Sunteți pe pagina 1din 99

Curs1 GENETICA, ABORDAREA DIN PUNCT DE VEDERE MOLECULAR Ramurile geneticii G e n e t i c a este tiina care studiaz ereditatea i variabilitatea

a lumii vii Patru ramuri: Genetica fundamental Genetica populaiilor Genetica cantitativ Genetica molecular 1! Genetica "#un$amental%& men$elian% (denumit i genetica clasic) studiaza modul de transmitere ereditar a caracterelor de la o generaie la alta, dar i fenomenele de variabilitate ca urmare a recombinrii materialului genetic prin procesul de crossing-over Pornete de la fenotip Analizeaza modalitile de transmitere ale unui caracter n cadrul pedigree-ului unei familii sau n cadrul unor ncruciri ntre organisme e!perimentale ("ibridari)#

'!Genetica ()(ula*iil)r studiaz caracterele la nivelul unei populaii (fie c acest caracter este determinat de una sau de c$teva gene)# %

Analizeaz frecvena genelor i a genotipurilor de la un locus de interes care determin un caracter sau o maladie genetic (de e!emplu "emofilia) la om Modificarea structurii genetice a unei populaii datorit aciunii unor procese ce acioneaz sistematic n populaiile de animale (selecia, migraia, mutaia) sau dispersiv (driftul genetic i consangvinizarea)# Pornete de la fenotip +elec*ia

,! Genetica cantitati-% &tudiaz caracterele cantitative (greutate, talie, producii, etc) determinate de gene minore dar i de gene ma'ore (atele metrice sunt utilizate n procedee matematice pentru estimarea varianelor (s)) care sunt transformate n variana genetic (*G) i de mediu (*+) care determin un caracter cantitativ (*P)# Acestea sunt utilizate la determinarea parametrilor genetici: "eritabilitate, repetabilitate i corelaii# ,mbuntirea produciilor animale prin prisma creterii varianei genetice sau a celei de mediu are loc n sc"emele de selectie Ameliorarea nsuirilor cantitative (P-A.+) Genetica cantitativ clasic pornete tot de la fenotip sau de la e!presia cantitativ a genelor care codific caracterul cantitativ# +stimarea valorii de ameliorare (A) este adesea ine!act i ngreunat deoarece la unele specii intervalul dintre generaii este mare, unele nsuiri se manifest doar la un se!, altele se nregistreaz dup sacrificare# *P - *G . *+ *G-*A.*(.*/ )

*+-*+g.*+s ")-*A0*P 1G-")2&

.! Genetica m)lecular% este o ramur a geneticii care studiaz la nivel molecular structura i funciile genelor# +!emplele studiilor de genetic molecular pot fi date pentru fiecare din ramurile geneticii: fundamental, populaional i cantitativ 3tilizeaz informaia genetic la nivel de A(4 sau A54 3neori utilizeaz informaia de la nivel proteic

Genetica m)lecular% -s! GENOMICA De la (rinci(iile clasice la genetica m)$ern% 4u e!ist delimitri nete ntre aceste ramuri /n genetica molecular informaia de la nivel molecular poate fi utilizat pentru : A) segregarea caracterului (G# 7undamental) 8) structura genetic a populaiei (G#populaiilor) 9) estimarea valorii de ameliorare (G#cantitativ) Are avanta'e ma'ore: estimarea nu este influenat de condiiile de mediu, poate fi fcut imediat dup natere, poate fi realizat la ambele se!e ptr caracterele limitate de se! i pentru cele care se manifest t$rziu# +fectul este reducerea intervalului dintre generaii, acurateea crescut n estimare i efecte economice pe termen scurt i lung Cercetarea #un$amental% /i a(licati-% 9ercetarea genetic n special i cea tiinific n general poate fi fundamental sau aplicativ# ,n cercetarea fundamental e!perimentele sunt dezvoltate n vederea nelegerii fenomenelor fundamentale care au loc la nivel genetic c"iar dac cunotinele dob$ndite ne conduc ulterior la aplicaii# 9unotem felul n care anumite gene de la procariote i eucariote sunt reglate ca rezultat al unor cercetri fundamentale realizate pe organisme model cum sunt:bacteria Escherichia coli, dro'dia Saccharomyces cerevisiae i musculia de oet : Drosophila melanogaster. 0n cercetarea a(licati-%, e1(erimentele sunt reali2ate a-3n$ un alt#el $e sc)( 9ercetarea aplicativ pune n acord rezulatele cercetrii fundamentale cu nevoile practice ,n domeniul agricol, genetica aplicat a avut un rol ma'or n m untirea performaneor animalelor de ferm i a produselor i su produselor acestora (prin scderea cantitii de grsime din carnea de vit i de porc) iar la plantele de cultur prin creterea cantitii de protein (de e!emplu la soia)# ,n domeniul medical - 3n numr relativ mare de maladii umane sunt determinate genetic, progrese considerabile fiind realizate astzi prin nelegerea mecanismelor moleculare care le determin i prin implementarea diagnosticului molecular 9ercettorii lucreaz n genere cu un principiu binecunoscut azi: met)$a i-estiga*iei i()tetic)4$e$ucti-e# ;etoda const n efectuarea de observaii, formularea de ipoteze (care ncearc s e!plice observaia) i formularea ipotezelor e!perimental-predictive#

