REGENERAREA CARTILAGIILOR-

INGINERIE TISULARA
 IT –Tesutul cartilaginos

Ingineria tisulara – surse de celule

factori de crestere
factorul de transformare a cresterii beta- TGF-β
factor de crestere insulinei (IGF)
scaffold-uri
IT –Tesutul cartilaginos
 IT –Tesutul cartilaginos
Cartilagiile articulare = cartilagii hialine compuse din ECM, o populatie celulara redusa si
putine vase de sange, vase limfatice si nervi.

Condrocitele → au activitate metabolica redusa (diviziune redusa sau lipsa);

→ sunt responsabile de mentinerea unicitatii compozitionale si
organizatorice a matricii dezvoltate in perioada embrionara si postnatala.
→ dezvolta reteaua/scheletul macromolecular al ECM din 3 clase de
molecule: colagen, PG si proteine non-colagenice;
IT –Tesutul cartilaginos
 IT –Tesutul cartilaginos
Homeostazia cartilajului articular

o Este compus din 4 regiuni distincte, care difera prin orientarea fibrilelor de colagen:
- z. superficiala sau tangentiala (200μm) - fibrile dispuse tangential, paralel cu
suprafata;
- z. mijlocie sau tranzitionala – fibrile mai groase, organizate aleator;
- z. profunda sau radiala – fibrilele sunt organizate in manunchiuri si orientate
radialfata de suprafata;
- z. cartilajului calcificat – localizata deasupra osului, compus din vezicule
matriceale + vascularizatii si inervatii ale acestuia; contine colagen de tip X.
Densitatea celulara scade de la suprafata spre profunzime.
IT –Tesutul cartilaginos
 IT –Tesutul cartilaginos

Homeostazia cartilajului articular:

oCondrocitele sunt capabile sa traiasca in conditii limitate de vascularizare, deci

nutritie si oxigenare (10% la suprafata → 1% in profunzime);
oContine o varietate de PG esentiali unei functionari normale: agregan, decorin,
biglican, fobromodulina, lumican. Sunt foarte importanti pentru protectia retelei de
colagen;
o In timpul vietii, este remodelat in mod continuu de catre condrocite;
oECM a fost divizata si ea in zone, in functie de distanta fata de celule: pericelulara,
teritoriala sau interteritoriala;
IT –Tesutul cartilaginos
 IT –Tesutul cartilaginos

Defectele cartilagiilor:

o Boli degenerative (OA = osteoartrita);

o Speciile reactive de oxigen si senescenta → schimbari
musculoscheletale normale, survenite in timp, dar care
contribuie la dezvoltarea osteoartitelor;
o Traumatismele.
 IT –Tesutul cartilaginos

Fibrilatii + fisuri si
clustere celulare in
zona superficiala

Metode de tratament:
o Artroplastia;
o Ingineria
tisulara:
 IT –Tesutul cartilaginos

Artroplastia
-principala metoda de tratament;
-dezavantajele materialelor actuale: nu rezista la
activitatile fizice ale pacientilor si sunt predispuse la
cedare prin oboseala, isi pierd proprietatile sau se
distrug in anumite conditii;

Semnalele biologice trebuie sa fie transmise optim

la nivelul ECM, astfel incat sa fie evitate procesele
inflamatorii, in vreme ce procesele regenerative sa
fie initiate si stimulate.
 IT –Tesutul cartilaginos

Ingineria tisulara:
-se adreseaza mai mult populatiei tinere si in prezent este aplicata cu precadere in cazul
leziunilor traumatice minore.
- in cazul OA, situatia sta un pic diferit. In conditii de boli degenerative, tratamentul prin TE
inca prezinta numeroase deficiente, explicate in general prin extinderea bolilor ce afecteaza
articulatia OA. Astfel, TE ar trebui sa abordeze anumite fenomene, cum ar fi blocarea
productiei de factori pro-inflamatori si inhibarea progresului degenerarii ce afecteaza
atat tesutul cartilaginous, cat si pe cel osos.
 IT –Tesutul cartilaginos

Exista 2 metode principale de TE, dupa cum urmeaza:

