ODORANI, AROME, CONDIMENTE.

ANALIZ CALITATIV I CANTITATIV - laborator Dintre cele cinci simuri percepute de ctre om, mirosul este cel care se afl n permane activ tot timpul vieii. Cu toate acestea, organul olfactiv (nasul) i mecanismele de percepie a mirosului, sunt cel mai puin nelese. Mintea, asociat creierului uman, intercepteaz semnalele nervoase i secvenele acestora, probabil prin procese paralele fizice i chimice. Creierul este necesar, dar nu suficient, pentru realizarea percepiei. Cu ajutorul creierului se creaz o lume a senzaiilor de miros, a experienelor de miros sau a imaginaiilor de miros, deci se poate spune c mintea i creaz propria lume a senzaiilor, imaginilor i imaginaiilor. Cu alte cuvinte, aceasta nseamn c orice percepem n timp ce mirosim, gustm, atingem, auzim sau vedem, este doar un concept uman al acestor stri de fapt. O exemplificare concludent a acestor afirmaii este cea din figura de mai jos, care reprezint un set de puncte neregulate, albe i negre. Privind imaginea din punct de vedere neutru, semnalele din minte sunt interpretate n creier n funcie de structura perceput momentan. El poate mai nti s vad o tnr doamn sau, dac structura sa perceptiv este diferit, s vad o doamn btrn. Cu alte cuvinte, subiectul i creaz, n timpul percepiei, fie imaginea unei tinere, fie a unei btrne din setul neregulat de puncte.

Arome i Odorani Lucrri de laborator

Figura 1. Exemplificarea structurii perceptive momentane.

Senzaia de miros apare ca urmare a stimulrii unor receptori ai celulelor olfactive cu vectori moleculari numii odorani. Odoranii sunt substane chimice naturale, semisintetice sau sintetice, produse i utilizate pentru mirosurile lor. Odoranii naturali sunt obinui din materii prime de origine vegetal sau animal, cei semisintetici sunt compui chimici obinui prin modificarea chimic a unor produse naturale, iar odoranii sintetici sunt compui chimici care nu se gsesc n stare natural, fiind obinui pe cale exclusiv chimic. Aroma este un ansamblu complex de senzaii gustative i olfactive percepute la degustarea unui produs alimentar i detectate de receptorii chimici din regiunea buconaso-faringian. Un compus sau un amestec de compui naturali sau sintetici care, adugai produselor alimentare, le confer o arom specific, se numesc aromatizani. Aroma poate fi natural, reconstituit i artificial. Aroma natural este compus numai din substane aromatizante naturale, n timp ce aroma reconstituit este un amestec de substane aromatizante i / sau identic naturale, a crui compoziie corespunde aproximativ aromei naturale, fr alte adaosuri i n proporii similare aromei naturale. Aroma artificial este aroma care conine una sau mai multe componente aromatizante. Condimentele (mirodeniile) sunt substane sau produse vegetale aromatizante utilizate pentru asezonarea alimentelor, din care nu au fost ndeprtate nici uleiul volatil i nici principiile aromatizante. Cea mai important clas de condimente este cea a condimentelor naturale rezultate din diferite pri ale plantelor: fructe, semine, flori, frunze, scoar, rizom. O descriere detaliat a mecanismului molecular de percepie a mirosului este prezentat n figura 2. Transducerea olfactiv (n sensul transferului energetic n sistemul olfactiv) este procesul prin care fenomenele din mediul fizic nconjurtor devin reprezentate ca activiti electrice n celulele nervoase senzoriale. Fotoreceptorii i celulele receptoare olfactive funcioneaz n mod similar, prin aciunea unui stimul (foton, respectiv odorant) asupra proteinei receptoare de la suprafaa celulei receptoare. Recunoaterea odorantului este realizat de ctre aceste proteine receptoare aflate la suprafaa membranei celulare. Odoranii sunt captai undeva ntre cele apte segmente transmembranare ale proteinei receptor de pe suprafaa celulei i determin o modificare conformaional n acest complex receptor - molecul, ce determin un lan de fenomene moleculare denumit cascad enzimatic, asemntor fotoreceptorilor care prezint, de asemenea, apte segmente transmembranare i necesit acelai tip de cascad. Receptorul olfactiv determin o modificare n proteina G (figura 2b), de care este legat, cauznd transformarea guanozin-trisfosfatului (GTP) n guanozin-bisfosfat (GDP) n proteina G. n acest stadiu, proteina G activ difuzeaz de la molecula receptor i pornete o secven de ciocniri intermoleculare n membrana celular. Cnd are loc contactul cu proteina efector E, aceasta se leag pentru a forma o protein activat, E*, adeninilciclaza (AC), enzim ce catalizeaz sinteza unei molecule mesager citoplasmatice,

Arome i Odorani Lucrri de laborator

ciclic adenozin-monofosfatul (cAMP). Modificarea rezultat n concentraia nucleotidei ciclice din celul determin creterea probabilitii de deschidere a canalelor membranare. Aceste nucleotide ciclice deschiztoare de canale din celulele receptoare olfactive sunt omoloage structural cu cele gsite n fotoreceptorii din retin, ilustrnd astfel un alt aspect comun al mecanismelor celor dou sisteme senzoriale. n celulele olfactive se cunoate ns i o cale secundar, separat, de transducere a evenimentului olfactiv, n care proteina G activeaz o protein efector diferit, inozitol-trisfosfatul (IP3), determinnd eliberarea calciului intracelular din matricea citoplasmatic, ceea ce moduleaz trecerea prin canalul de ioni. Mecanismele Odorant (a) ce Mucus implic IP3 sau adeninil-ciclaza sunt caracteristice diferitelor familii de situsuri receptoare de odorani din celulele receptoare. Cili
Cil

