Principiile Virologiei

Serban MOROSAN DVM, PhD

Taxonomia virala
Este o disciplina relativ noua La inceputul anului 1900 : virusurile erau clasificate ca fiind agenti filtrabili (filtre de portelan ce retin bacteriile) 1930: dezvotarea tehnicilor a permis descrierea proprietatilor a numeroase virusuri (purificarea si descrierea morfologiei)

 In anul 1960 s-a format ICTV (International Committe on the Taxonomy of Viruses) In general clasificarea are la baza doua sisteme: Un sistem ce se bazeaza pe o singura caracteristica sau pe o serie de caracteristici unice ( monothetic system ) Un sistem ce se bazeaza pe partajarea unui numar de caracteristici comune ( polythetic system )

Proprietatile virusurilor in taxonomie

Metoda utilizata in taxonomia virala este cea de a doua ( polythetic system ): orice virus este descris utilizand colectia proprietatilor individuale Descriptia virusurilor se realizeaza pe baza: Morfologiei virionului : marimea, simetria capsidei, forma, prezenta sau absenta anvelopei Proprietatile fizice ale virionului: structura genomului, sensibilitatea la actiunea substantelor fizice sau chimice; proprietatile antigenice Proprietatile biologice: strategiile de replicare, tipul de gazda, modul de transmitere si patogenicitatea

 ICTV a adoptat o schema ce utilizeaza o ierarhizare taxonomica: ordin, familie, subfamilie, gen si specie. Specia este definita ca fiind un virus ce se multiplica si care ocupa o anumita nisa ecologica particulara Pentru fiecare gen s-a identificat o specie tip Specia tip nu este neaparat cea mai reprezentativa dar defineste sau identifica cel mai bine genul

 Genul: este un grup de specii ce prezinta anumite caracteristici comune Subfamilia: est un grup de genuri ce prezinta anumite caracteristici comune Familia: grup de subfamilii ce prezinta anumite caracteristici comune Ordinul: grup de familii ce prezinta anumite caracteristici comune

 Familia este cel mai mult utilizata in taxonomia virala

Majoritatea familiilor sunt caracterizate in functie de : morfologia virionului, structura genomului si strategia de replicare a acidului nucleic viral

Reguli de taxonomie
ICTV a adoptat o nomenclatura utilizand reguli pentru descrierea virusurilor Genul, subfamilia, familia si ordinul se scriu intr-un singur cuvant terminandu-se cu sufixul: -virus; virinae; -viridae si virales Exemplu: ordinul Mononegavirales, familia Paramyxoviridae, subfamilia Paramyxovirinae, genul Morbillivirus, specia: virusul rujeolei

Ordinea prezentarii virusurilor Ordinea prezentarii virusurilor este: Natura genomului viral Mono sau dublucatenar Polaritatea genomului Reverstranscriptia O alta categorie a fost creata pentru agentii subvirali cum ar fi viroizii, satelitii si prionii

Clasificarea virala : o opera neterminata

Peste 5000 de virusuri
30000 de suse si subtipuri

5 ordine 84 de familii 12 sub-familii 324 genuri Peste 2000 de specii

Virusuri ADN monocatenare (ss DNA)

Circoviridae : Anellovirus Parvoviridae : parvoviroza canina
parvovirinae

Virus ADN bicatenar (dsDNA)

Asfarviridae: pesta porcina africana Poxviridae : variola Iridoviridae Adenoviridae : hepatita infectioasa canina Herpesviridae : rinotraheita infectioasa bovina Polyomaviridae Papillomaviridae

Virus ARN de polaritate negativa(ssRNA -) Orthomyxoviridae : virusul influentza Rhabdoviridae : virusul turbarii Delta virus Paramyxoviridae : maladia Carr Bornaviridae Arenaviridae Bunyaviridae Filoviridae

Virus ARN bicatenar (ds RNA)

Birnaviridae Reoviridae : febra catarala ovina

Virus ARN monocatenar de polaritate pozitiva ssRNA + Caliciviridae : caliciviroza felina Picornaviridae : febra aftoasa Astroviridae : astroviroza (enterite) Flaviviridae : BVD : boala mucoaselor Coronaviridae : peritonita infectioasa felina Arteriviridae : arterita infectioasa ecvina Togaviridae : encefalitele ecvine americane