1. Implantarea de condrocite autologe = Autologus chondrocite
(ACI
implantation);
2. Productia de tesut neocartilaginos.
 IT –Tesutul cartilaginos

1. ACI:
- reprezinta terapia celulara clinica dominanta in acest domeniu, din ultima decada;
-condrocitele articulare sunt implantate sub un lambou periosteal (segment, fasie), dupa
debridarea chirurgicala a leziunii (suprimarea bridelor care comprimă un organ);
- rezultate excelente pe termen scurt-mediu; pe termen lung – neclar, exista controverse;
 IT –Tesutul cartilaginos

2. Obtinerea de tesut neocartilaginos:

Celule + biomateriale + sisteme de bioreactoare + GF;

 IT –Tesutul cartilaginos

Ambele metode presupun izolarea celulelor si inmultirea acestora in vitro. Degradarea enzimatica
a ECM din timpul procedurii de izolare afecteaza celulele, fapt demonstrat prin modificarile
de profil genetic exprimat de catre acestea. Dupa insamantarea/atasarea initiala, celulele incep
sa prolifereze, devin fibroblast-like si adopta o morfologie poligonala. Modificarile fenotipice
sunt acompaniate de comutari in expresia genelor, care includ pierderea de collagen de tip II,
IX si XI si agregan, concomitent cu cresterea cantitatii de collagen tip I, III si V. O data cu
prelungirea timpului de cultura, profilul markerilor de suprafata se schimba, devenind similar
celulelor progenitoare mezenchimale. Prin insumarea acestor schimbari definim termenul “de-
diferentiere”.
Anti de-diferentiere:
A fost abordata o serie de metode de crestere a condrocitelor in suspensii si evitarea de-
diferentierii, inclusiv pe suprafete plastice non-aderente, in agaroza sau geluri de alginat, insa
desi condrocitele si-au pastrat capacitatea de a sintetiza ECM, rata de proliferare a fost afectata
semnificativ.
Promovarea re-diferentierii, prin: cresterea celulelor de-diferentiate in conditii 3D (ex: culturi
micro-granulare si pe scaffolduri nat/artif), suplimentarea mediului (cytokine anabolice, GF),
varierea presiunii oxigenului si stimularea mecanica.
;
 IT –Tesutul cartilaginos

Scaffoldurile:

-aplicatiile variaza de la substitutia unor segmente periosteale din cadrul ACI pana la
dezvoltarea sistemelor de eliberare controlata, care sa stimuleze capacitatea de regenerare
tisulara si sa reduca procesele inflamatorii, asociate OA;
-substitutia unor segmente periosteale din cadrul ACI => scaffolduri inalt poroase, care sa
mentina celulele diferentiate in zona de interes sau sa incurajeze proliferarea condrocitelor,
prin favorizarea migratiei celulare;

-trebuie avute in vedere: natura si tipul defectului de corectat (din care rezulta dimensiunea
si forma substituentului) corelate cu conditiile articulare ale gazdei; in cazul OA, pe langa
tesutul cartilaginos, solutionarea mai implica sinoviala si osul subcondral, intrucat si acestea
sunt afectate de boala.
 IT –Tesutul cartilaginos

Scaffoldurile - Biomateriale:

o Polimeri naturali proteici: fibrina, colagen, laminina (Matrigel®), gelatina;

o Polimeri pe baza de carbohidrati: PLA, PGA, ac. hialuronic, agaroza, alginat, chitosan;
oPolimeri artificiali: Dacron® (PET), teflon (PTFE), fibre de C, poliesteruretani,
ac. polibutiric, HA;
oCombinatii ale claselor de mai sus: cross-linkare, modificari chimice,
modificari geometrice, combinatii de matrici.
 IT –Tesutul cartilaginos
Bioreactoare = dispozitive ce permit
controlul si reproductibilitatea
parametrilor fiziochimici de cultura.
In acest fel, este imbunatatita calitatea
tesutului neoformat si sunt eficientizate
procesele de obtinere.

