HPLC

High Performance Liquid

Chromatography
Cromatografia de lichide de nalt
performan (HPLC) acoper azi, n
proporie aproximativ 80%, analiza
substanelor moleculare: organice,
organo-metalice i anorganice inclusiv
compuii foarte polari sau labili termic
precum i compuii cu mas molecular
ridicat (naturali sau sintetici).
 Cuplajul cu spectrometria de mas a
transformat, n ultimul timp, aceast
metod n principalul mijloc de analiza a
compuilor moleculari naturali sau
sintetici, constituind unul din pilonii pe care
se sprijin chimia sintetic actual i pe
care s-a dezvoltat biochimia i
biotehnologia modern.
Prezentarea schematic cromatograf de lichide (HPLC) modern
Separarea unor pesticide prin
HPLC
 Metoda constituie o evoluie a unei metode mai
vechi, cromatografia pe coloan clasic, care
servea n primul rnd la izolarea preparativ a
compuilor naturali.

Prin introducerea pompelor i n consecin,

lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200
atm), dezvoltarea unor faze staionare
performante, de dimensiuni tot mai mici (recent
constituite din granule de faze staionare sferice,
cu diametre 2 5 m), n coloane tot mai scurte
(3 -10 cm) s-a ajuns, ncepnd cu anul 1969, la
configuraia actual.
Schema bloc a unui cromatograf
HPLC
 POMPA
Pompa este considerat una dintre cele mai importante
componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui
debit constant al eluentului prin ntreg sistemul: injector,
coloan, detector mrind deosebit de mult viteza
separrii.

ntr-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai

multe pompe, fiecare furniznd o presiune care poate
atinge 20.000 kPa (cca. 200 atm). Presiunea deosebit
este necesar deoarece coloana are o umplutur de
finee mare i, n lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de
mic.
 Exist n uz dou tipuri principale de
pompe, clasificate astfel n funcie de
debit:

pompe cu presiune constant (i debit

variabil) i

pompe cu debit constant.

Sisteme de introducere a probei
n cazul HPLC injecia probei trebuie
fcut ntr-un timp ct mai scurt, pentru a
nu deranja regimul dinamic al eluentului
prin coloan i detector.
Dificultatea provine de la presiunea
ridicat la care lucreaz coloana (20.000
kPa).
 Coloanele n LC
Materialul din care se
confecioneaz corpul coloanei n
LC trebuie s asigure acesteia
rezistena mecanic adecvat
presiunilor nalte (20.000 kPa)
precum i rezistena la coroziune
fa de faza mobil. n majoritatea
cazurilor a fost preferat oelul
inoxidabil 316 lucios. Acesta
rezist la majoritatea solvenilor,
excepie fcnd doar srurile
halogenilor, n special n soluie
puternic acid. Alte alternative o
constituie coloanele compozite:
sticl sau plastic n interior oel
inoxidabil sau material plastic n
exterior.
 Coloanele n LC
Din punctul de vedere al geometriei, aceste
coloane sunt cilindrice, iar dimensiunile depind,
n primul rnd, de dimensiunea granulelor i
porozitatea umpluturii.

Astfel diametrul coloanelor variaz ntre 0,3 5

cm iar lungimea poate fi ntre 3 25 cm. Pentru
scopuri preparative, n cazul unor componente
necunoscute, se utilizeaz chiar diametre mai
mari.
 Faza staionar
Silicagelul (SiO2) este considerat
materialul cel mai important utilizat ca faz
staionar.
Acesta a devenit, n ultimii 20 de ani, doar
suportul adevratelor faze - fazele chimic
legate - ceea ce nu schimb importana
sa. Silicagelul s-a obinut la nceput n
form granular, neregulat, apoi n form
sferic
 Faza staionar

Aspectul granulelor de silicagel sferic folosite frecvent la umplerea coloanelor

din HPLC
 Cteva dintre cele mai cunoscute
tipuri de silicagel pentru HPLC
pH-ul n
Diametrul Suprafaa Tipul
Marca suspensie
porilor specific particulelor
de 10%
Zorbax 300 30 39 5,4 Sferice

Vydac TP 32 82 4,1 Sferice

Hypersil 12,5 149 8,2 Sferice
Spherisorb 8 190 7 Sferice

Polysil 6 245 6,5 Neregulate

LiChrosorb 10 297 6,7 Neregulate

Rosil 8 357 8,4 Sferice

Rsil 6 433 8,0 Neregulate
Aspectul schematic al unei granule sferice cu faz staionar chimic
legat pe suprafaa suportului
 Faza mobil
Faza mobil sau eluentul n LC nu reprezint un mediu inert ca
gazul purttor din GC. De aceea alegerea fazei mobile se face aici
n perfect concordan cu faza staionar.

Astfel faza mobil difer destul de mult n funcie de tipul

interaciunilor componentelor separate cu faza staionar din
coloan.

Singurele caracteristici generale sunt urmtoarele:

(1) faza mobil trebuie s aib o viscozitate cobort,
(2) aceasta trebuie s dizolve bine componentele,
(3) nu trebuie s afecteze funcionarea coloanei i
(4) trebuie s permit funcionarea detectorului.
Cteva faze mobile (monocomponente) utilizate n

cromatografia de repartiie n ordinea triei lor relativ

 Detectori
Detectori spectrofotometrici n UV-VIS

Pentru a putea fi utilizai, compuii separai

cromatografic trebuie s fie colorai - adic s
absoarb lumina pe domeniul de lungimi de und al
detectorului. Pe de alt parte, eluentul trebuie s fie
practic transparent pentru acelai domeniu spectral.
Legea fizic pe baza creia funcioneaz aceti detectori
- este legea Lambert-Beer (A=lC). Deci unitile vor fi
uniti de absorban, adimensionale.
Motivul principal al popularitii acestor detectori este
acela c numeroasele substane organice, anume cele
care conin legturi duble (electroni ), respectiv au
grefate funciuni organice cu electroni neparticipani,
absorb lumina n UV-VIS.
Schema bloc a unui detector HPLC
spectrofotometric
 Detectori refractometrici
Detectorii refractometrici, au la baz legile refraciei luminii.
Principiul de funcionare al acestor detectori are la baz legea lui
Fresnel - de transmitere a luminii prin medii transparente avnd un
indicele de refracie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau
policomponent) trece printr-o celul cu dou compartimente unul
coninnd doar eluentul pur iar cellalt faza mobil care prsete
coloana.

Diferena dintre indicii de refracie pentru soluiile aflate n cele dou

compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloan iese
doar eluentul pur, dar diferit n momentul n care n eluent mai
apare un component separat - antrenat de ctre eluent din coloan.
n momentul ieirii unui component are loc o deplasare a poziiei
fascicolului emergent din detector - deplasare care este
proporional cu concentraia i sesizat de ctre detectorul D.
Principiul de funcionare al unui
detector refractometric
 Detectorii conductometrici
Acest tip de detectori se
utilizeaz cu precdere n
cromatografia pe
schimbtori de ioni i sunt
sensibili la ioni anorganici
sau organici inclusiv acizi
organici. Sunt aadar
detectori specifici. Sunt
suficient de sensibili (500
pg - 1ng).