lnsulina

qi

ii de insulinl

3. INSULINA $I
3.I.INTRODUCERE

ANALOGII DE INSULINA
I. A. VereSiu

Tratamentul cu insulind este considerat ca cel mai important progres realizatinmedicind (prin faptul ci a schimbat radical prognosticul vital al unei categorii nu neimportante de pacienli, malea majoritate copii qi tineri), este poate caracteristica cea mai speciflcd a diabetologiei ca specialitate incepdnd din ianuarie 1922 qi reprezintdincd "piatra de incercare" a practicii de zi ctt zi a diabetologului gi nu numai a lui. cei peste 85 de ani parcurqi de la prima injecfie cu insulina au insemnat milioane de vieli salvate, o muncd neintrerupti in perfeclionarea farmacocineticii qi a farmacodinamicii preparatelor de insulind qi, nu in ultimul rAnd, trei premii Nobel (JJR Macleod gi FG Banting in 1923, F. Sanger in 1958, DC Hodgkin in 1964), insd 9i o dureroasd injustilie gtiinlific[ pentru compatriotul nostru Prof. Nicolae C. Paulescu, recunoscut de cdtre cei mai mul1i ca avdnd poate cea mai important[ qi decisivd contribulie la descoperirea insulinei. Dupd ce in anii '70 se oblinuserd insulinele animale cu o puritate aproape maximd (,,mono-component"), iar in urmdtoarele doud decenii s-a pus la punct tehnologia de fabricalie (mai int0i prin aqa zisa semi-sintezd, iar apoi prin metoda ADN-recombinant) a insulinelor umane (adicd avdnd structura primard identicd cu a insulinei umane), am asistat in ultimii 10 ani la lansarea asa-zigilor "analogi" de insuline umane, care sunt molecule de insulind "redesenate" ("designer insulins") prin modificarea structurii lor primare sau prin ataqarea altor molecule, cu scopul de a le ameliora farmacocinetica 9i farmacodinamtca gi de a le aduce cdt mai aproape de efectul ,,prandial" qi cel "bazal" al insulinei endogene.
3.2. STRUCTURA INSULINEI

Insulina, hormonul hipoglicemiant produs de celulele B din pancreasul endocrin, este o proteinf, de dimensiuni relativ mici, pe care baza de date SCOP (Structural Classification of Proteins) o incadreazd in clasa "Proteine mici, Grupa Insulin-like". Este formatd din doud lanluri polipeptidice, care

insumeazl51 de aminoac gdseqte sub form6 de mont romboedrice. Tendinla Ia laterale gi ale lanlului cen structura cuatemarE stru moleculei (1). DeEi duPat moleculard mai mare (aP se datora oligomerizdrii q de insulind este formatii t din 21 de aminoacizi qi doud lanluri sunt unite Pl 20 - Cis B 19, iar lantull A 11. Lanlul A este o stn: lanful B. Monomerul de insulil gi o manta formati in Pri' hidrofobe care in cursul r Insulina folosit6 inifial e pentru prima dati cristl descoperit faptul cd cris Analiza cri stale lor cu raz 19 69) ajungdndu-se aPo: format din asamblarea al la o distanld de t7 A, in Lanlul A are doud regirm stabilizate prin leg[trnfl t qi NH, sunt situate in ac de alfa-helix, iar la niv rdsucirea acestuia in senl disulfidic6 A7-87 este s face parte din nucleul hi La pH neutru qi la r distribuitd sub form6 dt la concentrafii mai mari asocierea in hexameri. hi'drofobe dintre mai mt

analogii de insulinl

insumeazd 51 de aminoacizi. in solufie, in funclie de concentrafie gi de pH, se

rrro, "iirtul. romboedrice. Tendinla la oligomeizxe produce mici varialii ale lanlurilor laterale 9i ale lanfului central, carezultatal constr6ngerilor pe care le impune structura cuaternard structurii ter,tiare, insd care nu influen! eazd, activitatea moleculei (1)' Deqi dupd primele cercet[ri s-a crezut cd insulina are o greutate moleculard mai mare (aprox. 12.000 daltoni), s-a constatat ulterior ca aceasta se datora oligomerizArii qi cd greutateareald,este de 5.808 daltoni. Molecula de insulind este formatd din doud lanluri polipeptidice, lanlul A acid, format din 21 de aminoacizi qi lanlulB,bazic, format din 30 de aminoacizi. cele doud lanluri sunt unite prin doud punli disulf,dice, cis A 7 - cis B 7 qi cis A 20 - cis B 19, iarlanlulAmai are o punte disulfldicd,,intern[,, cisA6 cis A 11. Lanful A este o structurd aparent compacti in jurul cdreia este infbgurat lanful B. Monomerul de insulind este o structurd globular[ cu un ,.nucleu,,hidrofob qi o manta formatd in principal din amino acizi polai av6nd insd qi dou6 zone hidrofobe care in cursul dimerizdrii qi hexamerizdrii sunt acoperite. Insulina folositd inilial era in stare amorft, p6nr in 1925 cana abet a reuqit pentru prima datd cristalizarea insulinei, iar noud ani mai tdrziu Scott a descoperit faptul cr cristalele romboedrice sunt complexe de Zn-insulind. Analizacristalelor curaze X s-a frcut inifial cu o rezolugie de 2,g A 6toagmn 1969) ajungdndu-se apoi pdnd ra 1,1 A (19g1). Hexamerul de insulind este format din asambl area atrei dimeri de insulind in jurul a doi ioni de Zn,situafi la o distan{d, de 17 A, in directd reralie cu His B 10 din flecare dimer. Lan{ul A are doui regiuni anti-paralele care formeazd,un alfa-helix imperfect, stabilizate prin legdturd disulfidicd internd, iar cele dou6 extremitafi, _cooH $.i Nl, sunl situate in acelagi plan. Lanlul B are de asemenea, o conformafie de alfa-helix, iar la nivelul glicinelor din poziliil e 820 B23 se produce 9i rdsucirea acestuia in sens invers ceea ce ii conferd aspectul literei V. ieg6tura disulfldicd A7-87 este situatd la suprafala moleculei, iar legdtura A20-B19 face parte din nucleul hidrofob (1). La pH neutru gi la concentralii fiziologice (aprox lng/ml) insulina este distribuitd sub formd de monomeri (forma activd, a hormonului), pentru ca la concentralii mai mari sd formeze dimeri, iar in prezen[a znsd se producd asocierea in hexameri. Formarea dimerilor este mediaia de interacliunile hidrofobe dintre mai mulli aminoacizi din lanlul B, care formeazd.gi legdturi

