NOTIUNI DE PRELUCRARE SI ANALIZA A REZULTATELOR EXPERIMENTALE

modalitati de prezentare a rezultatelor experimentale (tabele, diagrame, ecuatii) caracterizarea si prelucrarea datelor experimentale (teste statistice, teste de corelatie)

date (experimentale)
- dare (lat.) = a da - informatii pe care o situatie particulara le da unui observator - nu reprezinta realitatea absoluta; sunt manifestari ale realitatii

- utilizarea corecta a metodelor de analiza si prelucrare a datelor experimentale maxim de informatii dintr-un experiment - modele matematice Y = f(X1, X2, .....Xn) - rationale ecuatie dedusa teoretic - empirice ecuatie rezultata din corelarea unor date experimentale

 Tabele

- contin valori numerice pentru doua categorii de variabile: independente (X) si dependente (Y)

- titlul tabelului clar, concis, complet - capul tabelului denumirea variabilelor (simboluri), unitati de masura - coloane valori ale variabilelor - linii (randuri) interdependentele intre variabile - prima coloana informatii pentru identificarea datelor (numarul/codul probei/experientei) - datele - ca atare sau prelucrate (ecuatii, grafice)
- avantaje - simple, usor de intocmit - dezavantaje sugestivitate insuficienta

Scara etalon pentru determinarea cantitativa a polifenolilor totali

Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Concentratia (micrograme ac. galic/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7

Absorbanta 0,0048 0,1010 0,2110 0,3069 0,4011 0,4877 0,5885 0,6931

- interpolare determinarea lui Y pentru valori ale lui X in limita valorilor extreme cuprinse in tabel grafica: y = f(x) -extrapolare determinarea lui Y pentru valori ale lui X in afara valorilor extreme cuprinse in tabel (valori orientative)

Diagrame - reprezentarea relatiei dintre doua sau mai multe marimi variabile (linie, curba, suprafata de raspuns)

- avantaje: - usurinta in compararea datelor - evidentierea maximelor, minimelor, punctelor de inflexiune - posibilitatea determinarii unei dependente matematice intre marimi
-etape pentru construirea unei diagrame:

1. stabilirea sistemului de reprezentare abscisa valorile variabilei independente ordonata valorile variabilei dependente 2. identificarea axelor de coordonate denumirea variabilelor, simboluri, unitati de masura

3. fixarea modulului axelor de coordonate modul = lungimea corespunzatoare unitatii de masura a marimii de reprezentat suficient de mare exprimat printr-un numar intreg

4. divizarea axelor de coordonate intervale uniforme datele sa fie distribuite pe intreaga suprafata a graficului originea sistemului axelor de coordonate nu trebuie inclusa obligatoriu

domeniul de variatie al variabilelor este prea mare:

ruperea curbei in mai multe portiuni

 reprezentarea pe aceeasi scara cu schimbarea modulului

limitarea diagramei numai pe domeniul de valori care intereseaza

5. evidentierea punctelor si trasarea curbei simboluri - cerc, triunghi, romb, patrat, dreptunghi legenda explicarea simbolurilor bare de erori eroare de masurare a variabilelor dependente punctele, curba - grosime mai mare comparativ cu cea a axelor un grafic mai multe curbe 6. intitularea graficului clara (autoexplicare) programe software specializate in intocmirea de tabele si grafice: LOTUS 1-2-3 EXCEL

0.8 0.7 0.6 y = 0.0974x + 0.0083 R2 = 0.9994

extinctia

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 conc. (microg/ml)

Scara etalon pentru determinarea cantitativa a polifenolilor totali

miliechivalenti ac. galic/100 g extract

250

200

150

100

50

0 1 2 3 4 5 6 7

extract

Reprezentarea grafica a continutului in polifenoli totali (miliechivalenti acid galic/100 g extract) al extractelor 1 - 7

