Curs 11- Genetic RECOMBINAREA GENETIC LA EUCARIOTE Recombinarea genetic este procesul prin care are loc trans

erul intra! sau intermolecular a unor sec"en#e $e A%N& a"'n$ ca re(ultat mo$i icri )n )nln#uirea genelor sau a unor pr#i $in gene* Se poate produce astfel, reasortarea unor nucleotide la nivelul aceleiai molecule de ADN sau ntre molecule separate, rezultnd, n final, una sau dou molecule recom inate! "a eucariote procesul de recom inare #enetic este le#at de fenomenul se$ualit%ii i se realizeaz n special n cursul meiozei, fiind condi%ionat de realizarea contactelor ntre cromosomi urmat de dis&unc%ia independent a perec'ilor de cromosomi ( ivalen%i)! *n cazul or#anismelor eucariote au fost descrise + tipuri de recom inare #enetic, recombinarea intracromosomal + prin crossing!o"er ,sc-imbul reciproc $e segmente cromosomale./ recombinarea intercromosomal + prin $is0unc#ia in$epen$ent a cromosomilor omologi/ recombinarea genetic nereciproc + prin con"ersie genetic*

Recombinarea intracromosomal ,crossing!o"er. se realizeazatt n meioz ct i n mitoz! -a poate avea loc intergenic, ct i intragenic! Recombinarea intragenic este un fenomen rar! Acest fenomen manifest interferen% ne#ativ care determin creterea pro a ilit%ii ca un al .-lea crossin#-over s ai loc n apropierea primului! /ormarea ivalen%ilor n meioz presupune participarea a . cromosomi de ori#ine diferit (matern i patern), ntre care se sta ilesc contacte intercromatidice (sinapse) ce conduce la formarea unei structuri specializate numit comple1 sinaptinemal* 0mportan%a comple$ului sinaptinemal n desfurarea recom inrii #enetice intracromosomale este dovedit de faptul c la or#anismele la care nu se produce acest comple$, nu are loc procesul de crossin#over! /ormarea c'iasmelor este dependent de sinteze proteice ce au loc la sfritul zi#otenului! 2rocesul $e recombinare genetic implic ruperea 3i reunirea cromati$elor participante& apt ce con$uce la un sc-imb reciproc $e segmente $e A%N $e $imensiuni egale 3i la apari#ia $e cromosomi ,iar apoi $e game#i. recombina#i (/i#! 1)!

/enomenul de crossin#-over se realizeaz mai mult sau mai pu%in randomic, de-a lun#ul perec'ilor de cromosomi omolo#i! Astfel, probabilitatea reali(rii recombinrii )ntre 4 loci cre3te o$at cu $istan#a $intre ace3tia pe cromosomi* Deoarece procesul de crossin#-over afecteaz numai . dintre cromatidele ivalen%ilor, doar 12 3 dintre produii meiozei sunt de tip recom inat, restul de 12 3 sunt de tip parental! S-a constatat c ntre #enele plasate pe cromosomii omolo#i, n afar de crossin#-over simplu, pot aprea i crossin#-overe multiple (/i#!.)! Dac procesul de recom inare are loc la nivelul unor #ene 'eterozi#otze, indiferent de numrul de crossin#-overe ce se realizeaz, procentul de recom inare nu depete 12 3!