Virus cu transcriptie inversa

Retroviridae (ssRNA /RT) : leucoza felina

Hepadnaviridae (dsDNA/RT): hepatita B , hepadnavirus (rate , marmote)

Agenti sub-virali

Virusurile satelit Prionii (agenti transmisibili neconventionali)

Virusuri satelit : deltavirus

Exemplu
Virusul hepatitei delta

Proprietati
Virus defectiv Necesita functiile unui alt virus (virus helper) Virus ARN monocatenar circular O parte din genom ce seamana unui viroid

Agenti transmisibili neconventionali Exemplu:

Encefalopatia spongiforma bovina (ESB) Scrapia Creutzfeldt-Jakob la om

Proprietati :
PrP infectioasa Doua forme : PrPc si PrPsc Rezistenta exceptionala la agenti chimici si fizici.

Cultivarea si detectia virusurilor

1. Detectia initiala si izolarea virusurilor 2. Cultivarea virusurilor 3. Recunoasterea cresterii virusurilor in cultura celulara : detectia cantitativa a virusurilor

Metodele de studiu al virusurilor

Metode de studiu al acidului nucleic viral
Analiza de restrictie Southern blot PCR Microarray Secventializare

Metode de studiu al proteinelor

Marcaj radioactiv Imunoprecipitare Electroforeza Western blot

Diagnosticul infectiilor virale

Semnele clinice Diagnostic diferential Confirmarea etiologiei prin: - Punerea in evidenta a agentului patogen (direct) - Punerea in evidenta a raspunsului imun (indirect)

Diagnosticul infectiilor virale

A. Metode de diagnostic direct (punerea in evidenta a Ag) A1. Nespecifice : (Determinarea originii virale, fara identificarea agentului etiologic) Efect citopatogen Test de hemadsorbtie

Diagnosticul infectiilor virale

A. Metode de diagnostic direct (punerea in evidenta a Ag) A2. Specifice : (punerea in evidenta directa a unui constituent al virusului) Detectia genomului Detectia proteinelor

Diagnosticul infectiilor virale

B. Metode de diagnostic indirect (punerea in evidenta a raspunsului imun , Ac) ELISA direct Imunofluorescenta Seroneutralizare Inhibitia hemaglutinarii

Detectia initiala si izolarea virusurilor

Prezenta unui virus este evidentiata de efectele asupra organismului sau asupra culturilor celulare Efectele asupra organismului: leziuni, disfunctii ale sistemului imun, ale organelor (hepatite sau miocardite) sau moartea Efectele asupra culturilor celulare: modificari morfologice ale celulelor infectate (efectele citopatice)

Detectia initiala si izolarea virusurilor

Virusurile pot fi izolate de la animalele infectate: din excretii, secretii, sange sau tesuturi Virusurile pot fi izolate plecand de la animalele infectate experimental sau de la culturile celulare infectate Cainii, pisicile, soarecii, sobolanii si pasarile au fost utilizate drept animale de laborator pentru infectiile experimentale

Detectia initiala si izolarea virusurilor

Virusurile cultivate intr-o alta gazda sau pe culturi celulare se pot adapta prin achizitia unor modificari genetice (mutatii de exemplu) Aceste modificari pot fi insotite de o pierdere a virulentei si a patogenicitatii. Aceasta adaptare si atenuare pot fi extrem de utile pentru intelegerea multiplicarii virusului dar si pentru constructia de vaccinuri atenuate

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda animalele de laborator si ouale embrionate

Inainte de descoperirea culturilor celulare, virusurile se cultivau numai in gazdele naturale sau in animale de laborator In anul 1932 au fost introduse ouale embrionate in studiul virusurilor Dezvoltarea oualelor de gaina la 14 zile dupa fertilizare contin o serie de tesuturi diferentiate, propice multiplicarii multor virusuri: Orthovirusuri, paramyxovirusuri, rhabdovirusuri, togavirusuri, herpesvirusuri si poxvirusuri

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - animalele de laborator si ouale embrionate

In timp, ouale embrionate au fost inlocuite de culturile celulare Astazi, ouale embrionate sunt inca utilizate pentru obtinerea de titruri inalte pentru unele virusuri sau pentru dezvoltarea de vaccinuri De exemplu, formarea leziunilor inflamatorii de la nivelul membranei corioalantoide ramane metoda de baza in detectia unei variante a poxvirusului.