 Caracterizarea statistica a datelor experimentale

- stabilirea unei relatii de dependenta intre variabile sistematizarea si caracterizarea datelor experimentale - sistematizare tabele, diagrame, grafice - caracterizare teste de statistica, teste de corelatie - analiza numeroase etape surse de erori care afecteaza rezultatele obtinute - rezultatul nu reprezinta exact marimea cautata, ci o valoare apropiata de aceasta - masura in care un rezultat este accceptabil si demn de incredere - calculul statistic - aproximarea cu o anumita probabilitate a masurii in care rezultatul unei analize se apropie de valoarea adevarata

- orice analiza (operatie) comporta erori

- eroare = lipsa concordantei dintre observatia experimentala exprimata prin rezultat si valoarea adevarata -surse de erori: - executantul - instrumentele utilizate - sistemul asupra caruia se efectueaza determinarea - cuantumul erorilor datorate etapelor de analiza: - prelevarea probei 40-45% - pregatirea probei 30% - etape ulterioare 20% - masurarea 5-10%

calcularea erorilor:
eroare absoluta Ea = Xi A; (+/-)

eroare sistematica (eroare absoluta a mediei) Ea = X - A eroare relativa Er = Xi - A/A x 100 concentratii foarte mici de substanta A = 20,08% Fe A = 0,80% Fe Xi = 20,06% Fe Xi = 0,78% Fe Ea = - 0,02 Ea = - 0,02 Er = - 0,0996% Er = - 2,5%

eroare relativa a mediei unui set de determinari Er = X - A/A x 100

eroare mica exactitate mare exactitatea relativa procente din valoarea adevarata: Xi/A x 100 X/A x 100

TEST concentratia unei probe: 42,76 valoarea adevarata: 42,84 eroarea relativa, procentual si la mie ? exactitatea relativa ?

deviatia (abaterea) fata de medie valoare obtinuta experimental media setului de determinari di = xi - x deviatia medie suma deviatiilor valorilor experimentale fata de medie/numar de determinari d = di / N
domeniul de dispersie (w) valoarea cea mai mare valoarea cea mai mica

abaterea (deviatia, eroarea) standard () dispersia valorilor obtinute fata de medie = (xi m)2 / N m = media pe un numar infinit de determinari N = numarul determinarilor (teoretic infinit)

deviatia (abaterea, eroarea) medie patratica (s) s= (xi x)2 / N - 1 s valoare mica distributie a valorilor intr-un domeniu ingust in jurul mediei precizie buna exprima precizia unei valori
deviatia (abaterea, eroarea) medie patratica a mediei = eroare standard (sx) sx = s / N exprima precizia metodei (medie) deviatia (abaterea, eroarea) standard relativa s/x (RSD), exprimata procentual = coeficient de variatie (CV) RSD% = CV = s/x 100 compararea preciziilor

varianta (2, s2) s2= (xi x)2 / N - 1 analiza cauzelor care determina dispersia datelor

TEST dozarea Mg dintr-o proba: I. 9,78 9,78 9,95 9,97 II. 10,15 10,02 10,12 10,18 valoare adevarata: 9,90 eroarea medie absoluta (Ea) ? eroarea medie relativa (Er) ? deviatia medie patratica (s) ? deviatia medie patratica a mediei (sx) ? coeficientul de variatie (CV) ? domenii de dispersie (w) ?

-erori:
- sistematice - intamplatoare - personale (umane) erori sistematice - erori de metoda, erori instrumentale - cauze permanente, cunoscute (impurificare, pierderi, defecte ale aparatelor de masurare, etalonare incorecta a vaselor de masurare a volumelor, citiri incorecte, reactii secundare, conservare necorespunzatoare) - dupa cauze: erori ale metodelor erori instrumentale erori operationale si personale

