ANALIZA PROTEINELOR PLASMATICE

Proteinele reprezint componente eseniale ale materiei vii, structuri macromoleculare formate din aminoacizi unii ntre ei printr-o legtur peptidic (- CO NH -). Plasma sanguin conine un amestec extrem de complex de fraciuni proteice cu origine, structur, metabolism i funcii diferite. Proteinemia reprezint una din constantele umorale ale organismului, meninut prin complexe care realizeaz un echilibru dinamic ntre cantitatea de proteine sintetizate continuu de diverse organe (ficat, intestin) cea utilizat sau depozitat de diverse organe. Proteinele sunt mprite n dou mari clase: albumine i globuline i au roluri importante: n meninerea presiunii coloid-osmotice, de transport ale diferiilor metabolii, hormoni, vitamine; aprarea specific i nespecific a organismului; n meninerea echilibrului acido-bazic. 1. Dozarea proteinelor Metodele colorimetrice de determinare a proteinelor din ser se bazeaz pe proprietile compuilor cu legturi peptidice de a reaciona cu ionul de cupru n soluie alcalin, dnd sruri complexe de culoare violet. METODA BIURETULUI Reactivul biuret: - sulfat de cupru 1,5g; - tartrat dublu de Na i K 6g; - NaOH 30g n 200ml de ap; - iodur de potasiu 1g; - ap pn la 1000ml. Materiale necesare: - reactivi; - ser; - eprubete; - pipete. Mod de lucru: Se pipeteaz n dou eprubete: Proba Martor Ser 1 ml Ap distilat 1 ml Reactiv biuret 4 ml 4 ml Se agit, se las 10 minute la temperatura camerei. Se citesc extinciile de 540nm. Valori nominale: 6,5 8,2g/100ml (60-80g/l) Valori crescute: infecii acute sau cronice, hemoconcentraie, pierderi de ap (diaree, vrsturi, diabet insipid).

Valori sczute: insuficien hepatic, ciroz, sindrom nefrotic (edeme nefrotice), arsuri, anemii, hemoragii acute, enteropatii, malnutriie, malabsorbie, tumori maligne. 2. Albumine Se determin cantitatea absolut calculat din valoarea proteinemiei sau prin metode fotometrice; procentaj relativ din proteinogram. Valori normale: 55-65% din totalul proteinelor plasmatice, 34 - 48g/l. Valori sczute: insuficien hepatic, sindrom nefrotic, arsuri, inaniie, hemoragii, tumori maligne. 3. Globuline Se compun din aproximativ 60 de fraciuni proteice individuale, care au funcii foarte variate. Se determin cantitatea absolut calculat din valoarea proteinemiei, respectiv dozarea fraciunilor individuale (prin diferite metode: imunodifuzie, turbidimetrie, RIA, ELISA) sau procentaj relativ din proteinograma. La electroforeza n gel se grupeaz 5 fraciuni: 1, 2, 1, 2, globuline. Valori normale: 35-45% din totalul proteinelor, 30-40 g/l. Valori crescute: hepatit cronic, tumori maligne, sindrom nefrotic, inflamaii acute i cronice. Valori sczute: deficite imune, arsuri, hemoragii. La o scdere a albuminelor se observ o cretere a globulinelor i invers. De obicei la scderea albuminelor i creterea globulinelor se observ o cretere a vitezei de sedimentare a hematiilor (VSH). Fraciuni ale globulinelor: - 1-antitripsina glicoprotein cu molecul mic, de origine hepatocelular, care crete n microvasculite, tumori maligne, pielonefrit acut i scade n emfizemul idiopatic al copilului, sindrom nefrotic, insuficien hepatic; - Glucoproteina 1-acid reactant de faz acut, care crete n tumori maligne i scade n insuficiena hepatic; - 2-microglobulina - lan peptidic uor, crete n uremii, respingerea grefelor renale, tumori maligne, boli autoimune; - Ceruloplasmina este o 2-glicoprotein transportatoare de cupru, este un reactant de faz acut, care crete la infarct miocardic acut, anemii feriprive, Boala Hodgkin, tumori maligne i scade n boala Wilson; - Haptoglobina este o 2-glicoprotein cu origine hepatocelular, reactant de faz acut, fixatoare a hemoglobinei libere. Crete n tumori maligne, metastaze, icter mecanic i scade n anemii hemolitice, leziuni hepatice, mononucleoze infecioas; - Transferina este o -glicoprotein, fixatoare i transportatoare de fier. Valori crescute se ntlnesc n carena de fier, anemiile posthemoragice, n graviditate. Valori sczute sunt ntlnite n atransferinemia congenital, inflamaii acute sau cronice, sindromul nefrotic, insuficiena hepatic; - Imunoglobulinele care n cursul fracionrii electroforetice migreaz cu -globulinele; Proteina C-reactiv este un reactant de faz acut, care migreaz mpreun cu globulinele n cursul electroforezei. Are valoare normal sub 5mg/l i crete n inflamaii acute sau cronice, tumori maligne.