Subiectul bioreactoarelor pentru TE

va fi discutat mai detaliat in
cursurile viitoare.
 IT –Tesutul cartilaginos

1. Bioreactoare pentru stabilirea si mentinerea culturilor 3D:

Primul pas in generarea ex vivo a unei grefe de cartilaj presupune insamantarea celulelor
condrogenice pe un scaffold poros, stabilind astfel mediul 3D si influentand uniformizarea
straturilor celulare succesive.
Tehnica cea mai comuna consta in simpla pipetare a unei suspensii celulare foarte
concentrata (densa) pe suportul corespunzator, insa –fiind un proces manual si dependent de
manipulator- prezinta lipsuri in ceea ce priveste controlul si reproductibilitatea.
In acest sens, se pot utiliza bioreactoarele cu vas agitator pentru scaffoldurile subtiri si inalt
poroase; in cazul celor cu grosime mare sau porozitate redusa insa, celulele nu pot penetra
suficient in profunzime.
Prin perfuzarea suspensiilor celulare direct prin pori (bioreactoare cu perfuzie) se obtin
structuri celulare uniforme, cu proprietati superioare tehnicilor mentionate mai sus.
 IT –Tesutul cartilaginos

Bioreactoare cu perfuzie:
 IT –Tesutul cartilaginos

Bioreactoare pentru stabilirea si mentinerea culturilor 3D:

Al doilea pas consta in mentinerea distributiei si viabilitatii celulare in regiunea interna, pa

parcursul intregii perioade de cultura. Din cauza limitarilor de transfer de masa, structurile
cartilaginoase obtinute prin metode statice sunt cel mai adesea neomogene (structura +
compozitie) si contin o regiune centrala de necroza hipoxica si straturi dense de celule viabile
in zona periferica.
Bioreactoarele cu vas agitator sau rotativ faciliteaza transferul de masa spre/dinspre
structurile concrocite+scaffold, marind concentratia de molecle specifice cartilagiilor, in zona
centrala.
Sistemele de bioreactoare care perfuzeaza mediul de cultura prin porii scaffoldului
favorizeaza transferul de masa si promoveaza sinteza si retentia de GAG in ECM; de
asemenea, distributia condrocitelor este uniforma, asa cum s-a putut observa si in imaginea
de pe slide-ul anterior (dreapta jos).
 IT –Tesutul cartilaginos

2. Bioreactoare pentru determinarea proprietatilor mecanice:

Sarcinile ce actioneaza la nivelul articulatiilor joaca un rol critic atat in procesul de

diferentiere a MSC in celule cartilaginoase, cat si in dezvoltarea si mentinerea proprietatilor
structurale si functionale, pe toata perioada vietii.
Strategie cheie in TE: prin incarcarea mecanica, utilizand diverse dispozitive, este
stimulata diferentierea si dezvoltarea celulara in vivo (controlul magnitudinii,
frecventei, forte continue/intermitente, etc). Totusi, in acest sens inca mai sunt multe de
elucidat. Complicatiile se datoreaza in general faptului ca efectul stimulilor mecanici difera
de la un tip de scaffold la altul.
 IT –Tesutul cartilaginos

3. Bioreactoare pentru siteme controlate:

Bioreactoarele enumerate anterior pot servi drept modele controlate in vitro pentru studiul
interactiilor fiziopatologice dintre fortele fizice si factorii solubili, in cadrul dezvoltarii
tesutului cartilaginos.
Exemplu: Bioreactor ce aplica regimuri cotrolate de sarcini mecanice + citokine inflamatorii
specifice, pentru inverstigarea raspunsului tesutului fata de mediul ce simuleaza conditiile
unei articulatii osteoartritice. Acest tip de model este de obicei utilizat inainte de a se trece la
modele mai complicate si mai costisitoare, cum ar fi testele pe animale.

4. Bioreactoare pentru productia tesutlui cartilaginos:

Una dintre provocarile majore in acest sens este trecerea de a productia de la scala de
cercetare la productia la scala industriala, cu aplicabilitate clinica, care trebuie sa
respecte cerinte precum: reproductibilitate, eficienta clinica, costuri acceptabile, etc.
Bioreactoarele pot satisface aceste cerinte prin automatizarea si standardizarea tehnicilor
de productie a grefelor tisulare, in sisteme inchise si controlate.
IT –Tesutul cartilaginos