- afecteaza exactitatea rezultatelor

- acuratete = exactitate = masura a apropierii sau departarii rezultatului de valoarea reala - media aritmetica a rezultatelor X - rezultat analitic exact daca valoarea sa concorda cu valoarea reala (adevarata) a marimii masurate - se pot elimina (partial sau total)

erori ale metodelor: -comportarea neideala a sistemelor analitice (instabilitatea unor compusi, viteza mica a reactiilor, lipsa de specificitate a unor reactivi) - inerente metodelor analitice - greu de identificat si corectat - marimea erorii creste cu cat cantitatea de analit din proba este mai redusa (componente in urme: 20%)

erori intrumentale: -imperfectiuni ale instrumentelor (calibrare incorecta) - influenta factorilor de mediu (masurarea pH-ului la temperatura diferita de cea la care s-a facut calibrarea) - orice instrument (performant!!!) erori
erori operationale si personale: -lipsa de instruire si aptitudini - ignoranta - neatentie - abilitate diferita de a face observatii cu exactitate (sesizarea virajului de culoare, aprecierea nivelului de lichid in biureta sau pipeta)

erori constante: -valoare independenta de cantitatea de analit din proba -erori de titrare erori proportionale: -valoarea creste/descreste proportional cu marimea probei -eroare cu atat mai mare cu cat masa cantarita este mai mica

corectarea erorilor datorate metodelor: 1. efectuarea determinarii in comparatie cu o proba standard - proba standard (etalon) = subst./amestec de subst. cu compozitie si continut bine stabilite, pure, care reproduc fidel (calit. si cant.) compozitia probei de analizat

-rezultatul obtinut se verifica in comparatie cu rezultatul obtinut la determinarea cu proba standard

2. efectuarea determinarii printr-o alta metoda -concordanta rezultatelor obtinute la determinarea aceluiasi analit folosind metode diferite 3. efectuarea determinarii in paralel cu o proba martor (proba in alb, blanc) -proba martor nu contine analitul care se dozeaza 4. metoda adaosurilor standard -eliminarea erorilor cauzate de interferente (probe cu compozitie complexa); efecte de matrice - ameliorarea sensibilitatii la determinarea analitilor care se gasesc in concentratii foarte mici

-metoda adaosului unic: proba / proba + standard

-metoda adaosurilor succesive proba + volume constante de standard in etape succesive -metoda adaosurilor cu aducere la acelasi volum proba volume egale de proba + volume diferite de standard aduse la acelasi volum

5. metoda standardului intern - spectrofotometrie, cromatografie - standard intern = alta specie chimica decat analitul care are structura si proprietati cat mai asemanatoare cu acesta - proba = standard intern + cant. necunoscuta de analit - amestec standard = standard intern + cant. cunoscuta de analit raport conc. in proba/raport conc. in amestecul standard = raport semnale in proba/raport semnale in amestecul standard -evitarea erorilor datorate pierderilor de proba; orice operatie afecteaza in aceeasi masura analitul si standardul intern 6. variatia marimii probei de analizat -prezenta erorilor constante - efectuarea de determinari pe probe de marimi diferite

-valori experimentale afectate de marimea probei erori intamplatoare - erori de reproductibilitate, erori aleatorii - cauze necunoscute, neprevizibile, variabile (variatii de temperatura, umiditate, presiune, defectiuni ale ochiului, impurificare accidentala) - afecteaza precizia rezultatelor - precizia (fidelitatea) valori apropiate intre rezultate - nu se pot elimina -se distribuie dupa o curba comparabila distributiei gaussiene - ecuatia curbei de distributie normala (ecuatia lui Gauss) evaluarea efectului total al erorilor intamplatoare asupra rezultatului unei determinari fara a le cunoaste cauzele si marimea individuala

