24.

Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Staphylococcus

Stafilococii sunt coci gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalazopozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluznd mai multe specii). Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de: Staphylococcus aureus; S. epidermidis; S. saprophyticus. S. aureus reprezint specia cel mai frecvent implicat n clinic, n timp ce alte specii sunt nepatogene sau condiionat patogene. n funcie de capacitatea de a elabora coagulaz, toi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupai ca S. aureus. Stafilococii pot deveni patogeni i se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare i invazivitate, fie prin multiplicare i toxinogenez (fiind posibil i combinarea acestor mecanisme). Determinanii patogenitii la stafilococ includ produsele toxice i enzimatice. S. aureus este implicat ca agent etiologic ntr-o mare varietate de infecii supurative (cu puroi), ncepnd cu infeciile superficiale ale tegumentelor i mucoaselor i continund cu panariii, furuncule, abcese profunde, infecii ale diferitelor organe interne cu sau fr generalizarea infeciei. Pe de alt parte, ar fi de menionat toxinozele (datorate n special toxinelor elaborate) i anume toxiinfeciile alimentare, necroliza toxic a epidermului, sindromul de oc toxic etc. Toxiinfeciile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente n alimente n care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Stafilococii coagulazo-negativi (SCN) sunt implicai n infecii aprute dup manevre medico-chirurgicale care penetreaz bariera cutaneo-mucoas (cateterisme, implante, protezri intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infeciile tractului urinar i genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere). O infecie grav produs de SCN este enterocolita postantibiotice a nou nscutului (mai ales a prematurului, la care administrarea necontrolat a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecine grave). Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infeciile purulente ale tegumentelor i mucoaselor i ne vom referi numai la Staphylococcus aureus. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: secreii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (de puncie sinusal, otic, mastoidian, articular, peritoneal, pleural, pericardic), exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal, tampoane vaginale, lichid de vom, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaa cateterelor i a inseriilor iv. ale acestora. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz

prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor gram-pozitivi, cu diametrul de 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are n vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dac se recolteaz de ex. prin puncie-aspirare dintr-o colecie purulent profund i este foarte probabil contaminat cu flor de asociaie dac a fost recoltat dintr-o leziune superficial). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Stafilococii se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat (ex. pigment auriu). Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu snge pot produce hemoliz. Caractere biochimice: Stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manito-pozitiv) i SCN (manito-negativ). Stafilococii aurii sunt catalazo-pozitivi (vezi 12.5.B). Se poate face i testul fosfatazei. Exist sisteme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek etc). Caractere antigenice: Se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen i IgG care cupleaz coagulaza legat i proteina A (tehnici de aglutinare indirect). Caractere de patogenitate: Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi capitolul 12, punctul 12.7); pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnic de tip ELISA sau aglutinarea pasiv inversat (vezi i capitolul 11). Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la aciunea litic a bacteriofagilor a fost sistematizat pentru tulpinile de S. aureus ntr-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de referin. Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (n centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (studiul acizilor grai celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, hibridarea molecular, ribotipia). S-au dezvoltat tehnici rapide utiliznd truse de identificare i instrumente automatizate pentru evidenierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legat), a enzimelor elaborate n aliment sau lichidul de hemocultur (testul pentru termonucleaz) i a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Exist metode care utilizeaz markeri moleculari pentru evidenierea prezenei MRSA (stafilococ rezistent la meticilin) i pentru diferenierea intraspecific la S. aureus i SCN. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).