4rocesul recom inrii #enetice poate avea loc i n celulele somatice! Sc'im urile intercromatidice (sister chromatid exchange) au fost eviden%iate mai ales n celulele mamaliene aflate n cultur in vitro, ele nefiind urmate, de o icei, de modificri fenotipice deoarece cromatidele implicate sunt identice! /enomenul recombinrii mitotice a fost studiat n special n cazul fun#ilor ( Aspergillus nidulans, S. cerevisiae) la care n ciclul de via% predomin 'aplofaza! 5ecom inarea mitotic poate avea loc n cursul metafazei i presupune asocierea cromosomilor omolo#i i realizarea sc'im ului #enetic nainte de diviziunea centromerului! 4rocesul de crossin#-over se poate produce i la nivelul aceleiai #ene (crossin#-over intra#enic)! *n mecanismul molecular al recom inrii #enetice de tip crossin#-over, sunt implicate proteine specifice, procesul recom inrii fiind asociat cu cel de reparare #enetic! Recombinarea intercromosomal are loc prin dis&unc%ia independent a perec'ilor de cromosomi care reprezint suportul material pentru dis&unc%ia perec'ilor de factori ereditari! Se#re#area independent are loc la trecerea celulelor se$uale de la metafaza 0 la anafaza 0, cnd are loc aezarea ntmpltoare a cromosomilor de ori#ine matern sau patern deasupra sau dedesu tul planului ecuatorial al plcii metafazice! Acest comportament al cromosomilor de ori#ine maten, care se mperec'eaz cu cei de ori#ine patern i apoi separarea perec'ilor respective, a fost comparat de ctre 6uller cu formarea perec'ilor de dansatori n timpul dansului i separarea lor la sfritul acestuia! Din aceast cauz, 6uller a denumit acest comportament dansul cromosomilor ! Cu ct numrul cromosomilor i a #enelor con%inute este mai mare cu att numrul de com ina%ii posi ile de #ame%i i de or#anisme este mai mare! 4osi ilitatea ca un or#anism s fie asemntor cu altul este de (17.) .n, n care n 8numr de perec'i de cromosomi, iar .n reprezint numrul total de cromosomi din complementul speciei respective! Con"ersia genic este o recom inare nereciproc! 0n cadrul conversiei #enice, un se#ment din molecula de ADN a unei cromatide se desprinde i se ataeaza de alta cromatida! -ste posi il, in acest mod, ca un cromozom sa con%ina o #ena in doua e$emplare (daca transferul s-a realizat intre cromozomi omolo#i), iar altul o #ena in minus! Are loc cu o frecventa mai mare in cursul diviziunii meiotice dar poate avea loc si in celulele somatice! -a a fost eviden%iat prin analiza tetradelor la ciupercile din #enurile Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora unde apar a ateri de la raportul normal de se#re#are alelic, ca i cum se produce o transformare a alelei A n a (/i#! +)!

/recven%a recom inrii #enetice nereciproce poate crete de la un capt la altul al unui locus #enic, fenomen numit polari(area con"ersiei* Astfel , la fun#i, n locul raportului de se#re#are normal de 9 , 9, se ntlnesv valori diferite ale acestui raport, : , ., 1 , +, ;, 1 sau c'iar < ,2! fenomenul conversiei #enice a fost eviden%iat i la plante, n cazul unor #ene ce intervin n determinismul pi#menta%iei, precum i la virusuri (n special acteriofa#i)! =nii autori consider c, de fapt, conversia #enic este consecin%a unui proces de recom inare, n urma cruia apar nepotriviri ale unor aze azotate situate pe cromatide omoloa#e! Aceste zone de nepotrivire sunt reparate prin e$cizie i prin adu#area nucleotidei corespunztoare! 4rin repara%ie poate reaprea astfel, tipul normal!