gdsegte sub formd de monomeri, dimeri gi hexameri, care au formu

30

Insulina pi analogii de insulinl

de hidrogen cu aceia$i regiune

(824-826) din molecula vecind. Granulele secretorii mature din celulele B-pancreatice conlin arii dense de aprox 50A diameku, cu o conformalie asemdndtoare cu a cristalului hexameric de insulind. S-a propus astfel cd hexamerul cu doi ioni de Zn este forma de depozitare a insulinei, aceast6 formd rdspunzdnd atAt criteriului de eficienld a depozitdrii qi ferind in acelaqi timp insulina de acliunea enzimelor proteolitice (Blundell et al 1972). Studii ulterioare (prin rezonanld magneticd nuclear[) au demonstrat faptul cd hexamerul2 Zn-insulind mai conline un locus, in centrul hexamerului, in care este legat un ion de Ca, care are de asemenea un efect
stabilizator. La concentralii de 10 ori mai mari ale 7.n decdt cele necesare cristalizdrii insulinei qi cdnd in locul fosfatului se folosegte acetatul ca solufie tampon, produsul devine insolubil la pH de 7,4. Cu aceastd tehnologie au fost produse doud insuline cu efect prelungit, insulina "Ultralente@", forma cristalina qi cu efect mai indelungat qi insulina "semilente@", forma amorfd cu un efect mai scurt. Amestecarea insulinei cu protamina, in prezenfa Zn, fenolului sau metacrezolului produce un precipitat. Acest precipitat a fost realizat pentru prima dat6 de cdtre Hagedorn gi colaboratorii la Copenhaga in incercdrile de a prelungi efectul insulinei administrat[ subcutan. Ei au constatat cd acest precipitat, oblinut prin titrare, are o solubilitate minimd la pH-ul fiziologic. in cursul titrArii se produce un moment in care proporlia este cea potrivitd, pe care Hagedorn l-a numit "izofart". Analiza chimicd ulteriord a acestui precipitat aratd o proporlie de doi ioni de Zn qi 22 de molecule de fenol per hexamer qi o moleculd de protamind la 8,5 monomeri de insulind (Derewnda
et al, 1989).

la nivelul reticulului en& la rAndul ei, este transPo in Zn qi Ca gi unde se fo

acestor granule, proinsulir membrand, in produqi de

aminoacizilor 65, 66 Y P din care apoi sunt indq pentru ca in final si rdmfi Granulele care conlin atom de Zn) sunt ntrmitel are probabil scopul deast Aceste granule pot rimiil fi absorbite in granule mr sau secretate prin exocito doud ore (din care 5-10 I proinsulind, 30 min foru scinddrii proinsulinei in i Pragul de concentralir mai mic dec6t cel neoesa previne deplelia comPleili de proinsulind de c[tre celuleiBdeageneraAf,T
asiguratd de creqterea

co Studierea mutafiilor insulin6 au contribuit la acesteia. Au fost identific

3.3. BIOSINTEZA $I SECRETIA INSULINEI

Biosinteza insulinei se desftqoard dup[ modelul de acum destul de bine cunoscut al sintezei hormonilor polipeptidici. De altfel, celula B dispune de organitele speciflce acestui scop qi anume un reticul endoplasmic rugos abundent qi granule secretorii. Semnalul inductor (glucoza), acliondnd la nivelul regiunii promotoare a genei proinsulinei, situat[ pe bralul lung al cromozomului 11, rnrfrazd, sinteza de ARN mesager qi transcriplia preproinsulinei (un prohormon cu 110 aminoacizi), care apoi este translatat6

punctiformd in gena insu ca structrud primarE (Val 9i Phe-B25 inlocuiti cu cu insulina normald insii Indivizii cu aceast6 mrft de diabet sau sc6dere ato secretd qi molecule norn datoritd remanenlei prelu Afost de asemeneadescr asimptomaticl o muta{ie

Insulina gi analogii de

insulinl

31

la nivelul reticulului endoplasmic rugos qi scindatd in proinsulind. Aceasta la rAndul ei, este transportatd, in aparutul Golgi, care are un mediu bogat inZn qi Ca qi unde se formeazd. granulele de secrelie imature. in interiorul . acestor granule, proinsulina este scindatd, de cdtre endopeptidazele legate de membrand, in produqi de scindare succesivd (proinsulind scindatd la nivelul aminoacizilor 65, 66 qi proinsulind scindatd la nivelul aminoacizilor 32',33, din care apoi sunt indepdrtali aminoacizii adiacenli locului de scindare), pentru ca in flnal sd rdm6n5 insulina qi peptidul C (connecting peptide). Granulele care confin cristale de insulinS (hexameri avdnd in centru un atom de Zn) sunt numite granule mature. Cristalizarea hexameric6 a insulinei
are probabil scopul de a stabiliza moleculele qi de a stopa acliunea peptid azelor.