Celul subtentacular Neuronul receptor olfactiv (ORN) Celula bazal Axonul ORN Celula Schwann

Glanda Bowman

(b)

Molecule odorante

Membran ciliar

Figura 2. (a) Ilustrarea schematic a epiteliului olfactiv, cu principalele tipuri de celule i glanda Bowman de secreie a mucusului. n detaliu se prezint o protein receptor cu apte domenii transmembranare (7TM) localizate pe un cil al celulei receptor; (b) Reprezentarea fenomenelor implicate n cele dou mecanisme de transducere: unul ce implic activarea de ctre proteina G a adeninil-ciclazei (AC) ce genereaz AMP ciclic (cAMP), i altul ce implic activarea fosfolipazei C (PLC) pentru a genera inozitol-trisfosfatul (IP 3). Aceti mesageri secundari deschid canalele de ioni permind ionilor de calciu (Ca 2+), sodiu (Na+) i clor (Cl-) s

Arome i Odorani Lucrri de laborator

ptrund n celul, conducnd astfel la depolarizarea membranei i apariia unui potenial de-a lungul axonului celulei spre bulbul olfactiv de la baza creierului.

Rezultatul final este acelai: membrana celular este depolarizat printr-un schimb de ioni de sodiu, potasiu, calciu i clor, prin intermediul canalelor. Acest deranjament ionic, dac este suficient de mare, determin o descrcare la int (impuls nervos) la trecerea prin axonul celulei olfactive la prima sinaps a bulbului olfactiv. n aceti cureni de impulsuri nervoase, ce trec din epiteliul nazal n arhitectura neural complex a bulbului olfactiv i mai departe n sistemul nervos central, se gsesc toate informaiile de baz de care are nevoie sistemul privind concentraia i calitatea odoranilor. n creier, informaia olfactiv este transformat ntr-o experien senzorial unic, ce creeaz i evoc nume, locuri i sentimente din memorie, asociind experiena curent cu experienele anterioare relativ la aceast problem. Putem spune, de exemplu, c miroase ca i cafeaua sau mi amintete de buctria bunicii . Atribuim astfel un nume sau o clasificare setului complex de date olfactive. Obinerea unei clasificri potrivite ntr-un sistem artificial necesit vitez i capacitate eficiente pentru prelucrarea datelor neliniare spaio - temporale; uneori, arhitectura neural a omului face acest lucru foarte bine. Alteori, pentru atingerea acestui deziderat este necesar o tehnologie bazat pe reele neuronale artificiale, sau proiectarea unor noi modele de sisteme neuronale olfactive, ceea ce ne conduce la o nou modalitate mecanizat complex de recunoatere olfactiv. Se cunoate c proteinele receptoare olfactive sunt capabile s recunoasc un numr foarte mare de odorani, probabil peste 10000 la om. Diversitatea genetic a familiei receptorilor olfactivi are potenialul de a genera un mare set de receptori pentru odorani, suficient pentru a recunoate fiecare compus odorant la care poate rspunde omul. Nu se cunoate nc dac exist un singur receptor pentru fiecare odorant, dar se tie aproape sigur c exist un numr mare (poate 1000) sau chiar foarte mare (poate 10000) de astfel de receptori, care fac posibile rspunsurile la fiecare odorant. Dac nu exist un receptor specific pentru fiecare compus odorant n parte la care apare un rspuns din partea omului sau animalelor, atunci un receptor trebuie s rspund la mai muli odorani diferii. Receptorii olfactivi i/sau creierul trebuie atunci s posede mecanisme compensatorii pentru a discerne ntre un miros i altul. Codarea informaiei olfactive n mucoasa nazal de ctre toate celulele sau aranjamentele celulare, sau prin formele de activitate spaio - temporal din neuronii bulbului olfactiv, ofer alternative de abordare a posibilitilor de recunoatere a domeniului extins acoperit de moleculele odorante, mai comode dect n cazul unui singur receptor pentru fiecare tip de molecul. Proteinele de legare a odoranilor (OBP - Odorant-Binding Proteins). OBPurile se aseamn cu proteinele de transport ce se gsesc n ficat i sunt excretate prin urin, i fac parte din aceeai familie a proteinelor cunoscute sub numele de lipocaine. Ele sunt produse n cantiti mari de elementele glandulare din cavitatea nazal. Secreiile acestor glande sunt splate constant, astfel c mucusul se deplaseaz din fa spre spatele nasului. OBP-urile sunt solubile i au o greutate molecular mic, iar