Curs 1.- Genetic RECOMBINAREA GENETIC LA 2ROCARIOTE "a procariote au fost descrise mai multe ci de transfer de material #enetic 5 trans ormare genetic& con0ugare& se1$uc#ie 3i trans$uc#ie, asociate cu mecanisme ce asi#ur inte#rarea noii informa%ii #enetice n #enomul #azdei! 0ndiferent de natura sa, transferul de #ene reprezint un fenomen n care moeculele informa%ionale i sc'im #azda, avnd de traversat dou ariere celulare, una la ieire din celula donatoare i alta la intrarea n celula receptoare! 1! Trans ormarea genetic /enomenul transformrii #enetice a fost descoperit n 1>.< de ctre Griffit', n urma e$perimentelor realizate cu pneumococi asupra oarecilor! =lterior , Aver?, 6ac "eod i 6cCart'?, au descoperit, n 1>99, c a#entul transformant este reprezentat de ADN izolat din celulele acteriene! Trans ormarea genetic la bacterii presupune trans erul unui ragment $e A%N ,cromosomal sau plasmi$ial. $e la o bacterie $onatoare 3i )ncorporarea acestuia )n genomul unei bacterii receptoare* Asemenea fra#mente de ADN sunt, n #eneral, de dimensiuni mari (n medie de .2!222 perec'i de nucleotide), putnd con%ine #ene utile care, ptrunse n acteria receptoare, pot nlocui printr-un proces de recom inare o secven% de nucleotide omoloa# din #enomul acesteia! 0nforma%ia #enetic nou inte#rat n cromosomul acteriei receptoare este transmis sta il de-a lun#ul #enera%iilor! /enomenul de transformare #enetic a fost eviden%iat prima dat la pneumococul Diploccocus pneumoniae i ulterior la Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influen ae, Staphylococcus sp., etc. 4entru a putea prelua ADN e$o#en din mediul e$tracelular, celulele receptoare tre uie s manifeste o anumit stare specific numit stare $e competen#* Aceasta presupune ca peretele celular i mem rana celular ale celulei acteriene receptoare s fie permea ile pentru ADN e$o#en, iar celula s se afle ntr-o anumit faz a ciclului de via% care s permit acceptarea acestuia! *n cursul realizrii competen%ei are loc activarea unor receptori specifici localiza%i la nivelul peretelui celular cu rol de le#are a ADN e$o#ed la suprafa%a celular! Numrul receptorilor activi, variaz de la o specie acterian la alta, de e$emplu, la Streptococcus au fost identifica%i <2 de receptori, la Bacillus subtilis @ 12, iar la Haemophilus doar 9 receptori! "a unele specii acteriene, starea de competen% este o stare natural, fiziolo#ic, aprnd ntr-o anumit etap a ciclului de via% i dureaz un anumit interval de timp! De e$emplu, la A otobacter, 1

Staphylococcus, !neumococcus competen%a este ma$im pe parcursul fazei lo#aritmice, n timp ce la alte specii @ Bacillus, !seudomonas, "ethylobacterium- competen%a este ma$im la trecerea de la faza lo#aritmic la cea sta%ionar! *n cazul altor specii, starea de competen% poate fi indus prin tratamente specifice (oc de temperatur, adu#area unor ioni etc!)! *ntr-o popula%ie acterian, propor%ia celulelor capa ile de a prelua ADN e$o#en poate fi estimat pe aza frecven%ei de transformare, urmrind un anumit marAer #enetic! 4entru a se o %ine o frecven% ridicat de inte#rare7 transformare, este necesar ca ADN transformant s provin de la o tulpin acterian nrudit (ADN omolo#)! *n cazul utilizrii unor or#anisme nenrudite (ADN 'eterolo#), eficien%a procesului de transformare este foarte sczut! 6ulte acterii se pot liza n mod natural, mai ales n timpul etapelor finale ale ciclului celular! *n aceste condi%ii, ADN este eli erat n mediu e$tracelular de unde poate fi preluat de alte acterii aflate n aceeai popula%ie! La bacterii& procesul natural $e trans ormare genetic ,cu ragmente $e A%N cromosomal eliberat prin meto$a li(ei celulelor bacteriene. se reali(ea( )n mai multe etape5 1! legarea re"ersibil ,a$sorb#ia. a moleculelor de ADN du lu catenar, la nivelul situsurilor receptoare aflate pe suprafa%a celularB .! preluarea A%N e1ogen de ctre celulele competenteB +! con"ertirea A%N $ublu catenar la orma monocatenar& prin de#radarea uneia dintre catenele moleculei ini%ialeB 9! integrarea segmentului $e A%N monocatenar n cromosomul celulei receptoareB 1! segregarea 3i e1primarea enotipic a noii informa%ii #enetice inte#rate n #enomul celulei #azd! 4rocesul de transformare este destul de rspndit n natur, mai ales n cazul tulpinilor acteriene nrudite, el &ucnd un rol important n evolu%ia acteriilor! Aceast concluzie este ntrit i de o serva%ia c transferul de #ene prin transformare #enetic are loc nu numai pe orizontal (ntre acterii nrudite) ci i ntre #rupe de or#anisme nenrudite (fenomen ce e$plic, de e$emplu, rspndirea rezisten%ei la anti iotice)! 4* Con0ugarea bacterian Con&u#area acterian reprezint un mod de transfer unidirec%ional de ADN de la o celul donatoare la o celul receptoare prin intermediul unei le#turi intercelulare directe (pil de se$) i condi%onat de prezen%a n acteria donatoare a unui element #enetoic specializat numit con&u#on! :