Aceste granule pot rimdne in compartimentul de depozitare a insulinei, pot fi absorbite in granule mai mari unde insulina este degradatd prin crinofagie, sau secretate prin exocitozd. intreg acest proces de biosintezddureazd aprox. doud ore (din care 5-10 min revin transcripliei qi scinddrii preproinsulinei in proinsulind, 30 min formdrii granulelor secretorii imature qi aprox. 60 min scinddrii proinsulinei in insulini gi peptid C). Pragul de concentrafie al glucozei care stimuleazdsintezaproinsulinei, este mai mic dec6t cel necesar secreliei insulinei, ceea ce, in condilii flziologice, previne deplefia completd de insulind a celulelor P (2,3).Stimularea sintezei de proinsulind de cdtre glucozd qi alli secretagogi depinde de capacitatea celulei B de a generaAIP, iar cuplarea stimulului metabolic cu biosinteza este asiguratd de cregterea concentraliei intracelulare de K. Studierea mutaliilor naturale qi a celor induse artificial ale molecutei ae insulind au contribuit la elucidarea unor aspecte ale biosintezei gi acfiunii acesteia. Aufost identificate cdtevafamiliiincare unii membrii aveau o mutalie punctiformd in gena insulinei, ceea ce genera molecule de insulind modificate ca structurd primard (Val-A3 era inlocuit[ cu Leu, Phe-824 inlocuitd cu Ser gi Phe-B25 inlocuit[ cu Leu), care au o imunoreactivitate practic identicd cu insulina normal5 insd cu o capacitate de legare de receptori mult redus6. Indivizii cu aceastd mutalie, transmisd autosomal dominant, au forme ugoare de diabet sau scddere a toleranfei la glucozd. Fiind heterozigofi, aceqti pacienfi secretd gi molecule normale de insulin[ insd au o hiperinsulinemie evidentd datoritf, remanenlei prelungite in circulafie a moleculelor de insulind anormald. Afost de asemenea descrisd la membrii cdtorva familii cu hiperproinsulinemie asimptomatici o mutalie in molecula de proinsulind (419-65 inlocuiti cu His)

32

Insulina gi analogii de insulini

carc altereazd procesarea intra B-celularl a acesteia (nerecunoa$terea locului de clivare a lanlului A de peptidul C). Procesul de biosinteza a insulinei se incheie cu formarea granulelor secretorii mature care conlin insulina biologic activ6. Fiecare celuld B conline aproximativ 13,000 de granule secretorii (4). Calea principald de eliberare a insulinei din celulele B in spaliul interstifial este exocitoza Caz* -dependenti a granulelor secretorii. Studii efectuate in ultimul deceniu au reuqit sd descifreze mai multe dintre complexele evenimente ale procesului pre- gi post-exocitotic in celulele endocrine (5). Stimulul fiziologic al secreliei de insulind, gltcoza,produce la concentralii in domeniul normalului, oscilalii ale potenfialului de membrand intre platouri de depolarizare (peste care se suprapun secvenfe potenliale de acfiune) gi intervale inactive de repolarizare (6), care sunt consecinla unor oscilalii ale concentrafiei intracelulare a C** gi care se materializeazd. in secrelia pulsatorie a insulinei. Activitatea electricd a celulelor B este liniar dependenta de concentralra glucozei qi atunci cdnd aceasta depagegte aprox. 360 mg/dl descdrcarea potenlialelor de acliune devine practic continuS. La nivelul membranei celulelor B au fost identiflcate cel pufin 10-20 de tipuri de canale ionice dintre care cele mai importante in secrefia insulinei sunt canalele de K* -ATP dependente gi canalele de Ca2* dependente de voltaj. Canalele de K. - ATP dependente sunt spontan deschise la concentralii mici ale glucozei qi prin efluxul ionilor pozitivi de K. se menline electronegativitatea intracelulard caructeristici potenlialului de repaus. Pdtrunderea glucozei in celulele B, prin intermediul transportorilor GLUT 2 gi apoi glicoliza genereazd creqterea concentraliei de AIP (gi scdderea celei de ADP) ceea ce are ca o primd consecinld inchiderea canalelor de K* - ATP dependente, scdderea electronegativitafii intracelulare, deschiderea canalelor de Ca2* dependente de voltaj gi influxul ionilor de Ca2* gi declansarea depolarizdrir. AIP-ul aclioneazd ca qi un blocant al canalelor de K* in timp ce Mg-ADP produce deschiderea acestora. Celula B depolarizatdmaipoate rdspunde qi la alfi stimuli electrogenici cum este arginina care are o moleculd puternic electropozitld. gi care are un efect minor asupra secreliei de insulind la concentralii mici ale glucozei insa acest efect devine major la concentrafii mari ale glucozei, atunci c6nd canalele de K* sunt complet inchise. Canalul de K* (inwardly recti$ing potassium channel) este format din patru subunitdli gi existd doud tipuri de astfel de canale: Kir 6.1 si Kir 6.2. Primul este prezent in celulele

musculare netede vasculae cel de al doilea, care e$e p K. - ATP dependent este as structura polipeptidica ooq numili "caseta care leagiAl S-au descris douitipit 0 qi o pancreatice, in cchil gi SUR2, cu dou[ suhifi cardiacd qi SUMB in ccluH

Grodsky qi col, au & (Endocrinolgy, 1968) frrytl o primd fazdde secre,tierqi secrefie mai lent5 inse srsffl poate fi indus6, aHturi de gt
insa pentru faza de secrelie

aminoacizi). Mdsurarea capacitan-tei suprafala acesteia) este mef,r rezoh4ie temporald (aprox (7). Alipirea membranei g deschiderea porului de secrt urmd qi astfel o modificare a O familie de proteine dem NSF: N-ethylmaleimide scl membranelor. Cele mai iq 25, apalJindnd membranei s granulelor secretorii. Accst unui fermoar (6). Aceste g synaptotagminelor ar putea alt grup de proteine care kr important in secrelie, acfui experimentale lipsa acesttr j Din punct de vedere fim este format din mai multe, sunt situate granulele care secrefie (readly-releasable p

l--

Insulina $i analogii de

insulinl

33

tr

)r

e
a,

a
E

musculare netede vasculare gi in astrocite qi are caracteristici diferite fala de cel de al doilea, care este prezentin majoritatea celulelor. Fiecare canal de K* - ATP dependent este asociat cu un receptor pentru sulfonilureice (SUR), structura polipeptidica complexd care face parte din familia transportoriloi numili "caseta care reagdATp " (ATp binding casette ABC). S-au descris doud tipuri de astfel de receptori: SUR1 , prezen[iin celulele F qi s pancreatice, in celulele intestinale care secretd clp-i qi i, ,r"uroni gi SUR2, cu doud subtipuri suR2A, prezen[i in musculatura scheleticd qi cardiacl qi SUR2B in celulele musculare netede. Grodsky qi col. au demonstrat cu mai mult de 30 de ani in urmi (Endocrinolgy, 1968) faptul c[ secrefia de insulind se desfaqoar6 bifazic, cu o primd fazS' de secrefie rapidd (care durea zd 5-10 min), urmat[ de o fazd, de secrelie mai lentd insd suslinutd in timp (c6teva ore). Fazarapidd de secrefie poate fl indus6, aldturi de glucoza qi de alli stimuli cum sunt sulfonilureiceie, insa pentru faza de secre(ie lentr este necesar un stimul metabolic (ex. glucozd, aminoacizi). Mdsurarea capacitanlei membranei celulare (direct propor.tionald cu suprafala acesteia) este metoda care a permis monitorizarea cu o foarte bund rezolulie temporalS (aprox. 1 ms) a dinamicii traflcului granulelor secretorii
deschiderea porului de secrefie produce o creqtere a suprafelei acesteia din urmd gi astfel o modificare a capacitanfei care poate fl ?nregistratd.