Arome i Odorani Lucrri de laborator

fiecare molecul leag mai multe tipuri de odorani. Ele funcioneaz pe postul de transportori ai odoranilor hidrofobi prin mediul apos ctre receptori. Ele au fost gsite n concentraii mari n mucusul nazal al mamiferelor. Enzimele de degradare a odoranilor (ODE Odorant-Degrading Enzimes). ODE-urile reprezint o alt form de protein solubil ce se gsete n mucoasa olfactiv. Sistemul olfactiv deine un mecanism eficient de curare a odoranilor i feromonilor inhalai, muli dintre ei fiind toxici n cantiti mari. Nasul se detoxific singur n mod continuu, timp n care se pregtete pentru identificarea i cuantificarea unei cantiti proaspete de odorani. Acest lucru se realizeaz cu ajutorul unor enzime de tipul celor gsite n concentraii similare n ficat (de exemplu, citocromul P450). Aceste enzime degradeaz odoranii i i fac ineficieni ca stimuli chimici, dar nu joac nici un rol n stimularea receptorilor. ODE-urile pot, de asemenea, s posede proprieti de amplificare a intensitii efective a odoranilor slabi, prin facilitarea unui drum pentru acetia spre receptori. Ele pot s atenueze n acelai mod efectul odoranilor puternici, prin reducerea numrului de molecule odorante funcionale n timpul tranzitului acestora prin mucus spre receptor. Interaciunile dintre miros i gust pot rezulta ca urmare a unor efecte fizice, fiziologice, cognitive sau psihologice. Efectul compuilor nevolatili i a matricii alimentare asupra concentraiei volatilelor aromatizante a fost foarte mult studiat i este necesar s se ia n considerare n orice studiu privind interacia dintre gust i arom. Se cunoate faptul c srurile sau acizii mresc concentraia n volatile nepolare pentru notele de vrf, astfel c este de ateptat ca intensitatea unor compui aromatizani selectai s creasc n condiiile n care volatilele sunt percepute prin mirosire (percepia ortonazal). Pe de alt parte, la ingerarea sau mestecarea unor probe alimentare au loc modificri fizice ale stimulilor existeni, ce afecteaz viteza de eliberare i concentraia compuilor gustativi i odorani. Cum matricea alimentar este este distrus, are loc eliberarea celor dou tipuri de compui i amestecarea cu saliva. Aceste fenomene perireceptoriale (apar naintea interaciunii cu receptorii gustativi) afecteaz partiionarea, difuzia i transportul compuilor gustativi n mucoasa din cavitatea oral i distribuia lor la receptorii gustativi. Similar, la distrugerea matricii alimentare i interaciunea cu saliva rezult eliberarea i distribuia volatilelor ntre cavitatea oral superioar i saliv. Volatilele din spaiul superior al gurii pot trece apoi retronazal spre receptorii olfactivi. Percepia mirosului i a aromei, precum i interaciunile acestora, sunt influenate de mai muli factori psihologici. Totui, distincia dintre efectele psihologice i cognitive este greu de fcut, combinaiile specifice dintre odorani i compuii gustativi influennd percepia stimulilor din alimente. Este periculos ns s se generalizeze prea mult unele observaii experimentale fcute n direcia nelegerii interaciunilor ce apar ntre miros i gust. Nasul electronic (eNOSE). De-a lungul ultimilor ani un interes deosebit l-a avut folosirea procedeelor electronice pentru sesizarea aromei alimentelor. Se pretinde c acestea opereaz n manier similar, n anumite privine, cu sistemul olfactiv uman (figura 3).

Arome i Odorani Lucrri de laborator

Descoperirea sistemelor de tip nas electronic ( electronic NOSE - eNOSE) devenise o necesitate n ultimii ani pentru industria alimentar, deoarece astfel de sisteme permit caracterizarea mirosului a peste zece produse pe or cu o precizie medie, fr a mai fi nevoie de paneluri senzoriale umane sau de costisitoarele metode analitice sau interpretare a datelor (din punct de vedere temporal). n sistemul de producie practic, aceasta nseamn introducerea unei probe n cutia neagr - nasul electronic - i obinerea rapid a clasificrii produsului.
Nasul uman
Bulbul olfactiv Celula mitral Reea neuronal

Nasul electronic

Recunoaterea formelor

Axoni olfactivi Receptori olfactivi

Senzori
Plaj de senzori chimici

Odorant

Figura 3. Structurile de baz ale nasului mamiferelor i electronic.

Tehnologiile curente ce folosesc eNOSE pot fi definite cel mai corect ca senzori de miros, dar acestea nu trebuie confundate cu gaz-cromatograful sau analiza senzorial. Similar sistemului senzorial uman, aceste sisteme de detecie a mirosurilor incorporeaz senzori (conceptual analogi receptorilor olfactivi umani) i un sistem de procesare a datelor (care simuleaz creierul uman). Asemntor omului, nu este nevoie s se identifice fiecare constituient al unui miros pentru a-l recunoate, astfel c eNOSE opereaz prin recunoaterea formei componenilor. Gardner i Bartlett definesc eNOSE ca un instrument care include o plaj de senzori chimico-electronici cu specificitate parial i cu un sistem de recunoatere a formelor corespunztor, capabil s recunoasc mirosuri simple sau complexe. Totui, la ora actual, sistemele de acest tip nu reuesc performanele sistemului uman de percepie. Din acest motiv s-au folosit, pentru aceste sisteme, i alte denumiri mai mult sau mai puin legate de olfacia uman: senzor de arom, senzor de miros, senzor de gaz etc. Clasificarea mirosurilor a fost o problem creia i s-a dat diverse soluii de-a lungul timpului, ns fr a se ajunge la un consens. Principiul clasificrii cu clase disjuncte este acela al gsirii unor relaii de echivalen ntre elementele unei clase (o relaie reflexiv, simetric, tranzitiv). Relaia cea mai general aplicabil mirosurilor este ns o relaie de asemnare, creia i lipsete tranzitivitatea. O asemenea relaie nu este adecvat unei clasificri n clase disjuncte. Prima clasificare, neglijndu-le pe cele

Arome i Odorani Lucrri de laborator

de importan istoric (Aristotel, 350 .Hr.; Linn, 1756), a fost propus de Zwaardemaker n 1895 i era constituit din nou mirosuri fundamentale: 1. Aromatic (camfor, anason, lmie, condimente) 2. Eterat (esteri din fructe, miere) 3. Balsamic i floral (rezine) 4. Ambr, mosc 5. Empireumatic (fum) 6. Usturoi, ceap, iod 7. Brnz, transpiraie 8. Respingtoare 9. Greoase Crocker i Henderson au ncercat o clasificare pe baza a patru caliti: floral, acid, pirogenic, caprilic, atribuind fiecrui odorant un numr format din patru cifre ntre 1 i 8, corespunztoare caracterului de miros fundamental ce intr n compoziie. De exemplu, vanilia era cuantificat prin 7122, iar guaiacolul prin 7584. De larg circulaie n parfumerie s-a dovedit clasificarea lui Billot n clase i subclase de mirosuri:
1. Seria floral 1.1. Trandafir 1.2. Iasomie 1.3. Zambile 1.4. Liliac 1.5. Flori de portocal 1.6. Tuberoze 1.7. Violete 1.8. Reseda 4. Seria balsamic 4.1. Vanilie 4.2. Rin de olibanum 4.3. Rin de galbanum 4.4. Rezinic 7. Seria empireumatic 7.1. Fum 7.2. Tutun 2. Seria lemnoas 2.1. Mirodenii (piper etc.) 2.2. Santal 2.3. Cuioare 3. Seria rustic 3.1. Ment 3.2. Camfor 3.3. Ierbaceu 3.4. Verde 3.5. Licheni 3.6. Legume