/enomenul con&u#rii a fost descoperit n 1>9: (de ctre "eder er# i Catum) n urma e$perimentelor cu tulpini de Escherichia coli ce con%ineau sau nu o plasmid specific notat /! Din acest punct de vedere, celulele acteriene care con%in plasmida / ( factorul /) sunt notate / D, iar cele care nu con%in aceast plasmid sunt notate / -! *n cazul acteriilor Gram ne#ative, n afar de plasmida /, func%iile necesare procesului de con&u#are se #sesc la nivelul mai multor plasmide! De e$emplu, n cazul plasmidelor de rezisten% la anti iotice (plasmida 549) i plasmidele #ol ce con%in determinan%i #enetici pentru sinteza colicinelor! /actorul / este alctuit din ADN du lu catenar circular cu o lun#ime de >9,1 A i n numr de 1-. copii7celul! Cransferul prin con&u#are al acestor plasmide se datoreaz prezen%ei unei re#iuni specifice, re#iunea tra, ce reprezint cca +2 3 din lun#imea plasmidei /! Cu e$cep%ia fectorului /, celelalte plasmide con&u#ative pot include i alte tipuri de #ene, pentru rezisten%a la anti iotice, toleran% la metale #rele, virulen% pato#enitate etc! 6tu$iile asupra procesului $e con0ugare e ectuate la E. coli & au permis stabilirea etapelor acestuia5 7ormarea 3i stabilirea agregatelor $e con0ugare/ 2regtirea A%N pentru trans er Trans erul A%N con0ugati" Re acerea structurii circulare 3i $ublu catenare a A%N trans erat*

8n prima etap are loc sinteza de ctre celula donatoare a pililor de se$ @ structuri specializate, tu ulare, localizate la suprafa%a celular, alctuite din molecule de pilin (protein a crei sintez este codificat de #ene plasmidiale)! A 4!a etap a con&u#rii presupune interven%ia unei proteine, codificat de #enele plasmidiale, care are rolul de a realiza o cresttur monocatenar la nivelul #enei ori$ (ori#inea transferului)! "a nivelul captului 1E al catenei de ADN crestat, se lea# o protein specific, codificat tot de #ene plasmidiale de la nivelul re#iunii tra. Are loc apoi, transferul catenei crestate, ncepnd cu captul 1E , transferul fiind cuplat cu procesul de replicare al plasmidei, conform modelului cercului rotativ! 0n acest fel, pe msur ce procesul de replicare avanseaz, una dintre catenele vec'i (cea crestat) se deplaseaz prin pilul de se$ n celula receptoare (/i#! 1)! 0n acelai timp, n celula donatoare are loc resta ilirea structurii factorului /! la nivel popula%iei de acterii, consecin%a transferului factorului / este masculini area acesteia, adic se produce #eneralizarea caracterului / Dal celulelor acteriene!

/i#! 1! 5eprezentarea sc'ematic a procesului de con&u#are =n tip special de con&u#are este cel realizat ntre celulele acteriene care con%in factorul / inte#rat n cromosom (celule de tip Ffr) i celulele de tip / @ (/i#! .)! 0nte#rarea factorului / n cromosomul acterian nu se realizeaz la ntmplare , ci la nivelul unor situsuri ce prezint omolo#ie ntre cele dou tipuri de molecule! Celulele rezultate n urma unui asemenea proces de inte#rare , au primit denumirea de celule de tip Ffr (9i#' reGuenc? of recom ination)!