Curba de distributie normala

Curbe de distributie normala pentru diferite valori ale lui

erori personale erori umane cauze : ignoranta, neglijenta: - spalarea insuficienta/excesiva a precipitatelor - calcinare insuficienta/excesiva a precipitatelor - uscare insuficienta a precipitatelor - spalare insuficienta a vaselor - calcul incorect (mase moleculare/ionice, echivalenti) - neatentie la cantarire si masurarea volumelor de solutii - pierderi, contaminare accidentala

valuare anormala - difera semnificativ de media aritmetica a datelor - teste statistice: - testul pentru eliminarea unui rezultat anormal - testul t-Student
testul pentru eliminarea unui rezultat anormal: calcularea amplitudinii (w) w = Xmax Xmin Q = Xn-Xn-1/w sau Q = Xn+1-Xn/w Xn = valoarea anormala Xn-1 = valoarea imediat inferioara Xn+1 = valoarea imediat superioara Q > Q0 valoarea poate fi eliminata

Coeficientii Q0 pentru eliminarea unui rezultat anormal (90%)

Nr. date exp. (N) Q0 3 4 5 6 7 8 9 10

0,94 0,76 0,64 0,56 0,51 0,47 0,44 0,41

TEST determinare cantitativa: 98,63 98,58 98,47 eliminata ?

98,47

98,69%

testul t-Student x x/s t x = valoarea anormala x = media aritmetica a valorilor experimentale ale variabilei t depaseste valorile critice de distributie Student valoarea poate fi eliminata

- m (media adevarata) nu poate fi cunoscuta, dar se poate aprecia gradul in care media valorilor obtinute experimental se apropie de m - intervalul in jurul valorii X in care m se poate gasi cu o anumita probabilitate = interval de incredere; valori extreme = limite de incredere m = X ts/N ; t = parametru Student
-t valori diferite pentru diferite nivele de probabilitate - probabilitate = nivel de incredere = nr. cazuri favorabile/nr. total de cazuri posibile 90% 95% - exprimarea rezultatului final: A = X tsx

Valori critice ale distributiei Student (95%)

Nr. det. (N)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

12,705 4,303

3,182

2,776

2,571 2,447 2,365

2,306

2,262

2,228

TEST media valorilor experimentale: 15,87%; eroarea medie patratica: 0,20% intervalul de incredere ptr. o probabilitate de 95% in cazul in care s-au facut 4 determinari?

98,63 98,58 98,47 98,69 domeniul de incredere (probabilitate 95%) ?

Analiza de corelatie -stabileste gradul de legatura dintre variabilele analizate - dependente liniare sau parabolice

- covarianta (x, y) cov(x,y) = (xi-x)(yi-y) / N-1 cov = 0 nici o corelatie; valori pozitive/negative - coeficient de corelatie (ry,x) exprima abaterea de la valoarea medie aritmetica r(y,x) = (xi-x)(yi-y) / (xi-x)2(yi-y)2 - coeficient de determinare (r2y,x) exprima partea din variatia variabilei dependente Y care poate fi explicata prin variatia variabilei independente X

-testul Fischer (F) -testeaza adecvanta unui model matematic (abilitatea de a reprezenta date experimentale) -compara dispersia datelor experimentale datorata erorilor de experienta cu dispersia datelor experimentale calculate pe baza modelului matematic Fcalculat F - modelul matematic reprezinta datele experimentale cu probabilitatea corespunzatoare testului F Valori critice ale distributiei Fischer
Nr. date exp. (N) 1 2 3 1 161 18,51 10,13 2 3 5 230 7 237 9 241 19,38 8,81 10 242 19,39 8,87

200 216 19,0 19,16 9,55 9,28

19,30 19,36 9,01 8,88

CONTROLUL CALITATII REZULTATELOR EXPERIMENTALE SI VALIDAREA

grafice de control ca procedee statistice de control a desfasurarii experimentelor procesul de validare analiza statistica de multivarianta in validarea produselor farmaceutice