4. Electroforeza proteinelor Este metoda cea mai larg rspndit pentru screeningul disproteinemiilor. Electroforeza reprezint fenomenul de migrare al particulelor ncrcate electric dintr-o soluie sub aciunea unui cmp electric extern conform legii lui Coulomb. Pentru proteinele serice se aplic metode cu medii suport relativ inerte: hrtie de filtru, amidon, acetat de celuloz, agaroz. Agaroza se obine din agar, care este un extract de alge. Din punct de vedere chimic, agaroza este un copolimer liniar, cu unitatea repetitiv, agarobioza, format din beta-Dgalactopiranoz i 3,6-anhidro-alfa-L-galactopiranoza. n timpul gelificrii catenele de agaroz se asociaz formnd lanuri dublu-elicoidale cu simetrie triaxial. Supranfurarea catenei asigur rezistena crescut a gelului i porii relativ mari n care se pot separa particule cu un diametru de 20-50mm. Sub aciunea unui cmp electric uniform, ntr-un mediu tamponat, o particul ncrcat electric se va deplasa cu o vitez constant determinat de aciunea urmtoarelor fore: 1. Fora de atracie electroforetic F1, egal cu produsul dintre sarcina Q a particulei i intensitatea E a cmpului electric aplicat: F1 = Q x E 2. Fora de frecare Stokes F2, egal cu produsul dintre coeficientul de viscozitate dinamic a mediului (), raza particulei (r) i viteza electroforetic (v): F2 = 6 r v 3. Fora de frnare electroforetic, care rezult din atracia exercitat de cmpul electric asupra ionilor electrolitului. 4. Fora datorat efectului de relaxare, care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului n apropierea particulei sub aciunea cmpului electric. Suma vectorial a acestor fore este egal cu 0, iar viteza electroforetic v devine constant: v = Q E/6 r Particulele separate se vor caracteriza prin mobilitatea electroforetic (), care se definete ca raportul dintre viteza electroforetic (v) i intensitatea cmpului electric E: = v/E, = Q/6 r

Din aceast relaie se observ c particulele pentru care raportul Q/r este identic vor avea mobiliti electroforetice identice. Variaiile dimensiunilor particulelor sunt compensate de variaiile densitilor de sarcin electric superficial. Pe baza acestor considerente se poate afirma c mobilitatea electroforetic a proteinelor urmtorii factori: Mrimea, forma, sarcina electric, concentraia, gradul de hidratare al particulei, Vscozitatea, temperatura i pH-ul mediului, Fora ionic, Intensitatea cmpului electric,

Timpul de migrare.

n condiii obinuite, la pH alcalin, fraciunile proteice serice separate ntr-un gel de agaroz, n ordine de la anod spre catod, sunt urmtoarele: Albumina fraciunea care migreaz cel mai rapid spre anod, 1-globuline alctuite din 1-antitripsina, 1-glicoproteina acid, 1antichimotripsina, 2-globuline alctuite din 2-macroglobulina, haptoglobin, ceruloplasmin, -globuline factorul C3, transferina, fibrinogen, -globuline migreaz spre catod, fiind alctuite n principal din imunoglobuline. Fracionarea electroforetic necesit: 1. o surs de curent continuu i constant. 2. mediu sau suport de migrare, care trebuie s aib urmtoarele caracteristici: stabilitate chimic, neutralitate, inerie, stabilitate la variaiile de pH i temperatur, insolubilitate n anumii solveni. 3. Soluii tampon care s permit probei meninerea ntr-un pH bine determinat. Efectuarea electroforezei necesit un aparat alctuit dintr-un redresor (surs de alimentare) i camera de separare (camera de electroforez). Efectuarea metodei: Soluia tampon concentrat se dilueaz cu ap distilat i se introduc ~ 130ml n compartimentele aparatului de electroforez. Se aplic 0,5 l de ser cu ajutorul unei micropipete pe eantionul de aplicare. La 5 minute dup aplicarea serurilor resturile se ndeprteaz cu o hrtie de filtru. Dup o separare de 20 minute gelurile se introduc n soluia de fixare (timpul de fixare fiind de 10 minute). Apoi se usuc la 70oC, iar dup uscare se coloreaz. Decolorarea se face cu acid acetic 5% n dou bi succesive. Dup decolorare se spal cu ap i apoi se usuc pentru interpretare. Valori normale: - albumina 45-60% - 1-globuline 2,5-7% - 2-globuline 7-14% - -globuline 9-17% - -globuline 16-24% Interpretare: Dintre globulinele 1, 2, i , 1-antitripsina, 1-glicoproteina acid, haptoglobina, ceruloplasmina, transferina i C3 sunt proteine caracteristice reaciei de faz acut. Cel mai caracteristic marker al acestui fenomen biologic rmne concentraia CRP (proteina C reactiv), care poate crete de 100-1000 ori n 24 de ore. n sindromul nefrotic se observ o scdere a albuminelor i o cretere a 2 i globulinelor. n inflamaiile cronice este caracteristic creterea -globulinelor, n ciroza hepatic apare o hipoalbuminemie concomitent, precum i fuzionarea 2 cu -globulinele, datorit creterii concentraiei de IgA. n mielomul multiplu tehnica electroforetic este esenial pentru diagnosticul paraproteinei, care apare sub forma gradientului M (monoclonal) band ngust, de intensitate proporional cu concentraia proteinei monoclonale i care migreaz n zona , dar poate apare i n zona 2 i . De obicei electroforeza se efectueaz din ser, deoarece fibrinogenul care migreaz n zona 2, poate crea confuzii n diagnosticul paraproteinelor.

Deficienele severe de IgA (chiar i n lipsa deficienelor de IgA sau IgM) se pot evidenia prin scderea fraciunii a globulinelor.

Grafic normal

Grafic mielom multiplu