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda tipuri celulare

Celule aderente :
Doua tipuri de morfologie : epiteliale (poligonale) si fibroblastice (alungite)

Celule neaderente (exemplu : liniile celulare imortalizate)

Plutesc in mediul de cultura Sferice Destinate productiei celulare in masa

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda culturile de organe si celulare Mentinerea celulelor animale in vitro:
Cultura organelor Cultura primara de explant de organe Culturile celuare

Cultura organelor: arhitectura tridimensionala a tesutului este mentinuta Cultura primara de explant de organe: piese mici de tesut sunt cultivate Culturile celulare: tesutul este disociat in celule individuale

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda

culturile si tipurile celulare (cultura, susa, linie)

Culturile celulare sunt cele mai utilizate in cultivarea virusurilor Culturile celulare sunt de trei tipuri:
Culturile celulare primare Susele de celule Liniile celulare

Virusurile se comporta diferit in functie de tipul de culturi celulare (cu avantajele si dezavantajele tehnice)

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda culturi celulare primare, suse celulare, linii
celulare
Les diferitele tipuri celulare Culturi de celule primare : celule puse in cultura plecad de la organe; cresc in monostrat confluent Suse celulare : polulatie celulara euploida (nr normal de cromozomi) ce nu se cultiva la infinit (o subcultura) Linii celulare: populatie celulara aneuploida (nr anormal de cromozomi) ce poate fi cultivata la infinit : liniile celulare se pot transforma (spontan) in linii celulare imortalizate

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda culturile celulare primare

Culturile celulare primare pot fi obtinute plecand de la:

Embrioni sau tesuturi selectate de la embrioni Animale nou-nascute Animale adulte

Cele mai utilzate culturi celulare: primate, om, rozatoare (soareci , sobolani, hamsteri), pasari

Suporturile culturilor celulare

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda culturile celulare primare Culturile celulare sunt obtinute prin disocierea tesutului si eliberarea celulelor (proteaze si colagenaze) Celulele vertebratelor cresc si se divid numai daca se ataseaza la o suprafata solida (exceptie, celulele sitemului hematopoetic) Celulele sunt plasate in placi ce favorizeaza atasarea (placi colagenate de exemplu) Mediul de cultura : lichid, bogat in acizi aminati, minerale, tampon pH, sursa de energie, factori de crestere, factori de atasare

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda culturile celulare primare

In aceste conditii, celulele se ataseaza la placa, se divid si migreaza pana ce acopera suprafata placii Odata ce celulele acopera placa (intr-un singur strat) acestea sunt viabile dar nu se mai dezvolta Dupa inlaturea unei portiuni din acest strat celulele se dezvolta pana la refacerea lui Odata ce devin confluente, celulele nu se mai dezvolta: inhibitia de contact Culturile celulare pot contine mai multe tipuri celulare

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda subculturile celulare

Celulele dintr-o cultura primara pot fi subcultivate pentru a obtine un numar mai mare de celule Celulele sunt mai intai detasate cu tripsina suspensie de celule Suspensia este diluata si o parte este recultivata = cultura secundara Fiecare subcultura reprezinta un pasaj

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda subculturile celulare

Fiecare pasaj este format dintr-un numar de generatii celulare (in functie de dilutia pasajului) Majoritatea celulelor vertebratelor multiplica (se dubleaza) cu o rata constanta: odata la 24 h Daca utilizam un pasaj diluat de opt ori, celulele se dubleaza odata la 3 zile

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda susele celulare

Cultura se numeste susa celulara incepand de la a doua cultura si pana la imbatranire Alterarea susei celulare poate avea loc: transformare (linie celulara imortalizata)

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda susele celulare

Celulele vertebratelor nu pot fi pasate la infinit (20-100 de generatii): in functie de varsta si specie

Dupa 20-100 generatii, celulele nu se mai multiplica: fenomenul de criza sau imbatranire

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda liniile celulare

In timpul cultivarii unei linii celulare, acestea pot suferii modificari (transformare) si nu mai trec prin stadiile de criza sau imbatranire : pot fi pasate la infinit Caracteristica principala a transformarii este faptul ca celulele sunt imortalizate Celulele imortalizate se numesc linii celulare sau linii celulare continue Imortalizarea poate aparea spontan in timpul unui pasaj, induse chimic, prin infectia virala sau transfectia cu oncogene