 Grafice de control ca procedee statistice de control a

desfasurarii experimentelor
- harti de control ale lui Shewhart

- instrumente de evidentiere si verificare a calitatii

- cercetarea de preformulare si formulare farmaceutica - procedee de screening farmacologic: -grafice de control a mediei raspunsului biologic -grafice de control al intervalului raspunsului -performanta prod. testat/prod. de control -media si variabilitatea raspunsului biologic -validarea procedeului de testare - etape de testare, dezvoltare, validare -inregistrarea rezultatelor estimarea deviatiei standard

construirea graficelor de control - componente: set de puncte reprezentate cronologic corespunzatoare caracteristicii de interes - linie centrala estimarea mediei/deviatiei standard - limitele superioara si inferioara de evaluare a datelor - proces sub control - proces in afara controlului date care depasesc limitele

grafice de medie (grafice de control a mediei de proces)

- cele mai utilizate in domeniul farmaceutic si medical

-ex.: controlul calitatii unui lot de produse: - prelevarea unor seturi de cate 5 probe din regiuni diferite 20 probe - calcularea mediei fiecarui subgrup - calcularea mediei de medie - construirea graficului linia centrala media de medie limite superioara si inferioara limite de control (calcul statistic; 3)

grafice de interval (grafice de control a variabilitatii de proces)

Ri = xmax i-xmin i R = (R1 + R2 +...............Rn)/n linia centrala media intervalelor calculate pentru fiecare subgrup

limite de control: UCLR = R + 3R (Upper Control Limit) LCLR = R - 3R (Lower Control Limit) R = deviatia standard a intervalului R

analiza de tendinta -utilizata pentru determinarea punctelor ne-naturale aflate in interiorul limitei 3

 Procesul de validare

-demonstreaza ca o metoda analitica conduce la rezultate sigure, reproductibile (metoda este adecvata scopului pentru care urmeaza sa fie folosita) sau ca un anumit procedeu tehnologic realizeaza produse ce intrunesc normele specifice de calitate

- metode analitice, procese tehnologice

- validare retrospectiva metode/procedee/produse deja existente - validare prospectiva metode/procedee/produse noi

metodologia generala de validare a metodelor analitice

obiectiv demonstrarea ca o metoda de analiza corespunde utilizarii pentru care a fost elaborata / un anumit procedeu tehnologic realizeaza produse ce intrunesc normele specifice de calitate procedeu (metoda) validat au fost analizate: exactitatea fidelitatea specificitatea sensibilitatea parametrii care fac obiectivul validarii: exactitatea (acuratetea) fidelitatea (precizia) repetabilitate reproductibilitate linearitate specificitate sensibilitate robustete

criterii de validare a metodelor de analiza: - dupa nota Comisiei CEE (Comunitate Economica Europeana)
METODA CRITERII DE VALIDARE

identificare/detectie
determinarea continutului de impuritati dozarea continutului (concentratiei) sau a activitatii substantei

- specificitatea
-specificitatea: limita de detectie limita de cuantificare -specificitate - fidelitate - repetabilitate - reproductibilitate - exactitate - linearitate - interval de linearitate - sensibilitate

- dupa USP XXIII

CRITERII Dozarea prod. activ, prod. finiti Dozarea impuritatilor, prod. de degradare Teste ptr. limitele de impuritati, prod. de degradare Teste farmaco tehnice

fidelitate (precizie) exactitate (acuratete) limita detectie limita cuantificare specificitate interval validitate linearitate robustete

+ -

+ +

+ + +

+ + + +

+ + + + +

+ + +

+ + + + +

exactitate (acuratete) concordanta dintre valoarea reala si rezultatul obtinut ofera informatii asupra erorilor sistematice Ea; Er; exactitate relativa
eroare absoluta: Ea = Xi A Ea = X - A

eroare sistematica (eroare absoluta a mediei): eroare relativa Er = Xi - A/A x 100

eroare relativa a mediei unui set de determinari: Er = X - A/A x 100 exactitatea relativa: Xi/A x 100 X/A x 100

fidelitate (precizie) concordanta dintre rezultatele unei serii de masuratori masura a repetabilitatii si reproductibilitatii repetabilitate fidelitate in conditii identice
reproductibilitate fidelitate in conditii experimentale diferite deviatia (abaterea fata de medie) di = xi - x deviatia medie d = di / N