5. Seria fructat 5.1. Aldehide 5.2. Migdale 5.3. Anason 5.4. Fructe (mere, pere) 5.5. Ciocolat 8. Seria respingtoare 8.1. Brnz 8.2. Usturoi 8.3. Pete 8.4. Ou clocite 8.5. Rnced 8.6. ap 8.7. Mucegai 8.8. Piridin 8.9. Mercaptan 8.10. Anilin

6. Seria animalic 6.1. Mosc 6.2. Castoreum 6.3. Scatol 6.4. Alge (marin) 6.5. Ambr 9. Seria comestibil 9.1. Unt 9.2. Pine

Arome i Odorani Lucrri de laborator

Dezavantajul acestui sistem de clasificare este c el cuprinde elemente arbitrare i nu reflect relaiile dintre diferitele clase (suprapuneri). n unele sisteme se reflect relaiile de apropiere, respectiv suprapunerile dintre clase. Larg utilizat este discul mirosurilor, n care se admite c clasele de mirosuri reprezenatte prin cercuri se suprapun, fiind posibile substane cu mirosuri combinate din dou clase vecine sau chiar deprtate. Dup Steiner (1980), acest disc arat ca n figura 4a.
fructat citric

floral picant fenolic animalic balsamic

aldehidic verde ierbaceu lemnos

licheni
(a)

coniferic

eterat fructat verde ierbaceu conifere fenolic licheni lemnos balsamic animalic
(b) Figura 4. Discul mirosurilor (a) i o hart a mirosurilor (b).

citric floral aldehidic

picant

mentolat eucalipt

Clasele apropiate grafic sunt apropiate i din punct de vedere al mirosului. n partea superioar sunt reprezentate notele luminoase, iar n partea inferioar notele grele. Se apreciaz c pentru obinerea unei aromatizri este necesar amestecarea unor componente din trei direcii diferite, care s reprezinte un triunghi ct mai apropiat de unul echilateral.

Arome i Odorani Lucrri de laborator

Totui, relaiile dintre clasele de odorani sunt mult mai complexe dect cele redate de discul mirosurilor. S-a propus utilizarea unei hri a mirosurilor (figura 4b), n care relaiile dintre clase (note) s fie redate mai complet. Fundamentele comunicrii n cmpul mirosului se bazeaz pe o terminologie a mirosului mai mult sau mai puin tiinific. n multe cazuri cercettorii se gsesc n dificultate atunci cnd vor s stabileasc o codificare pentru miros. Recunoaterea i caracterizarea tonalitilor de miros au o baz psihologic, astfel c exist dou metode subiective de stabilire a acestora. Descrierea calitativ a profilului unui miros poate fi obinut prin compararea direct cu o serie de odorani cunoscui luai drept model i ntr-un mod semantic. Ambele proceduri conduc la profiluri multidimensionale ale mirosului, ce depind de compuii de referin selecionai sau de descriptori obinui semantic. Utiliznd procedeul referinei, un chimist poate avea o imagine molecular a corelrilor cantitative dintre structur i miros. Pentru clasificarea unui miros necunoscut compuii sunt aezai n proximitatea mirosurilor standard ntr-o hart multidimensional, dup o prelucrare matematic a datelor obinute. Una dintre metodele cele mai folosite n acest sens este analiza clusterelor (cluster analysis), ce permite identificarea familiilor de miros i a structurilor chimice corespunztoare. Procedeul semnatic este preferat ndeosebi de parfumeri, degusttori de vin, ceai i cafea, ca i de aromaticienii din industria alimentar, cnd se obine o bun clasificare a mirosurilor. Evaluarea cantitativ a percepiei mirosului i pragurile de detecie. Lumina poate fi att de slab nct s nu poat fi distins n ntuneric, un sunet aa de slab nct s nu poat fi auzit, o atingere att de fin nct s nu o putem simi. Cu alte cuvinte, este necesar o cantitate finit a unui stimul extern pentru a produce o senzaie care si releve prezena. Aceasta se numete legea lui Fechner a pragului de detecie ceva ce trebuie etapizat ascendent pentru a putea fi perceput mental (William James, 1913) The American Society for Testing and Materials (ASTM) propune urmtoarea definiie care s prind esena conceptului de prag de detecie pentru simurile chimice: un domeniu de concentraie sub care mirosul i gustul unei substane nu poate fi detectat n nici o circumstan practic, i peste care orice individ cu simuri normale pentru miros i gust va detecta prezena substanei ( ASTM Method E 679 79, 1991). Sensibilitatea fa de odorani la om variaz de la individ la individ i depinde de condiiile fiziologice, psihologice i patologice ale acestuia. S-a observat c femeile prezint o sensibilitate olfactiv mai mare dect brbaii, pentru toate vrstele, ambele