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda liniile celulare

Imortalizarea apare frecvent la culturile celulare la rozatoare, celule renale de maimuta si rar la cele de om sau gaina Importalizarea este insotita de modificari genetice (celule aneuploide : cu un numar anormal de cromozomi) Liniile celulare sunt in general compuse din fibroblaste sau celule epiteliale Liniile celulare rezulta prin selectia unor variante celulare

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda

transformarea

Celulele transformate se diferentiaza de celulele normale prin proprietati ce pot fi grupate in trei modificari esentiale:
Imortalizarea Controlul cresterii aberante Celule maligne

Imortalizarea : posibilitatea de a fi cultivata la infinit

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda

transformarea

Controlul cresterii aberante (proprietati):

Pierderea inhibitiei de contact Independenta de contact Tumoreginicitatea

Pierderea inhibitiei de contact: celulele vor creste unele peste altete (si nu in monostrat) Independenta de contact: celulele nu mai au nevoie sa se ataseze pentru a se multiplica (se pot multiplica intr-un lichid in suspensie)

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda

transformarea

Tumorgenicitatea : abilitatea celulelor de a forma o tumora in experimentare animala si de a se raspandi in vivo

Caracteristicile celulelor transformate sunt extrem de importante pentru studiul virusurilor tumorale

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda avantajele si dezavantajele diferitelor tipuri de culturi celulare

Avantage : Liniile celulare sunt relativ usor de mentinut Celulele aderente sunt usor de manipulat (pasage multiple) Celulele in suspensie sunt usor de diluat si produc un numar mare de celule Schimbarea mediului de cultura se realizeaza usor

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda avantajele si dezavantajele diferitelor tipuri de culturi celulare

Dezavantage : Nu toate virusurile se multiplica pe culturi celulare

In acest caz se utilizeaza gazda naturala, animalele de laborator sau culturile de tesuturi

Recunoasterea virusurilor
Alegerea metodei de cultivare a virusurilor depinde de mai multi factori: Scopul experimentului: cultivarea virusului sau ale unor variante Limitele de cultivare a virusului in vitro: se poate cultiva pe linii celulare, pe oua embrionate sau in suspensii celulare Tehnici alterantive: daca este posibil Metoda aleasa depinde de : Biologia virusului : virusul este eliberat din celula gazda, determina liza celulei sau nu, determina sau nu un efect citopatic etc

Recunoasterea dezvoltarii virusurilor in culturile celulare

Recunoasterea unei infectii virale: efectul citopatic si hemadsorbtia Efectul citopatic este compus din doua fenomene diferite: Modificari morfologice induse in celulele sau grupurile de celule de catre infectia virala (usor recunoscute la microscopul optic) Incluziile virale : alterari ale arhitecturii intracelulare

Recunoasterea dezvoltarii virusurilor in culturile celulare

Modificarile morfologie induse de infectia virala:
rotunjire, agregarea, pierderea aderentei sau liza

Modificari morfologice cauzate de un virus sunt extrem de reproductibile si pot fi asociate unei anumite infectii virale. Incluzii virale: anomalii intracelulare specifice la o celula infectata si detectabile la microscopul optic. Incluziile virale sunt specifice unei infectii virale date: (corpusculii Bases Negri la nivelul nucleocapsidei virusului rabic)

Recunoasterea dezvoltarii virusurilor in culturile celulare

Hemadsorbtia se refera la masurarea indirecta a sintezei proteinei virale in celulele infectate detectate prin adsorbtia eritrocitelor la suprafata celulelor infectate.