*s**

(7)' Alipirea membranei granulelor secretorii de

*.-b.uru

celulard

qi

25, aparfin6nd membranei celulare gi synaptobrevina, care line de membrana granulelor secretorii. Acestea produc fuziunea membranelor dupa modelul unui fermoar (6). Aceste proteine, alituri probabil de proteine din familia synaptotagminelor ar putea juca rolul de senzori pentru ionii de Ca2*. Un alt grup de proteine care leagd GTP, proteinele Rab, au de asemenea un rol important in secrefie, aclionand ca qi "fr6ne" ale acestui p.o.", igr. experimentale lipsa acestor proteine produce scdderea toleranlei la glucozd,. Din punct de vedere funclional dar qi spafial pool-ul de granule secretorii este format din mai multe compartimente. Imediat sub membrana celularl sunt situate granulele care constituie compartimentul gata pregatit pentru secrefie (readly-releasable pool). Aceste granule pot fl seiretate imediat, fbrd

familie de proteine denumite sNAp (soluble NSF attlchement protein, NSF: N-ethylmaleimide sensitive fusion protein), este implicatd in fuziunea membranelor. cele mai importante dintre acestea sunt syntaxina qi sNAp_

i;;;il;

34

lnsulina

qi analogii de

insulinl

nicio pregatire (priming) prealabild. Un al doilea compartiment cuprinde granule situate in apropierea plimului (la o distanta de aprox. un diametru al granulelor) care pentru a putea fl secretate necesitd "preg6tire". tn timp ce secrelia granulelor din primul compartiment nu necesitd consum energetic,
exocitoza celor din al doilea compartiment este AIP-dependent[ (6). Proteinele SNARE nu intervin numai in fuziunea membranelor ci ele au gi importantul

in

exocitoz[. ExPunerea liberi, produce acelaqi stimulator al glucozeiprin stimularea, via

liPsa

rol de a direcfiona influxul de ioni de Ca2* spre zonele membranei plasmatice

vecine cu granulele secretorii. Dupd golirea, prin simulare, a compartimentului "gata pentru secrefie" capacitatea de secrelie se restabileqte treptat pe parcursul a aprox' 1,5 min necesare reumplerii acestuia din compartimentul imediat vecin (6). Un al treilea compartiment este format din granulele secretorii situate in citoplasmd qi care parcurg traseul spre membrana celulard prin miqcari saltatorii sau prin difuziune lentd, prin releaua microtubulard, in care un rol major il au tinesin-ele AlP-dependente. fn condilii experimentale, distrugerea relelei microtubulare cu vincristind produce o reducere cu peste 50Yo a secreliei de insulind indusS de glucozl (9). Aceastd reducere se coreleazd cu o scadere cu 85Yo amiqc6rilor saltatorii ale granulelor (6). Reglarea metabolicd a secreliei insulinei de cdtre glucozd' este mediatd de modiflcdrile in concentrafia K* in spaliul sub-membranar' Modiflcdrile

3.4. MECANISMEIS" GENERALE

Receptorii Peutru gdsesc practic fo celule variind ffi adipocitelor gi d

pe braful parte dintr+

scrlt{

insulin s-a identifica familie esh

Efectd
facilitarea insn nrmi in celuletc Pe de alE

concentraliei ADP qi ATP "pregdtesc" granulele pentru secrefie prin modiflcarea pH-ului intragranular. Odatd produsd exocitoza membranele granulelor secretorii sunt endocitate printr-un proces mediat de clathrin. Relevanlapentru diabet aproceselor mai sus sumarizate este intens evaluat[ la ora actuald. Perturbdri in glicolizd sau in metabolismul oxidativ ar putea induce modificdri ale concentraliei dianamice a ADP si AIP. Polimorflsmul genelor care codificd canalele de Ca2* sau alte proteine care participd la exocitozd ar putea fl diabetogen. Polimorfismul unei singure nucleotide din gena care codiflcd syntaxina s-a dovedit a se asocia cu vdrsta de debut 9i necesarul de insulind la pacienfii cu diabet tip 2 (10). Nu in ultimul r6nd acizii gragi liberi, ai cSror concentralie in sdngele portal este crescutd la pacienlii cu
diabet qi/sau obezitate qi/sau sindrom metabolic, exercitd de asemenea efecte complexe asupla secrefiei de insulind. Prezenla unui aport de'acizi graqi liberi este necesard pentru secrelia normald a insulinei. O creqtere rapidd a concentraliei acestora amplifici secrelia de insulind indusS de glucoz[, prin creqterea concentraliei de acil-CoA qi stimularea unor enzime care intervin

aclionfd
qi sintea

h,d

[f

ficatuIui

sintea&

$fr

Insulina qi ana

de

insulinl

35

Expunerea cronicd la concenhalii crescute de acizi graqi liberi, produce acelaqi efect dar prin intermediul obezitdlii se reduce efectul stimulator al glucozei. Cregterea concentraliei de oAMP are efect incretinic prin stimularea,vialipazahormono-sensibild din celulele lipolizei (11).
B,

in exocitoz6.