Arome i Odorani Lucrri de laborator

10

sexe atingnd cea mai mare sensibilitate dup pubertate, sensibilitate ce scade considerabil dup 70 de ani i dramatic dup 80. Exist unele corelri ntre percepia mirosului i condiiile endocrinologice ale corpului (estrogenii cresc sensibilitatea la odoranii moscai, n timp ce androgenii o micoreaz). O pierdere temporar a percepiei mirosului poate s apar n timpul graviditii. La majoritatea oamenilor (62.4%) poate s apar o pierdere temporar a mirosului ca urmare a frigului sau infeciei sinusului, iar 1.2% din populaie prezint anosmie total. La stimularea simurilor un timp mai ndelungat poate s apar un proces de desensibilizare, cunoscut ca adaptare la miros sau oboseal olfactiv, a crei vitez de apariie depinde de concentraia i de structura odorantului. Scderea specific a percepiei mirosului dup adugarea unui al doilea odorant se numete adaptare ncruciat (benzaldehida reduce mirosul pentru nitrobenzen i acetofenon). Blocarea unui miros specific poate avea consecine practice pentru analiza senzorial a amestecurilor de odorani. Cea mai mic concentraie detectabil a unui odorant este numit valoare de prag (threshold value). Pragul de detecie absolut reprezint diferena detectabil a unui compus n soluie funcie de solventul pur, n timp ce pragul de recunoatere corespunde concentraiei ce permite o identificare a calitii mirosului pentru un compus i, de obicei, este mult mai mare dect pragul de detecie. Valorile msurate n aer sunt, de obicei, cu cteva ordine de mrime mai mici dect cele obinute n ap. Valorile de prag n aer sunt msurate folosind olfactometrele comerciale sau sniffing-ul standardizat pe un gaz cromatograf. Pentru determinarea acestor valori n ap panelitii testeaz perechi de probe n recipiente de sticl. O prob conine solventul pur (apa), iar cealalt compusul n concentraia dat. Concentraiile se situeaz n general n jurul minimului perceptibil al stimulului. Este testat fiecare prob relativ la solvent, iar pragul corespunde concentraiei ce produce o frecven de 50% de alegeri corecte. Exist mai multe metode utilizate pentru determinarea pragudrilor de detecie: alegerea forat ascendent (ascending forced chioce), procedee alternative (diferena relativ, detecia semnalului), analiza diluiilor. La nceputurile psihofiziologiei cea mai potrivit metod pentru msurarea pragurilor de detecie a fost metoda limitelor. n acest procedeu, intensitatea stimulului este mrit pentru o serie ascendent i apoi micorat pentru una descendent pentru a detecta punctul la care rspunsul observatorului se modific de la unul negativ la unul pozitiv, respectiv de la unul pozitiv la unul negativ, ns aceast metod prezint dezavantajul apariiei oboselii i adaptrii senzoriale. Elementul de alegere forat combin metoda limitelor cu testele de discriminare. Un alt procedeu practic pentru estimarea pragurilor de detecie este cel ce utilizeaz scrile de diferene relative, unde probele ce conin stimulul ce urmeaz a fi recunoscut sunt comparate cu anumii stimuli de control sau blank (nul). Analiza diluiilor reprezint un grup de metode utile n conceptul pragului de detecie ce ncearc s determine impactul senzorial al diferitelor materiale odorante i aromatizante. Un prim grup de metode determin potenialul olfactiv al compuilor aromatizani olfactivi aa cum se gsesc ei n alimente i extracte alimentare. Aceste

Arome i Odorani Lucrri de laborator

11

metode permit determinarea att a pragului de miros ct i a concentraiei actuale prezente n proba alimentar. Raportul acestor concentraii (concentraia actual fa de pragul de detecie) indic, pentru un compus aromatizant dat, contribuia acestuia la impresia senzorial total a unui aliment. Aceast abordare este cunoscut sub denumirea de uniti de miros. Cea de-a doua metod este similar principial i a fost dezvoltat pentru determinarea punctului n care este pentru prima dat detectabil senzaia iritant sau neptoare a compuilor piperai la diluri succesive ale probei (procedeul Scoville). Ambele metode utilizeaz apoi diluarea la pragul de detecie ca o msur a impactului senzorial. Procedee statistice n analiza senzorial. Cele mai multe metode matematice i statistice utilizate pentru stabilirea unor relaii structur - activitate (SAR i QSAR) au n vedere similaritile dintre compuii studiai. Prin recunoaterea formelor (PARC - PAttern ReCognition) se nelege n mod obinuit acel ansamblu de metode i tehnici cu ajutorul crora se poate realiza o clasificare n cadrul unei mulimi de obiecte, procese sau fenomene. Scopul recunoaterii formelor const n determinarea clasei din care face parte o colecie de variabile, iar conceptul fundamental al acesteia este: un obiect sau un fenomen variabil, Xj, este descris (caracterizat) printr-un set de n caracteristici, xij ( i =1, n ). Toate aceste n caracteristici ale unui obiect alctuiesc o form. Mulimea X ={ X j } j = 1, m poart denumirea de spaiul formelor. Prin urmare, un obiect (form) X poate fi reprezentat printr-un punct X(x1, x2, ... , xn) n spaiul formelor. Pentru o descriere mai simpl vom presupune c pentru fiecare obiect Xj sunt cunoscute doar dou caracteristici (msurtori), fie acestea x 1j i x2j. n acest caz obiectul poate fi reprezentat printr-un punct ntr-un sistem de coordonate Carteziene bidimensional; spaiul formelor este un plan, caracteristicile reprezint axele de coordonate, iar valorile numerice ale caracteristicilor sunt utilizate drept coordonate. O reprezentare echivalent este vectorul Xj, care poart denumirea de vector de form (figura 5). n PARC, i aceasta este valabil pentru absolut toate metodele care constituie acest domeniu, se presupune faptul c obiectele sunt similare - n raport cu o anumit proprietate - deci se grupeaz mpreun n spaiul formelor, dnd natere unor domenii distincte.
x2

x2j Xj

Xj(x1j,x2j)

x1j

x1

Figura 5. Un obiect caracterizat prin dou msurtori x1j i x2j, reprezentat n spaiul bidimensional al formelor printr-un punct Xj de coordonate (x1j, x2j) sau prin vectorul de form Xj.