Recunoasterea dezvoltarii virusurilor in culturile celulare

Hemadsorbtia : abilitatea virusurilor de a atasa specific globulele rosii Multe virusuri sintetizeaza proteine de atasare : se ataseaza la o mare varietate de celule (eritrocitele) Adesea, aceste proteine virale sunt exprimate la suprafata celulelor infectate (in timpul maturarii virusurilor cu anvelopa) Astfel, un grup de celule infectate poate fi usor detectat cu ochiul liber dupa expunerea preparatului in contact cu globule rosii

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile fizice hemaglutinarea (numai pentru virusurile hemaglutinante) O mare parte dintre virusuri sintetizeaza proteine de atasare celulara: atasarea la celule (eritrocitele) Aceste proteine responsabile de atasarea celulara sunt prezente la suprafata virionilor: virionii pot atasa direct eritrocitele Amestecul de particule virale (intr-o concentratie suficienta) cu eritrocite determina aglutinarea acestora Ertrocitele aglutinate se disting usor de cele neaglutinate

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile fizice hemaglutinarea Dilutii seriate ale virusului sunt amestecate cu o concentratie fixa de eritrocite (placa speciala) Eritrocitele ce nu sunt aglutinate formeaza o grupare de celule usor de recunoscut Eritrocitele aglutinate nu sunt libere in godeurile placii si formeaz un strat uniform la suprafata godeului O unitate hemaglutinanata (HA unit/ml): cantitatea minima de solutie virala capabila sa determine aglutinarea Titrul viral exprimat in HA unit/ml poate fi calculat tinand seama de dilutia solutiei virale


Titrul viral al probei de testat este calculat ca ind inversul dilutiei ultimului punct ce determina hemaglutinarea : A8 si B1

hemaglutinare

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

Exista doua metode majore: fizice si biologice Metodele fizice (masoara prezenta particulelor virale si daca acestea sunt sau nu infectioase):
Ex : Numararea particulelor (microscopie electronica) etc.

Metodele biologice: masoara prezenta infectiei virale dar nu si numarul particulelor prezente
Ex: cultivarea in placa etc.

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice- cultivarea in placa

Tehnica de cultivare in placa : este cea mai utila tehnica biologica Descoperita de Herelle (1900) la bacteriofagi ea a fost adaptata la virusurile animale de Dulbecco in 1953 Metoda simpla si cantitativa

Metodele cantitative de detectie a virusurilor plaque assay

Principiul tehnicii : abilitatea unei singure particule virale de a da nastere la o suprafata citopatologica macroscopica ( placa infectioasa) Tehnica poate fi utilizata pentru cuantificarea virusului

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice- cultivarea in placa Etapele : Efectuarea de dilutii seriate a virusului de testat Infectarea placilor Petri cu culturi celulare Peste fiecare placa Petri se adauga un mediu semi-solid Mediul solid previne formarea placilor de infectie secundare Astfel, fiecare placa insemana rezultatul infectiei unei singure particule virale Dupa incubare, mediul este colorat si placile pot fi astfel vizualizate

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice- cultivarea in placa Placile de cultura inoculate cu dilutii mari contin cateva placi de infectie Placile ce contin un numar rezonabil de placi de infectie vor fi numarate si concentratia virusului infectios de origine poate fi calculat in functie de dilutia inoculata Rezultatul sau titrul viral este exprimat in placi formatoare de unitati pe mililitru (pfu/ml)
Numai particulele virale capabile sa formeze placi infectioase vor fi numarate

Etapa 1

Virus de o concentratie necunoscuta

Dilutii seriate

Etapa 2

Fiecare dilutie este depusa intr- o placa Petri ce contine un monostrat de celule

Etapa 3

Fiecare placa de cultura este acoperita cu un mediu semi-solid (previne formarea de placi secundare )

Etapa 4

Incubarea placilor Petri si colorarea acestora pentru vizualizarea placilor infectioase

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice- cultivarea in placa

Pipette off and discard ONE ML of media from each well. One ml of media should now remain on each monolayer. Add 100 L or 10 l of each dilution in duplicate to each well, letting the virus flow gently into the media. [Consider this: If 100l of a 106 dilution yields 25 plaques, the titer of virus is 2.5x108 PFU/ml. If 10l of a 106 dilution yields 30 plaques, the titer of virus is 3.0 x109 PFU/ml.]