6odalitatea specific de inte#rare a plasmidei / n cromosomul acterian, face ca secven%a ori$ s fie localizat aproape de una dintre mar#inile plasmidei linearizate i inte#rate la captul acesteia, consecin%a fiind transferul specific al ADN monocatenar n celula receptoare! In a :!a etap, n cazul transferului dintre acteriile / D i / -, dup crestarea monocatenar la nivelul secven%ei %ri$, ncepe transferul AND monocatenar reprezentat de o scurt secven% din plasmida / i apoi de o copie a AND cromosomal al #azdei (/i#! .)! Cea mai mare parte a plasmidei / rmne la nivelul celuilalt capt al cromosomului, i doar foarte rar este transferat n celula acceptoare! Cantitatea de informa%ie #enetic transferat, proprie celulei donatoare, este direct propor%ional cu timpul n care cele dou celule au stat n contact (cu ct contactul este mai lun#, cu att se#mentul de ADN transferat va fi <

mai mare)! Astfel, pentru transferul complet al ADN cromosomal la E. coli sunt necesare apro$imativ >21.2 minute de contact ntre celule, n timp ce transferul plasmidei / din acteria / D ntr-o acterie / @ dureaz .-+ min! 4rocesul de transfer de se#mente cromosomale din acteria donor Ffr n cea acceptoare / @ este urmat de cele mai multe ori de transformare #enetic (fenomen controlat de o serie de enzime sintetizate de #azd) ceea ce nseamn c por%iuni din respectivul se#ment se inte#reaz n #enomul noii #azde fiind men%inut i transmis constant n #enera%iile urmtoare! 4rocesul de con&u#are dintre celulele Ffr i celulele de tip n unit%i de timp (minute)! Cransferul de #ene cromosomale acteriene mediat de plasmidele de se$ este numit se1$uc#ie* 0n urma con&u#rii / D $ / @ se o %in doar celule de tip / D , care sunt par%ial H diploide H, con%innd alturi de #enele proprii i #ene similare provenite de la acteria donatoare! :* Trans$uc#ia agic Cransduc%ia fa#ic este procesul prin care un fra#ment din cromosomul acterian este transferat de la o acterie la alta prin intermediul capsidei (nveliului proteic) anumitor acteriofa#i tempera%i! /enomenul a fost descris ini%ial la acteriofa#i specifici unor tulpini de Salmonella typhimurium, iar ulterior el a fost mai ine studiat n cazul fa#ului I specific tulpinilor de E. #oli ! 0n func%ie de structura #enetic a fa#ilor transductori i de mecanismul de formare a materialului #enetic al particulri fa#ice, au fost descrise dou tipuri de transduc%ie fa#ic, transduc%ie specializat i transduc%ie #eneralizat! Jacteiofa#ii ce realizeaz transduc%ia #eneralizat produc particule ce con%in, n cea mai mare parte, ADN provenit din acteria #azd (din orice parte a cromosomului) i doar o foarte mic parte #enom fa#ic! *n cazul fa#ilor ce determin transduc%ia specializat, ei produc particule ce con%in att #ene fa#ice (ma&oritare) ct i #ene cromosomale acteriene provenite dintr-o anumit re#iune a cromosomului acterian! Cel mai cunoscut acteriofa# ce realizeaz transduc%ie specializat este fa#ul I! *n forma lui natural, fa#ul I poate prelua, ca fa# transductor, doar scurte secven%e de ADN din #enomul #azdei n care s-a multiplicat (dup ce a parcurs ciclul lizo#en), dimensiunea acestora fiind limitat de capsida fa#ic! Secven%ele pe care le poate prelua fa#ul I sunt foarte precise! Cranduc%ia #eneralizat este mediat de fa#i virulen%i precum i de anumi%i fa#i tempera%i ai cror #enom nu se inte#reaz la nivelul unor situsuri specifice din cromosomul #azdei (de e$emplu fa#ul 41)! /
@

servete la realizarea 'r%ilor

cromosomale la acterii , distan%a dintre #ene (dispuse n ordine pe se#mentul transferat) e$primndu-se

>