Arome i Odorani Lucrri de laborator

12

n practic este necesar un spaiu al formelor cu mai mult de dou dimensiuni (n > 2). Gruparea formelor n domenii distincte ntr-un hiperspaiu n-dimensional nu mai este reprezentabil grafic i este mai dificil de imaginat. n acest caz tehnicile PARC se dovedesc deosebit de utile. Raportul dintre numrul de forme (obiecte) luate n considerare, m, i numrul de dimensiuni (caracteristici) al spaiului formelor, n, trebuie s fie mai mare dect 10 n aplicaiile concrete ale tehnicilor PARC. n cazul n care numrul de forme este apropiat de numrul de caracteristici, atunci discriminarea dintre forme i atribuirea lor la diferitele clase posibile este un proces pur aleator. Pentru rezolvarea problemelor PARC au fost propuse i utilizate o mare varietate de tehnici matematice din teoria informaiei, statistic matematic, teoria deciziei, geometrie etc. Acest ansamblu de metode matematice poate fi mprit n dou categorii, din punct de vedere al modului de abordare: - abordare statistic (decizional - teoretic); - abordare sintactic (lingvistic). n primul caz exist dou tipuri de recunoatere a formelor: recunoaterea controlat - care presupune un set de forme a cror apartenen la clase este cunoscut i care este mprit n setul de formare i setul de predicie - i recunoaterea necontrolat - care nu necesit o cunoatere prealabil a apartenenei formelor la clase, ci dezvolt algoritmi (tehnici de grupare) care, n cursul execuiei, permit construirea claselor pe msur ce formele analizate sunt luate n considerare. Datele dintr-o problem PARC sunt organizate n una sau dou matrici (figura 6): - matricea X, care concare conine variabilele independente ce caracterizeaz structura obiectelor (compuilor); - matricea Y, ce conine variabilele dependente (activitatea biologic). ntr-o prim faz, metodele PARC caut reguli de clasificare a compuilor (ce rezult din setul de formare). n cea de-a doua faz regulile obinute sunt utilizate pentru clasificarea de noi compui, predicia de proprieti biologice pentru compui dai etc.
1 2 12

Matricea X ......... k ............... p

Clasa
1

12

Matricea Y ... m ...... q

1 2

: : : i : : : n

: : : :

: : : g : : : G

: : : :

: : : i : : : n

Set de formare
+

Set de predictie

Set test Figura 6. Datele dintr-o problem general PARC.

Arome i Odorani Lucrri de laborator

13

Analiza discriminant liniar i maina care nva. Analiza discriminant liniar (LDA - Linear Discriminant Analysis) i maina care nva (LLM - Linear Learning Machine) sunt utilizate, de regul, pentru clasificri binare (agonist antagonist, activ - inactiv). Formele dintr-un hiperspaiu n-dimensional sunt separate printr-un hiperplan de dimensiune n-1. Funcia discriminant este pozitiv pentru membrii unai clase i negativ pentru membrii celeilate clase (figura 7).
x3

+ + + +

+ + + + -

+ + + + + + +

x1

x2

Figura 7. Metoda LDA pentru un spaiu tridimensional.

Cei mai apropiai k-vecini. Cei mai apropiai k-vecini (KNN - K-Nearest Neighbour) este o metod PARC ce se bazeaz pe evaluarea apartenenei formelor la clasele respective din care fac parte n funcie de distana dintre acetia i cei mai apropiai k-vecini (de obicei k = 1,3). Constituie o dezvoltare a variantei mai simple conform creia o form se consider c aparine acelei clase n care exist vecinul cel mai apropiat al formei necunoscute (figura 8).
x3

+ + + +

+ + + + -

+ + + + + + +

.
x1

x2

Figura 8. Exemplificarea metodei KNN pentru spaiul tridimensional.

Metodele Bayes. n metodele Bayes se calculeaz pentru fiecare clas o funcie de densitate de probabilitate din care se calculeaz apoi domeniile de confiden pentru fiecare clas de care ar trebui s apain formele necunoscute. De regul se asociaz noua form clasei cu probabilitatea cea mai mare. Un exemplu de reprezentare tridimensional (trei caracteristici independente ale formelor, x 1, x2, x3) al metodelor Bayes este prezentat n figura 9.

Arome i Odorani Lucrri de laborator

14

x3

+ + + + + ++ + + + +

-- -

x1

x2

Figura 9. Metoda Bayes pentru un spaiu 3D.

Metoda SIMCA. Metoda SIMCA presupune construirea unui model pentru fiecare clas din setul de formare. n exemplul din figura 10 pentru fiecare clas din setul de formare s-a obinut cte o drept n jurul creia s-a construit o regiune de toleran pe baza mprtierii punctelor din setul de formare. Noii compui sunt clasificai prin evaluarea distanelor la clasele respective. Metoda prezint avantajul c este aplicabil pentru matrici X i Y de orice dimensiuni.
x3

+ + + ++ + + + + + +

- - - - -

x1

x2

Figura 10. Exemplificarea metodei SIMCA pentru spaiul tridimensional.

Proceduri de grupare ierarhic. Procedurile de grupare ierarhic (HCA Hierarchial Cluster Analysis) acioneaz asupra matricii triunghiulare de distane dintre perechile de forme, Xi i Xj, considerate ca puncte din spaiul formelor. Se caut cea mai mic distan dintre dou forme dup care acestea se unesc ntr-o nou form situat la jumtatea distanei dintre formele iniiale (n centrul de greutate al perechii de forme care a generat-o). Rezultatul procesului de grupare se prezint, de obicei, printr-o dendogram n care se prezint conectarea punctelor corespunztoare formelor, ca i distana minim gasit (pe ordonat) pentru fiecare pas de grupare (figura 11).