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice- metoda punctului final

Virusurile la care nu pot fi adaptate tehniciile de mai sus (dar care determina patologii detectabile in culturile celulare, ouale embrionate etc) pot fi cuatificate prin tehnica punctului final Virusul este diluat (dilutii seriate) si cultivat pe mediu si prin metoda adecvata Dupa perioada de incubatie adecvata trebuie evaluat momentul in care s-a produs infectia

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice - metoda punctului final

Diferite metode statistice s-au dezvoltat pentru a calcula dilutia de virus ce determina infectia a 50% din mediile de cultura inoculate : titrul viral este exprimat ca ID50 ( infectious dose 50 ) Tehnica poate cuprinde de asemenea :
observarea efectului citopatic in culturile celulare sau TCID50 ( tissue culture infective dose 50 ) Moartea oulelor embrionate inoculate: EID50 egg infectious dose 50 Moartea animalelor infectate: LD50 lethal dose 50

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice - metoda punctului final

Datele din tabelul de mai sus au fost recoltate prin infectia cu dilutii seriate a mai multor placi de culturi celulare Dupa incubare s-au observat prezenta efectelor citopatice

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice - metoda punctului final

Dilutia -6 : 66,7 % dintre placi sunt infectate Dilutia -7: 14,3% dintre placi sunt infectate Dilutia ce determina infectia a 50% dintre placi se afla intre dilutiile -6 si -7

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

tehnicile biologice - metoda punctului final

Dilutia exacta poate fi calculata utilizand metoda lui ReedMuench Distanta proportionala 50% = (% peste 50%) - 50%)/(% peste 50%) - (% sub 50%) Sau (66,7% - 50%) / (66,7% - 14,3%) = 0,3 Punctul final sau
log TCID50 = (log din dilutia peste 50%) + distanta proportionala x log factorul de dilutie sau Log TCID50 = (-6) + ( 0,3 x - 1) = - 6,3 Deci TCDI50 = 10-6,3

 Distanta proportionala 50% = (% peste 50%) - 50%)/(% peste 50%) - (% sub 50%) Sau (66,7% - 50%) / (66,7% - 14,3%) = 0,3 Punctul final sau log TCID50 = (log din dilutia peste 50%) + distanta proportionala x log factorul de dilutie) sau Log TCID50 = (-6) + ( 0,3 x - 1) = - 6,3 Deci TCDI50 = 10-6,3

Metode de detectie serologice

Utilizeaza specifictatea reactiei antigen-anticorp Permit detectia antigenelor virale sau a anticorpilor specifici Imunofluorescenta Imunoprecipitarea Immunobloting Elisa

Metode de detectie serologice neutralizarea

Inocularea unui virus la un animal determina producerea de anticorpi specifici O parte dintre acesti anticorpi pot neutraliza specific virusul

Metode de detectie serologice neutralizarea

Dilutii de serum sau de anticorpi monoclonali + virus Incubare Testarea prin diferite metode : culturi celulare, sau animale End point = cea mai mare dilutie a anti-serului ce inhiba dezvoltarea de efecte citopatice (in culturile celulare) sau relicarea virusului (in ouale embrionate sau animale de experienta)

Metode de detectie serologice inhibarea hemaglutinarii

Anticorpii specifici proteinelor virale (cu o activitatea hemaglutinanata) pot bloca abilitatea virusului de a aglutina globulele rosii Dupa incubare, inhibarea hemaglutinarii este citita ca fiind cea mai mare dilutie a serului ce inhiba hemablutinarea Este o metoda rapida, sensibila utilizata pentru detectia anticopilor oricarui virus ce cauzeaza hemaglutinare

Metode de detectie serologice inhibarea hemaglutinarii

Metode de detectie serologice fixarea complementului

Determina prezenta anticoprilor antivirali dintr-un ser de cercetat Interactiunea antigeni virali-anticorpi poate cauza fixarea complementului Fixarea complementului va determina liza membranelor celulare

Metode de detectie serologice fixarea complementului

Etapele : 1. Inactivarea complementului endogen din serul de cercetat (prin incalzire) 2. Incubarea serului de cercetat cu un complement standard 3. Daca are loc reactia Ag-AC atunci complementul se fixeaza 4. Detectarea complementului fixat: prin adaugarea de globule rosii de oaie + AC anti globule rosii 5. Citirea reactiei

Metode de detectie serologice imunofluorescenta, ELISA

Imunofluorescenta directa Imunofluorescenta indirecta ELISA

Detectia acizilor nucleici - Southern blot, Northern blot

Southern blot Northern blot PCR

Studiul acidului nucleic viral

Analiza de restrictie si hibridare moleculara Amplificare genica (PCR) Conventinala PCR in timp real Secventializare Microarrays Metode bazate pe mutatii induse in seceventele ADN-ului de studiat (mutageneza dirijata)