domeniul de dispersie (w) valoarea cea mai mare valoarea cea mai mica
abaterea (deviatia, eroarea) standard () = (xi m)2 / N deviatia (abaterea, eroarea) medie patratica (s) s= (xi x)2 / N - 1 deviatia (abaterea, eroarea) medie patratica a mediei = eroare standard (sx) sx = s / N deviatia (abaterea, eroarea) standard relativa s/x (RSD), exprimata procentual = coeficient de variatie (CV) RSD% = CV = s/x 100

linearitatea intensitatea semnalului analitic variaza proportional cu concentratia specificitatea determinarea unui component dintr-un amestec multicomponent prin masurarea unui parametru fizico-chimic caracteristic componentului urmarit selectivitate determinarea unui numar limitat de componente dintr-un amestec multicomponent limita de interferenta (Cint) = conc. minima a unui component interferent care poate produce perturbarea reactiei principale erori sistematice

grad de selectivitate (l) l = Cint / C criteriu important ptr. aprecierea selectivitatii si specificitatii neselective l 0,1 putin selective 0,1 < l 100 selective 100 < l 1000 foarte selective 1000 < l 10000 specifice l > 10000
sensibilitate concentratia minima a unui component care poate fi determinata cu siguranta limita de detectie cant. minima de component (mg) care poate fi identificata

limita de cuantificare cant. cea mai mica de component care se poate doza, in conditiile experimentale date, cu o anumita exactitate limita de dilutie volumul maxim de solutie in care se poate determina cant. de component corespunzatoare limitei de detectie LD = LR (mg) / V (mL)
robustete obtinerea unor rezultate valabile (exacte) chiar daca se produc modificari minore ale conditiilor experimentale variatii mici rezultatele se pot valida

raport de validare -obiectivele, scopul metodei, aplicabilitatea - detalii subst., reactivi, standarde - procedee de verificare a calitatii standardelor, reactivilor - consideratii privind siguranta - criterii de validare a metodei - echipamente; cerinte privind functionarea si performatele lor - detalii privind conditiile de lucru - procedee statistice - procedee de control a calitatii - principalele reprezentari grafice (spectre, cromatograme) - limita de acceptabilitate - incertitudinea masuratorilor - criterii pentru revalidare - persoana care a validat metoda - concluzii

TEST
Determinarea vitaminei C: 20,23 20,03 20,13

19,85

20,15

deviatia medie patratica (s) deviatia medie patratica a mediei = eroare standard (sx) deviatia (abaterea, eroarea) standard relativa s/x (RSD), exprimata procentual = coeficient de variatie (CV) interval de incredereal mediei la 95% (m)

 Analiza statistica de multivarianta in validarea produselor

farmaceutice - numar mare de variabile independente (proprietati fizicochimice, tip de echipament utilizat, parametri operationali, ordinea etapelor procesului tehnologic) - numar mare de variabile dependente (forta de compresie duritatea si dizolvarea comprimatelor) - fiecare variabila studiata independent si exhaustiv timp, cost, lipsa de date privind interactiunile dintre variabile -regresia multipla - identifica relatii de legatura dintre variabilele independente si o variabila dependenta

- dezavantaj investigheaza pe rand cate o variabila dependenta

-analiza componentelor principale - identifica cele mai importante variabile (dependente) dezintegrare, duritate, dizolvare - tehnici grafice

BIBLIOGRAFIE:
Popa L., Elemente de metodologia cercetarii stiintifice in domeniul farmaceutic, ed. a II-a, Ed. Printech, Bucuresti, 2005. Roman L., Bojita M., Sandulescu R., Validarea metodelor de analiza si control, Ed. Medicala, 1998.

Boiculese L. V., Dimitriu G., Moscalu M., Elemente de biostatistica, analiza statistica a datelor biologice, Ed. PIM, Iasi, 2007.