Arome i Odorani Lucrri de laborator

15

x2 *
1 4 5

h1 * *

R+ a4

Spatiul spatiul *
2

h2 h3 h4

a3 a2 a1 a0

x1 1 2 3 4 5 Figura 11. Exemplu de grupare ierarhic a cinci faze dintr-un spaiu bidimensional (hi - elementele ierarhiei; ai - proiecia lui hi pe segmentul R+).

Reele neuronale. Utilizarea reelelor neuronale n clasificarea moleculelor bioactive (relaii structur - activitate) este de dat recent. Reelele neuronale (NN - Neural Networks) sunt sisteme artificiale ce simuleaz funcionarea creierului uman i care conin un numr foarte mare de neuroni interconectai care prelucreaz informaia. Aceste sisteme pot rezolva probleme ce implic date imprecise sau cu zgomot mare, ca i probleme cu un nalt grad de complexitate sau neliniare. Reelele neuronale pot identifica i nva formele corelaionale dintre seturile de date de intrare i valorile int corespunztoare. O reea neuronal trebuie antrenat prin introducerea repetat a datelor de intrare i a valorilor de ieire corespunztoare. Dup acest proces, reeaua neuronal este iniiat pentru recunoaterea relaiei dintre datele de intrare i de ieire i crearea unui model intern care s guverneze procesarea datelor. Astfel, reeaua neuronal poate folosi acest model intern pentru predicia de noi compui. Aspectul matematic al problemei este mult prea complicat i nu-i are locul n aceast prezentare. El presupune aspecte de neurodinamic, optimizare combinatorial, sisteme cu autoorganizare pentru nvare supervizat i nesupervizat, etc. Schema general a unei reele neuronale artificiale cu propagare n urm (BANN - Back Propagation Artificial Neural Network) cuprinde (figura 12):
INPUT LAYER, In[i], (stratul de intrare), este obinut din variabilele de

intrare pentru fiecare form, i =1, ; W[i,j], matricea cantitilor dintre straturile de intrare (INPUT) i ascuns (HIDDEN); HIDDEN LAYER, H[j], (stratul ascuns), reprezint variabilele calculate pornind direct de la In[i] la matricea W[i,j], j =1, m ; W[j,k], matricea cantitilor dintre straturile de ieire (OUTPUT) i ascuns (HIDDEN); OUTPUT LAYER, O[k], (stratul de ieire), este realizat din variabilele de ieire pentru fiecare form, k =1, m ;

Arome i Odorani Lucrri de laborator

16

BIAS 1

BIAS 2

INPUT W[i,j] HIDDEN W[j,k] LAYER LAYER

OUTPUT LAYER

Figura 12. Schema general a unei reele neuronale artificiale cu propagare n urm (BANN).

Analiza componentelor principale (PCA). Analiza componentelor principale (PCA - Principal Component Analysis) formeaz baza pentru analiza multivariat a datelor. PCA presupune o aproximare a tabelului de date, matricea de date X, printr-un produs de dou matrici de dimensiuni mai reduse, T i P, ce rein doar informaia util din X. Reprezentarea grafic a coloanelor lui T d o imagine privind formele obiectului pentru X i, n mod analog, reprezentarea liniilor matricii P conduce la formele variabilelor. Aceast metod de analiz lucreaz n modul urmtor: se caut o direcie n spaiul proprietilor dup care datele au varian maxim; direcia respectiv se numete prima component principal (PC1) i fiecare form se proiecteaz pe aceast direcie, rezultnd astfel o reprezentare monodimensional a datelor (figura 13).

PC1 var 3 ti1

x x x x x x x x x

. (i)x
x

x x

var 2

var 1

Figura 13. Matricea X(N,K) a datelor, cu N puncte n spaiul K-dimensional.

Arome i Odorani Lucrri de laborator

17

n figur se prezint un spaiu tridimensional i prima component principal (PC1). Scorul unui obiect, (ti), este proiecia sa ortogonal pe aceast direcie, iar coeficienii direcionali ai liniei formeaz vectorul loading, pk. se poate cuta i o a doua component principal (PC2), a crei direcie este perpendicular pe prima i respect condiia de varian maxim. Dac se introduc n analiz i valorile y ale variabilelor dependente, se poate realiza aa numita regresie cu componente principale ( PCR - Principal Component Regression) care utilizeaz componentele principale semnificative obinute din X ntr-un model regresional obinuit. Proiecia n structuri latente (PLS) . Metoda proieciei n structuri latente ( PLS Projections to Latent Structure, Partial Least Squares) este similara metodei PCA deoarece ambele folosesc variabilele latente. Deosebirea const n faptul c vectorii lateni ai matricii X (t-urile) n PLS sunt construi implicnd i informaii din variabilele rspuns sau dependente, y. Condiia de ortogonalitate ntre axele componentelor principale rmne. Scopul lucrrii. Lucrarea privind analiza calitativ i cantitativ n clasa odoranilor aromelor condimentelor este mprit n trei pri: Analiza senzorial a unor seturi de produse odorante (20 de compui), concentrate de parfumuri (12), uleiuri volatile (27), concentrate de arome (83) i condimente (36), furnizate de ctre diverse firme din domeniu; Determinarea pragurilor de detecie n ap pentru unii compui odorani; Analiza statistic a datelor obinute prin metode de clasificare (cluster analysis, principal component analysis - PCA). Acest set de analize are ca scop familiarizarea studenilor cu tipurile de miros i cunoaterea principalelor produse aromatizante i condimentare, nirea metodelor de analiz senzorial folosite n acest domeniu i de prelucrare matematic i interpretare a rezultatelor obinute. Mod de lucru 1) Analiza senzorial. Pentru primele patru seturi de produse (O odorani, CP concentrate de parfumuri, UV uleiuri volatile, AR concentrate de arome) se vor pregti un numr corespunztor de eprubete numerotate, ce vor conine aproximativ 0.5 ml soluie alcoolic apoas diluat (5%). Cu ajutorul unor pipete Pasteur se vor transvaza volume de aproximativ 0.01 ml (o pictur mic) din produsul supus analizei