3.4. MECANISMELE DE ACTIUNE ALE INSULINEI. ASPECTE GENERALE

Insulina iqi exercitd efectul principal, cel asupra glicemiei, prin facilitarea transportului glucozei prin membrana celulard. Receptorii pentru insulind sunt structuri polipeptidice complexe care se gdsesc practic in toate lesuturile vertebratelor, numdrul lor pe suprafala unei celule variind intre 40 in cazul eritrocitelor circulante qi 200,000 in caztl adipocitelor gi al hepatocitelor (12). Gena acestor receptori este localizatd, pe bralul scurt al cromozomului 19 (19p13). Receptorul pentru insulind face parle dintr-o familie care mai include receptorul pentru IGF-1 qi aqa-numitul insulin receptor-related receptor (IRR), un receptor ,,orfan,, pentru care nu s-a identiflcat incd un ligand. Omologia structurii de aminoacizi in aceastd familie este de 80%o.

al legdrii insulinei de receptorii specifici constd in facilitarea transportului transmembranar al glucozei. Acest efect este prezent insd numai in musculatura scheleticd, in adipocite qi la nivelul miocardului. in celulele endoteliale transportul de glucozd nu este dependent de insulind. Pe de altd parte insd, insulina stimuleazd" sinteza proteicd in toate celulele, acliondnd la nivelul genelor speciflce qi favorizdnd preluarea aminoacizilor qi sinteza lipidelor in {esutul adipos, ficat qi musculatura scheleticd gi inhiba lipoproteinlipaza hormonosensibild. Insulina inhiba gluconeogeneza la nivelul ficatului gi rinichilor qi stimule azd transportul transmembranar al ionilor gi sinteza de ADN in practic toate lesuturile (fig. i).
Efectul major

Insulina qi ana

de

insulinl

35

Expunerea cronicd la concenhalii crescute de acizi graqi liberi, produce acelaqi efect dar prin intermediul obezitdlii se reduce efectul stimulator al glucozei. Cregterea concentraliei de oAMP are efect incretinic prin stimularea,vialipazahormono-sensibild din celulele lipolizei (11).
B,

in exocitoz6.

3.4. MECANISMELE DE ACTIUNE ALE INSULINEI. ASPECTE GENERALE

Insulina iqi exercitd efectul principal, cel asupra glicemiei, prin facilitarea transportului glucozei prin membrana celulard. Receptorii pentru insulind sunt structuri polipeptidice complexe care se gdsesc practic in toate lesuturile vertebratelor, numdrul lor pe suprafala unei celule variind intre 40 in cazul eritrocitelor circulante qi 200,000 in caztl adipocitelor gi al hepatocitelor (12). Gena acestor receptori este localizatd, pe bralul scurt al cromozomului 19 (19p13). Receptorul pentru insulind face parle dintr-o familie care mai include receptorul pentru IGF-1 qi aqa-numitul insulin receptor-related receptor (IRR), un receptor ,,orfan,, pentru care nu s-a identiflcat incd un ligand. Omologia structurii de aminoacizi in aceastd familie este de 80%o.

al legdrii insulinei de receptorii specifici constd in facilitarea transportului transmembranar al glucozei. Acest efect este prezent insd numai in musculatura scheleticd, in adipocite qi la nivelul miocardului. in celulele endoteliale transportul de glucozd nu este dependent de insulind. Pe de altd parte insd, insulina stimuleazd" sinteza proteicd in toate celulele, acliondnd la nivelul genelor speciflce qi favorizdnd preluarea aminoacizilor qi sinteza lipidelor in {esutul adipos, ficat qi musculatura scheleticd gi inhiba lipoproteinlipaza hormonosensibild. Insulina inhiba gluconeogeneza la nivelul ficatului gi rinichilor qi stimule azd transportul transmembranar al ionilor gi sinteza de ADN in practic toate lesuturile (fig. i).
Efectul major

36

Insulina gi analogii de insulinl

Fig 3.1. Efectele insulinei

lnsulina

t>

GLUT3 esteprezentm o afinitate mare penfiu gl

Fosforilarea substratul ui

Oxidarea glucozei

glucozei la acest nivel. GLUT 4 este majorita musculare netede gi miOCit* GLUT 4. Stimulul insuli depozitare spre membmna GLUT 5 este transpu membranei epiteliale ale ir GLUT 6 este incompld GLUT 7 este transportl GIUT 8 este modulatd
3.5.

Sinteza proteinelor Preluarea aninoacizilor

FARMACOCTNETI( COMERCIALE

Funclia majord a insulinei, aceea de a facilita transportul transmembranar qi intracelular de glucozd,, se exercitd prin intermediul unor proteine complexe ataqate membranelor celulare qi membranelor organitelor celulare numite transportori de glucozd (GLUT).

de proteine GLUT are opt membri. prototipul folosit pentru descrierea acestor proteine este GLUT 4. Acesta este un laniporipeptidic cu 12 domenii transmembranare. Prima ansd extracelulard conlineiocurile de glicare, iar capdtul CooH-terminal, intracelular, confine situl de fosforilare gi o sJcvenld aminoacidicd care faciliteazd, endocitoza rapidd a transportorului ( I 3).
GLUT
1

Familia

este

prezentubiquitar

qi este

celule, aceastd cale este singura prin care se produce influxul de glucozd. GLUT 2 este exprim atmaiales de cdtre ceiulele pancreatice qi hepatocite. B El asigurd un flux transmembranar constant de glucizdla glicemii fiziologice qi la nivelul celulelor B asigur6 cuplarea stimulului gtcJmic cu secrelii de insulind.

al glucozei in condilii bazale, independent de insulina. in cele mai multe

implicatintransportul transmembranar

Farmacocinetica insulil administrare qi dinamica co injectarea de insulinl maru de disparilie a depozitului dinamice ale insulinemiei secretia endogena de insulil Farmacodinamica urma asupra glicemiei) ale insul hipoglicemiile gi acliunea h cu punerea la punct a tehnic glucozd, (clamp-ul euglicr exogene este evaluat indfue necesard qi ritmul cu care Deqi existf, un decalaj ten ale insulinei qi dinamica gli farmac o cinetica insulinelor. Deqi metodele de eval insulinelor s-au perfecfl ona gi acfiune a acestora precuil ce intr-o metaanalizil a22 d

Insulina $i analogii de

insulinl

37

este. transportorur pentru. fr.uctozd qi este prezentin membranei epiteriale ale celurere intestin,itui ruuli.. gi in rinichi. GLUT 6 este incomplet a"rJr.-GLUT 7 este tru",rqottg.ut a. grr.ord ra niverur microzom,or. GLUT 8 este modurat a" irrutira, insd cu frr;;iit;;;mpret cunoscute.

