ANALIZA STATISTIC A DATELOR DIN CINETICA ENZIMATIC Caracterizarea unei enzime include n general determinarea vitezei de reac ie maxime,

vmax, i a constantei Michelis, Km pentru fiecare substrat. Cunoaterea acestor parametri este util pentru: estimarea ratelor de reacie intracelulare, compararea diveselor izoenzime din diverse esuturi sau organisme, compararea calitativ a diverselor substrate i la definirea poten ialilor inhibitori sau activatori. Experiena a artat faptul c cei doi parametri (Km i vmax) pot duce la concluzii valide. n acest referat se urmrete descrierea unor metode de determinare a Km, vmax i Ki (constantei de inhibiie) i a deviaiilor standard pentru fiecare parametru cu precizarea avantajelor i dezavantajelor fiecareia dintre metode. Consideraii preliminare 1. Admiterea aplicabilitii ecuaiei Michaelis-Menten Iniial s-a plecat de la urmtoarele premize: viteza reaciei enzimatice (v) este strns legat de concentraia substratului ([S]); Km i vmax sunt parametri determinai de o hiperbol (a vitezei de reacie n funcie de concentraia substratului); ecuaia Michaelis-Menten deriv din trei considerente: o reacia invers este neglijabil n timpul msurtorii; o concentraia complexului enzim-substrat este neschimbat; o formarea complexului nu influeneaz concentraia substratului liber.

2. Definirea parametrilor Km i vmax Km este raportul a dou seturi de constante de reacie al caror numr i aranjament depind de numrul i ordinea etapelor intermediare din cadrul mecanismului de reacie. Analog, vmax este o funcie a constantelor de reacie i este proporional cu concentraia enzimei. Km este concentraia substratului necesar pentru obinerea unei viteze egal cu valoarea vmax/2. Constanta vmax reprezint viteza reaciei enzimatice cnd concentraia substratului este la saturaie. n cazul n care enzima catalizeaz o reacie n care sunt implicate mai multe substrate i concentraia unui substrat este meninut constant, legtura dintre viteza de reacie i concentraia substratului este guvernat de aceeai dependen. 3. Optimizarea condiiilor de reacie nainte de determinarea celor doi parametri (Km i vmax) trebuie stabilite condiiile optime de pH, temperatur, trie ionic, concentraia i stabilitatea enzimei etc. Scopul determinrilor experimentale este de a obine viteze ct mai mari de reacie la concentraii ct mai reduse ale enzimei.

4. Analiza valorilor graficului presupune urmtoarele etape: o confirmarea vizual a datelor experimentale; o analiza deviaiei standard; o verificarea preciziei rezultatelor se poate face astfel: folosind dependena Lineweaver-Burk (1/v n funcie de 1/[S]); folosind analiza Eadie-Hofstee (v n funcie de v/[S]) pentru calcularea direct a parametrilor Km i vmax; 5. Strategii generale pentru determinarea Km i vmax Determinarea parametrilor mai sus menionai implic o serie de premize: viteza de reacie iniial trebuie s fie liniar; dac reacia (schimbarea valorii absorbanei sau fluorescenei) are loc n absena unei componente se va sustrage valoarea obinut din aceea rezultat n prezena acelei componente; trebuie s existe un raport de proporionalitate ntre viteza de reacie i concentraia enzimei; valoarea estimativ a Km se poate obine folosind o dependen liniar (msurnd viteza de reacie la dou concentraii diferite ale substratului); sunt necesare minim 5 puncte pentru a obine o dependen MichaelisMenten bun; sunt necesare cel puin 3-5 msurtori la aceeai concentraie a substratului; Modaliti de reprezentare grafic A. Graficul hiperbolic (dependena vitezei de reacie n funcie de concentraia substratului) Metoda furnizeaz valorile cele mai apropiate pentru Km, vmax, Km/vmax i 1/vmax i a deviaiilor standard ale acestora.

B. Dependena Lineweaver-Burk (1/v n funcie de 1/[S]) este una dintre cele utilizate dependene. Baza matematic pentru aceast dependen este ecuaia MichaelisMenten. Aceast dependen permite estimarea raportului Km/vmax respectiv a 1/vmax prin msurarea tangentei respectiv a interseciei cu axa 1/v.

C. Dependena Eadie-Hofstee (este o depende liniar a parametrului v n funcie de v/[S]) deriv de asemenea din ecuaia Michaelis-Menten care devine:

v = vmax Km (v/[S])
Tangenta rezultat din aceast reprezentare este Km i intersecia cu axa v este vmax. D. Dependena Hanes-Wolff (este o depende liniar a parametrului [S]/v n funcie de [S]) deriv din dependea Lineweaver-Burk.

Tangenta rezultat din aceast reprezentare este 1/vmax i intersecia cu axa [S]/v este Km /vmax.