Arome i Odorani Lucrri de laborator

18

n fiecare eprubet. Eprubetele cu probe se vor nchide ermetic, dup care se va trece la analiza senzorial propriuzis. Subiecii (membrii panelului) vor fi antrenai n prealabil pe probe cunoscute, iar analiza se va face n camere individuale de analiz senzorial special amenajate (condiii optime de luminozitate, aerisire, umiditate etc.). Fiecare subiect va primi o prob pentru analiz i un formular de analiz aferent pe care se vor trece rezultatele analizei. Se va lua o prob din eprubeta cu produsul diluat cu ajutorul unei fii de hrtie de filtru i se va analiza din punct de vedere olfactiv prin mirosire direct (ortonazal). Se va evalua calitativ mirosul, iar rezultatul se va trece n cea de-a doua coloan a tabelului. Pentru evaluarea semicantitativ se va bifa un x n csua corespunztoare mirosului preponderent, a intensitii acestuia i a acceptabilitii produsului (schema 1). Rezultatele analizei senzoriale vor fi centaralizate de ctre conductorul grupei de paneliti i vor fi prelucrate matematic conform procedeelor specifice. Condimentele vor fi analizate doar calitativ n modul urmtor: o cantitate mic din fiecare condiment va fi presrat pe o bucat paralelipipedic de pine (1x1x0.5 cm3) uns cu un strat subire de margarin nearomatizat. Pentru fiecare prob se va descrie mirosul perceput ortonazal, aroma rezultat la mestecarea probei i gradul de condimentare (gradul de iute sau similar). Rezultatele vor fi trecute n fia de analiz corespunztoare.
Miros perceput 1 floral (trandafir, iasomie, zambile, liliac, violete etc.) 2 lemnos (mirodenii, santal, cuioare etc.) 3 rustic (ment, camfor, ierbos, verde, licheni, legume etc.) 4 balsamic (vanilie, rezinic etc.) 5 fructat (aldehidic, migdale, anason, fructe, ciocolat etc.) 6 animalic (mosc, castoreum, scatol, alge marine, ambr etc.) 7 empireumatic (fum, tutun etc.) 8 respingtor (brnz, usturoi, pete, ou clocite, rnced, mucegai etc.) 9 comestibil (unt, pine etc.) Intensitate 1 foarte intens 2 intens 3 mediu intens 4 slab 5 foarte slab Acceptabilitate 1 extrem de plcut 2 foarte plcut 3 destul de plcut 4 relativ plcut 5 nici plcut, nici neplcut 6 uor neplcut 7 destul de neplcut 8 foarte neplcut 9 extrem de neplcut Schema 1. Cuantificarea caracteristicilor produselor supuse analizei

Arome i Odorani Lucrri de laborator

19

2) Determinarea pragurilor de detecie . n cea de-a doua parte a lucrrii se vor determina pragurile de miros n ap pentru cteva produse odorante ( 1,8-cineol, diacetil, limonen, linalool, vanilin etc.). n acest scop se va utiliza metoda de alegere forat ascendent (Ascending Forced Choice, ASTM, E 679 79), ce nltur problemele de oboseal i adaptare senzorial care pot s apar n cazul metodelor tradiionale a limitelor. Se estimeaz mai nti, de ctre conductorul grupului de paneliti, un domeniu aproximativ al pragurilor de detecie, dup care se seteaz un o serie de trepte de concentraie alese n progresie geometric (cu un factor de 2 sau 3). Solventul ales va fi unul potrivit, de preferat apa distilat sau soluia alcoolic apoas diluat (probele vor fi introduse n recipieni de sticl nchii ermetic). Se va proceda apoi la estimarea populaiei de praguri de detecie pentru miros de ctre grupul de paneliti; fiecare prob va fi analizat relativ la un blank, ce va conine doar solvent, prin teste de discriminare (A nonA etc.), notndu-se cu 0 probele ce nu prezint diferen de miros fa de blank, respectiv cu + probele ce prezint diferene de miros fa de blank. Rezultatele vor fi trecute n fia de analiz corespunztoare, centralizate, iar pragul de detecie va fi calculat prin metodele clasice (schema 2).

PRAG DE DETECIE Nr. prob: Concentraie (g/l): Log(concentraie): Subiect 1: Subiect 2: : Subiect n:

Calculul pragului de detecie Subiect 1 2 : n Medie(log(concentraie)): Antilog(medie(log(concentraie))) = pragul de detecie: Schema 2. Modul de calcul al pragului de detecie Nr. prob Concentraie log(concentraie)

Arome i Odorani Lucrri de laborator

20

n final se va proceda la analiza statistic a datelor obinute la analiza senzorial a produselor. Pentru aceasta se va utiliza metoda de Analiz a Componentelor Principale (PCA), realizat cu programul Unscrambler 6.1. Pentru fiecare set de produse se va alctui setul de date al variabilelor independente (miros, intensitate, acceptabilitate) care se va introduce n analiz. Loading-urile (nregistrrile) vor indica impactul fiecrei variabile la clasificarea probelor din setul de produse, iar scores (scorurile, rezultelele) vor indica modul de grupare al probelor din set. Se vor analiza critic rezultatele analizei senzoriale i statistice i se vor trasa concluziile principale.