,:iA* $|ffi'.kT#m*ce GLUT 5

4 este majoritar in celulele insurinosensibile, adipocite, musculare netede qi miocite. cerurele Er este .p".in.., vezicurere

!f#i: ilffi *TI, GLUT

GLUT 3 este prezentmai ales Ia nivelul sistemului nt gr," o,a J. i g,.a .n

;il';;;"#';"TlT, ffl#:
din
aceste'

dep"ri,rtil;;;;i.
transrocarea

r""*i' i"

l3,ffitH??rN,rrcA

$r T,ARMAC oDrNAMrcA rNsuLrNELoR

Degi metodere de evaruare a farmacocineticii gi a farmacodinamicii insulinelor s-au perfecri"rui ."r,rrrr,'qlrorexitatea proceselor qi acfiune a acestoraprecum de absorbtie pi protocoalere neunifor.i"l. ,,raiu, ce intr-o metaanatizi explicd de a22 a" r,raiiiiz]., mrunr" lu acliune scurtd,

Farmacocinetica insulineror evaru eazd absorbfia acestora de la locur de administrare qi dinami"u .o.r""n,ruri", ,"r ptu.-uii... rJ"u.ru se face f,e prin rryectarea de insulind marcatd radioactiv, a. oUi".i., gi urmdrirea ratei de disparilie a depozitului subc;; _ metoda indirectd _ sau prin dozdrile dinamice ale insurinemiei ,r"r-"Tr.1 metoda directd (in aceastd situatie secrefia endogend de insulina poui. irnu.nt" ."ltjirr"f"l.,, Farmacodinamica *-u."qt" .r.r,"1. metabolice (in primur asupra gricemiei) ale insulin"t*. r6nd pe cere N.u;ursurile p. Lar putea produce hipoglicemi,e pi ac{iunea rr"""rii".?. .ort "ur. depdqite odatd cu punerea la punct a tehnicii menfinerii ergri;;#;;.r" glucozd (clamp-ur eugricemij r..rrrr" adaptatdde prin aceastai.r,ri* ailJ;;. efectur insurinei exogene este evaluat indirect prin parametrii cum .unt necesard qi ritmul cu de glucozd care ea este administrata "untrtutea p.nt *u ri"nfine Deqi existd un decalaj t"-porui ino..airru.ri"" ."r*rir"fi,or euglicemia. ale insulinei qi dinami"u.gfi.".iir"r,"On, plasmatice _-_^, rrr,, aceastd auciisra tehnicd renmcd se poate explora gi se farmacocinetica insulinelJr-

iii,

url;"*;;st

,;";;

38

Insulina qi analogii de insulind

s-au constatat intervale largi de timp pentru apatilia

acliunii (0,08-0,5 ore),

pentru durata acliunii maxime (0,75-4 ore) $i pentru durata totald a acfiunii (4-12 orc). Monomerii de insulind au tendinla naturald de a se asocia prin legdturi non-covalente qi de a forma dimeri, tetrameri si hexameri, fenomen observat gi in granulele secretoare din celulele B. $i preparatele comerciale confin, intr-o stare de echilibru, monomeri qi polimeri (T1Yohexarneri) de insulind. Procesul de absorblie a insulinelor dupd administrarea subcutand parcurge etapele de dizolvare in spajiul interstitial, disociere pdnd la stadiul de monomeri qi apoi de difuzie prin peretele capilar (absorblia pe cale limfatica este nesemniflcativd) (17). Absorblia analogilor cu acliune rapidd (,,prandial[") este acceleratd prin faptul cd modific6ndu-se strucura lor primard, este impiedicatd polimerizarea qi deci disocierea nu mai este necesar[. Primul analog de insulind a fost inregistrat in 1996 (Humalog@ Eli Lilly), iar modificarea a constat in inversarea succesiunii Pro-Lis din pozilia 28-29 a lanlului B de insulina. ln anul 2000 Novo-Nodisk a inregistrat insulina aspart (l'[ovoRapid@) la care s-a inlocuit prolina din pozitia B28 cu acidul aspartic, iar in2004 Sanofi-Aventis a inregistrat insulina glulisine (Apidra@) la care asparagina din pozitia 83 este inlocuitd atlizinaiar lizina din pozitia 829 cu acidul glutamic. Toate aceste modificdri anuleazd tendinfa naturald a insulinei la polimerizare, factlhitnd astfel absorblia. in cazul analogilor de insulind cu acliune lungd (,,ba2a16"), prin modificarea caracteristicilor flzico-chimice (glargin) sau prin ataqarea unei molecule de acid gras (detemir) se realizeazd o prelungire a disocierii gi o uniformizare a acesteia. Primul analog cu duratd lungd de acliune inregistrat in 2000 a fost insulina glargine (Lantus@, Sanofi-Aventis) la care asparagina din pozilta2l de lanlul A este inlocuitd cu glicina, iar la capdtul C-terminal al lanlului B sunt addugate doua resturi de arginind. Al doilea analog cu duratdlungd de acfiune, inregistrat in2004, este insulina detemir (Levemir@, Novo-Nordisk) in care lalizina dinpozi\ra B29 este ataqatd o moleculd de acid miristic. Caracterul acid al insulinei glargin qi legarea de albumina plasmaticd a insulinei detemir, prelungesc durata lor de acfiune. Alli factori care influenleazdrata de absoblie subcutand a insulinelor: ' Volumul qi concentra{ia insulinelor administrate sunt invers proporlionale cu vitezade absorblie (15,16,17). Insulinele cu concentrafia

de 100 U/ml se absorb ff de 40U/ml, datoritii fa1il mai mici. Injectarea tmo insulinele Prandiale) P're

'Factorihemodinamiri perfuziei sanguine in ro noi capilare prin exPrm accelereazd. absorblia I

(efectul de "barier6" Per de aproximativ 6000Da

de absorbfie. 'Locul de administren

din lesutul subcutanat t regiunii abdominale)- E

feselor qi coapselor- inrtr

faptul cdratade dimim mai rapidd la nivelul al gli cemiile PostPrandiak

abdominald, comParalit absorblie a insulinelor, indicalia ca insulinele subcutanat abdominal ( aproximativ 4-5 cm p cadranul medial care e locurilor de administra in interiorul aceloragi rr

'

Profunzimea injecli

absorblie. Inj ectarea in c[ ea se Poate Product la subiecli cu indice dr tehnicd de ultrasonogr dintre ei, folosind tehr insulina intramuscular

Factorii mai sus menlir

a fa'macocineticii qi farr

,;dr-?

