genelor

ADN ARN Proteine

Secveniere Northern-blot Western-blot

PCR RTPCR Secveniere

Southern-blot Hibridare in situ Analiza funciei

Hibridare in situ Analiza

histochimic
 Obinerea FR fragmentelor de restricie prin
aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)
RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z
 -
12 kb

10 kb 10 kb

8 kb

6 kb 6 kb
2,5 kb

10 kb 5 kb
6 kb 4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb

+
M
 Etapele tehnicii PCR
A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante

B. Repetarea automat a procedurilor de denaturare-

renaturare-elongare de 30-35 ori
Denaturarea ADN la 96oC
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72oC

C. Analiza produilor PCR

- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
Extragerea ADN Pregtirea Amplificarea
componentelor pentru
ADN-int
PCR

Electroforeza Colorarea i Interpretarea

produilor PCR vizualizarea produilor rezultatelor
PCR
Identificarea inseriilor / deleiilor
Identificarea mutaiilor punctiforme
Identificarea agenilor infecioi
Stabilirea paternitii (filiaiei)
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
Concentraiile critice ale substanelor pentru inhibarea activitii Taq-polimerazei

Substana Concentraia critic

SDS >0.005% (m/v)

Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH3COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM

Dependena cantitii de produse amplificate de concentraia ADN genomic utilizat n PCR.

S-a utilizat ADN n cantitate de: 1 0,5 g, 2 0,25 g, 3 0,1 g, 4 0,02 g
Optimizarea condiiilor de
desfurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizai n PCR

Gena Secvena Lungimea, baze % G+C Tm, oC

5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 24 54 59
ACE
5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 25 48 58
5-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3 20 65 58
AT1 R
5-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3 23 48 55
5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
NOS
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59

Dependena cantitii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor.

n condiiile PCR s-a utilizat: 1 toC optimal -5oC; 2 toC optimal; 3 toC optimal +5oC.
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

Dependena cantitii produselor PCR de concentraia ionilor Mg2+.

Concentraia utilizat de MgCl2: 1 2,5mM; 2 5mM.

Dependena cantitii de ADN amplificat de numrul de cicluri PCR.

1 30 cicluri; 2 35 cicluri; 3 40 cicluri.
 Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE

Analiza electroforetic n gel de agaroz de 2% a produselor PCR rezultate

din amplificarea ADN uman cu primeri corespunztori genei ACE.
M marcher al lungimii; 1 genotip I/D; 2 genotip D/D; 3 genotip I/I.
 Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M 1 2 3

G
T

Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei NOS.

M marcher al lungimii; 1 genotip G/G; 2 genotip T/T; 3 genotip G/T.
Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R

Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori

genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M marcher al lungimii; 1 genotip A/A; 2 genotip A/C
Tehnica Real-time-PCR
ARMS-PCR
 Tehnica Southern-blot

Extragerea ADN Restriia ADN Electroforeza ADN

Denaturarea i Hibridare cu sonda Autoradiografia

transferul ADN
pe membrane Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor
 RFLPs i analiza genotipului

Alela Normal cu 3 SR Alela mutant cu 2 SR, mutaie n SR2

C (mm)

B (Nm)

A (NN)

Electroforeza FR a 3 persoane A,B i C

 Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN Electroforeza ARN

Hibridare cu sonda Autoradiografia

Transferul ARN
pe membrane Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor
Identificarea nivelului
de expresie i a variantei
de splicing
5-ATTACAAGATTACCATGT-3 catena codogen
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5 catena anticodogen (matri)

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTAC-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5 5-ATTA -- primer marcat P32

5-ATTACA-3 pentru ADN-polimeraz
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5 A, T, C, T dNTP (2-dNTP)
5-ATTACAA-3
pentru sinteza noilor catene
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
A, T, C, T ddNTP (2,3-ddNTP)
5-ATTACAAG-3
pentru stoparea sintezei
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGAT-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGATT-3
 5-ATTACA-3
5-ATTACAA-3

A 5-ATTACAAGA-3
5-ATTACAAGATTA-3
5-ATTACAAGATTACCA-3
A T C G
5-ATTACAAGAT-3 -
5-ATTACAAGATT-3
T
5-ATTACAAGATTACCAT-3
5-ATTACAAGATTACCATGT-3
5-ATTACAAG-3
G
5-ATTACAAGATTACCATG-3
5-ATTAC-3
+
C 5-ATTACAAGATTAC-3
5-ATTACAAGATTACC-3 5-ATTACAAGATTACCATGT-3
-

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

+
Metoda automat
 Hibridarea in situ pentru
depistarea secvenelor ADN

Hibridarea in situ cu Hibridarea in situ cu

utilizarea preparatelor utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici cu nuclei interfazici
Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenelor ARN

Hibridarea in situ cu Analiza

utilizarea probei sens (stnga) histochimic
i antisens (dreapta) identificarea
proteinelor n esut