Insulina qi analogii de

insulini

39

de 100 U/ml se absorb insd cu aceeagi cineticd ca gi cele cu concentralia de 40U/ml, datoritl faptului c[ se administreazd. in volume proporlional mai mici. Injectarea unor doze mai mari de insulind (peste 16-20 U pentru insulinele prandiale) prelungeqte semniflcativ durata lor de acliune. ' Factori hemodinamici locali qi caliti{ile membranei capilare. Creqterea perfuziei sanguine in zona de administrare sau fenomenul de recrutare de noi capilare prin expunerea la c[ldur6, masaj local sau prin efort fizic accelercazd absorblia. Suprafala qi permeabilitatea membranei capilare (efectul de "barierd" pentru moleculele de insulin6 care au o dimensiune de aproximativ 6000 Da) sunt, de asemenea, direct proporlionale cu vrteza
de absorbfie. ' Locul de administrare. Absorblia cea mai rapid5
a insulinelor se produce jumdtatea (mai din lesutul subcutanat abdominal ales, din superioard a regiunii abdominale). Ea descreqte progresiv la nivelul brafelor qi apoi al feselor qi coapselor. intr-un studiu cu insulini marcatd cu I 125 s-a constatat faptul cd.rata de diminuarc a depozitului subcutan de insulind este cu86Yo mai rapidd la nivelul abdomenului decdt al coapsei (18). De asemenea, glicemiile postprandiale sunt cu29o/o mai mici dupd injectare in regiunea abdominald, comparativ cu coapsa (19). Aceast[ variabilitate a vitezei de absorblie a insulinelor, in funclie de locul de administrare, argumenteazd. indicafia ca insulinele prandiale sd fie administrate in lesutul celular subcutanat abdominal (cu exceplia unei zone circulare cu un diametru de aproximativ 4-5 cm periombilical), iar cele bazale la nivelul coapsei (in cadranul medial care este mai bogat in lesut celular subcutanat). Rotalia locurilor de administrare, pentru a preveni lipodistrofia, trebuie sd se facd in interiorul aceloragi regiuni (14,15,17). ' Profunzimea injec{iilor este qi ea direct propor}ionald cu viteza de

absorblie. Injectarea intramusculard accelereaza absorblia qi s-a constatat c[ ea se poate produce, uneori, chiar qi folosind ace de 8 mm, mai ales la subiecli cu indice de masd corporald mai mic gi la copii (20). Printr-o tehnicd de ultrasonografie s-a putut constata la un lot de copii cd 30oh dintre ei, folosind tehnica lor obiqnuitd qi ace de 12,7 mm, iqi injectau insulina intramuscular (20).

Factorii mai sus menlionali explicd, printre altele, importanta variabilitate

a famacocineticii qi farmacodinamicii insulinelor administrate

subcutanat

40

Insulina 9i analogii de insulinl

Tabelul 3. 1. Caracteristicile farmacodt

de 25oh in,J]airrdividual care, expdmata prin coeflcientul de varialie, este a ratei de absorblie fiind mai 50oZ interindividual (17). Aceast[ variabilitate lungd, si de aceea exprimata in cazul insuiinelor cu acliune intermediard 9i s6 se fac6 la intervale de 2-5 se recomanda ca modificarea dozel0r acestora cazul ,ir. firj.], g..r.rul, variabilitatea absorbliei este mai pufin evidentd in analogilor de insulinf,' sau legate de Dipa absorblia in circulalia generald, insulinele circuld liber policlonale (15)' Prevalenla anticorpi, care sunt imunglobuline din clasa Ig G, sc[zut progresiv odat[ cu acestoi anticorpi la pacilnlii tratafi cu insulind a ea fiind 50-60%o la pacienlii creqterea gradului de prr.ifi"a.e a insulinelor, 44o/,la pacienfii tratali numai tratalicu insuline porcine monocomponent qi de umane este datoratf,' cu insuline umane (22). Imunogenicitatea insulinelor protamind in primul rdnd, preparut"lo, cu acliune intermediar[, care conlin ea poate reduce (Zi,tS).Legarea insulinelor de anticorpi este reversibil6, insd la nivelul receptorilor' cantitatea de insulind liber6, capabitd sd aclioneze pe langd cel qi se poate constitui astfel un "al doilea depozit" de insulind, plasma (T ll2) este scurtd, de subcutanat. Rata de injumdtalire a insulinei in unul plasmatic 3-5 minute. OistriUulia insulinei se face in trei compartimente, qi unul extravascular cu echilibrare rapid[, 9i un al treilea compartiment insulinei de tot extravascular, cu echilibrare lent6, .u." "or.tpunde legdrii receptorii sPecifici. Degradareagiexcreliainsulinelorexogeneseproducemaialeslanivelul rinichilor (10-20%) ficatului (60-80%) qi inir-o proporlie mai mic[ la nivelul insulin6' Complexele (23). Dejradarea hepaticd este mediati de receptorii de intracelular' La nivelul insulina-receptor sunt internalizate qi apoi degradate qi, parfial, reabsorbitd in rinichilor insulina este flltrat[ la nivelul glomerulilor final6 se poate regdsi tubii conto(i proximali, unde este gi degiadat6. in urina cel mult 1% din insulind (24,14)' in tabelul 1. sunt redate carcteristicile farmacodinamice ale insulinelor inregistrate la noi in lard (umane qi analogi)'

qi de

Irsutire

-c, ac{iune raPidi

- Humalog

(L)

- NovoRaPid'(N) - Apidra (SA):

Insuline cu acfiune scurtl l - ActraPid

(N)

- Humulin R (L) - lnsuman RaPid (SA)

ffi; * u"ti,in. in "rmediari(t'il

- HumulinN (L) - Insulatard (N)

- lnsuman Bazal (SA)

- Lantus

(SA)

lnsuline bifazice (prcamestecae) - Humulin M2,(L)

- Humulin M3 (L) - Insuman Comb 25 (SA) - Insuman Comb 50 (SA) - Mixtard 20 (N) - Mixtard 30 (N) - Mixtard 40 (N) - Mixtard 50 (N)

Analogi - HumalogMix 25 (L) - HumalogMix 50 (L) - NovoMix 3O(N) A - Sanofi'Aventis Pharma, L - Eli + - timpul Pdn6 la atingerea conce

3.5.1. Insulinele Prandia Insulinele Prandiale regular, solubile, cristalir

umand). Aceste insuline s excep[ia aqa ziselor doze

asemenea sunt singurele c

Insulina gi a

de insulintr

Tabelul 3' l ' caracteristicile farmacodinamice ale insulinelor folosite in fara noastrd (2007)

A - Sanofi-Aventis pharma, L _ EIi Lilly &Co, N - Novo-Nordisk A/S. * - timpul pdniLlaatingerea concentrafiei
de platou.

umand)' Aceste insuline se injecteazapractic intotdeauna inaintea meselor, cu exceplia aga ziselor doze "de coreclie; (care se adminitreazii intre mese) gi de asemenea sunt singurele care se folosesc in tratarhentul crizelor hiperglicemice

3'5'1' rnsulinele pr:n-diate (cu acriune rapidd si cu duratd scurtd). Insulinele prandiale sunt cele cu durata ,Lu.ta de acfiune (sinonime: regular, solubile, cristaline) gi cele cu acfiune rapidd, (anarogi de insulind

42

!nsulina gi analogii de insulinii

insulin[. Locul recomandat pentru administrarea lor este regiunea abdominald, locul in care absorblia este cea mai rapidi, insa se pot injecta qi intramuscular qi intravenos, in urgenle. Insulinele cu duratd scurtd de acliune sunt solufii clare care conlin insulind cristalinS, stabilizatori qi antiseptice. Dupd injectarea lor subcutanat au loc procesele de disociere, dizolvare gi difuzie, ceea ce face ca intervalul necesar p6n6la aparilia acliunii (50% din acliunea maximd) si fie de 30 minute pand la o ord. Acest decalaj ?ntre momentul injectdrii gi cel al instaldrii acliunii impune administrarea lor cu cel pufin 30 minute inaintea meselor, ceea ce poate crea un discomfort pentru pacienli. Chiar qi respect6nd acest interval, momentul de acliune maximd (la 2-3 ore pentru insulinele umane) este mai tardiv decdt cel al insulinei endogene, ceea ce explicd uneori hiperglicemiile postprandiale, iar durata acfiunii efective (3-6 ore pentru cele umane) se extinde peste durata creqterii postprandiale a glicemiei, ceea ce poate produce hipoglicemiile tardive. Un progres semniflcativ in farmacocinetica qi farmacodinamica insulinelor prandiale l-a reprezentat sinteza analogilor de insulind uman6 cu acfiune rapid[. Ipoteza de la care s-a plecat a fost cd reducerea/anihilarea tendintei naturale a insulinelor la agregare ar putea creqte vitezalor de absorblie qi scurta durata lor de acfiune. Primul dintre acegtia a fost insulina Lis-Pro (Humalog@ Eli Lilly&Co). inregistrarea acestuia s-a frcut in anul 1996. Sinteza insulinei lispro s-abazat pe observafia conform cdreia hormonul IGF-1 (insulin-like growth factor-1), degi are similaritdli de structurd cu insulina, nu are tendinfa la agregare. Aceastd caracteristicd a fost atribuitd secvenlei lisind-prolini in IGF-1 fald de prolind (B28)-lisind (829) in insulina umand. prin inversarea acestei succesiuni (de unde qi numele de lispro) s-a oblinut un analog cu o constantd de dimerizare de 300 de ori mai micd decdt cea a insulinei umane (22). Deqi afinitatea insulinei lispro fal1 de receptorii IGF-I este cu 50o% mai mare decAt a insulinei umane, in vitro nu s-au constatat diferenfe intre capacitateamitogenda acestora(22). Profilul farmacocinetic al insulinei lispro este mult mai apropiat de dinamica secreliei prandiale endogene de insulind. Debutul acliunii se produce mai repede decAt in cazul insulinelor cu duratd scurtd de acliune (la aproximativ 5-15 minute dupd injectare), momentul de acliune maximd este mai precoce, iar durata totald a ac{iunii efective este mai
scurt5..

qi pentru pompele de

qi mai mari decdt insulinel insulinei lispro, evaluat prin

substituliei prandiale cu lisp ' reducerea hiperglicemiil ' reducerea frecven{ei hi1 ' flexibilitate mai mare at datoritd faptului cd lispro se postprandial (foarte imporE Durata mai scurti de a substitulie bazald., aceasta fo a cel pulin doud injecfi de I pacienlii cu diabet zahantli endogend (evaluatd prin doz intervalul interprandiat (20). in anul 2000 a fost irm%i! umand cu acfiune rapid5, ir La acest analog, reducerea t s-a produs prin inlocuireaprt electronegativitatea sa impio Al treilea analog prandir fost inregistrat in lara noastri polimerizare este net diminu lizina iar lizina din pozitia B Adaosul deZn,cuefects nu le modificd propieti!ile fr

3.5.2. Insulinele bazale (cur Insulinele zise bazale au mare a acfiunii comparativo

intArzierea absorbflei 9i

modif,cdri: reducerea sohrl protaminei, prin adaosul de Insulinele cu acfiune in cu tendinla la precipitare..d

Degi se absoarbe mai repede gi atinge concentrafii plasmatice mai precoce

uqoar6, inainte de adminism variabilitate mare a actiunii a