<

,n ambele domenii de cercetare: fundamental i aplicativ sunt utilizate te"nici similare care se dezvolt permanent i depind de acumularea de informaii# (e ele se ine cont atunci c$nd sunt formulate ipotezele# Genetica populaiilor i genetica cantitativ sunt ramuri care fundamenteaz una dintre cele mai importante tiine aplicative i anume ameliorarea plantelor i animalelor# Astzi ambele ramuri sunt abordate prin prisma geneticii moleculare pornind de la informaia molecular i nu de la fenotip Genetica molecular i ingineria genetic fundamenteaz iotehnologiile# RE+UR+ELE BIOIN5ORMATICE 0N GENETIC6 Resurse 7i)in#)rmatice $e 7a2% 8n genetic% Ba2ele $e $ate genetice , 9%r*ile genetice /i )rganismele m)$el 8azele de date genetice : sunt din ce n ce mai sofisticate i mai comple!e pe msura dezvoltrii instrumentelor de analiz computerizat iar accesul la ele via internet a devenit o rutin# 9onstruirea hrilor genetice de lin!age face parte din analiza genetic de apro!imativ %== de ani# Ba2ele $e $ate : 9antitatea de informaie din domeniul genetic a crescut astzi considerabil i se completeaz n fiecare zi# Astzi pot fi accesate pe internet mai multe baze de date tiiinifice> datele cercetate trebuie selectate critic av$nd n vedere multitudinea de informaie disponibil# 3n site de ncredere pentru accesare, este baza de date a 4ational 9enter for 8iotec"nolog? /nformation (498/) ("ttp:00@@@#ncbi#nlm#ni"#gov)# 498/ a fost creat n %ABB ca resurs naional pentru informaia de biologie molecular# 5olul su a fost de a crea baze de date genetice publice i dezvoltarea de instrumente soft@are pentru analiza datelor genomice, diseminarea informaiei biomedicale : pentru o mai bun nelegere a proceselor moleculare care afecteaz sntatea uman dar i ptr nelegerea conceptului de boal n general# 8aza de date de biologie moleculara europeana +;8C (+uropean ;olecular 8iolog? Caborator?) si cea 'aponeza a 4ational /nstitute of Genetics : ((D8 ((4A (atabanE of Dapan) (e asemenea, e!ista baze de date i pentru proteine (3niProt0&@issProt)

Cele trei 7a2e $e $ate sunt interc)nectate;IAM /i ICM

Instrumente $e c%utare $is()ni7ile (e NCBI sunt Pub;ed poate fi utilizat pentru accesarea literaturii de specialitate, a citrilor i a rezumatelor Gi deine linEurile pentru accesarea 'urnalelor n format electronic 3nele articole pot fi accesate n ntregime, pentru altele este necesar nscrierea pentru a fi vizualizate# 9"eile de cutare n aceast baze de date sunt multiple:dup numele sau abrevierea genei, proteinei, o maladie, nume autor, titlu, 'urnal sau termeni c"eie#

OMIM "Online Men$elian In9eritance in Man& este o baz de date care cuprinde genele umane i bolile genetice, creat i editat de ctre (r# *ictor A# ;cHusicE i colegii si# 9utarea n baza de date I;/; se face dup cuvinte c"eie iar rezultatul este o list de linEuri, fiecare cu numr specific de pagin# Paginile desc"ise prezint informaii detaliate specificate n J

cutarea iniial despre gen sau maladia genetic, inclusiv aspecte genetice, moleculare i bioc"imice, continuate ntotdeuana cu literatura de specialitate citat i adus la zi# OMIA "Online Men$elian In9eritance in Animals& : lin< e1tern I;/A este baza de date a genelor, bolilor ereditare i locilor ce determin un anumit caracter la animale# A fost conceput de ctre prof# 7ranE 4ic"olas de la universitatea &?dne? din Australia, la mbogirea creia au participat numeroi cercettori din ntreaga lume# 8aza de date conine informaii te!t i referinele bibliografice despre boal, gen sau modalitatea de motenire a ei, precum i linEurile de baz ctre baza I;/;, Pub;ed, Gene i baza de date P"enot?pe a 498/! GeneBan< Gene8anE este baza de date a secvenelor genetice ale /nstitutul 4aional de &ntate (4/K)# Aceast baz de date este o colecie adnotat a zeci de milioane de secvene A(4 disponibile# Pentru cutare n acest baz de date se utilizeaz termeni de cutare cu referire la o anumit gen, protein sau maladie (de e!emplu) (ac dorim s aflm date despre secvena genei ce determin fibroza c"istic, termenul de cutare va fi c"iar aceast maladie, urm$nd s primim toate intrrile de date de secven ce au fost publicate p$n n prezent i literatura de referin# BLA+T "Basic L)cal Alignment +earc9 T))l& 8CA&L (8asic Cocal Alignment &earc" Lool) este un instrument de comparare a secvenelor nucleotidice sau proteice cu toate secvenele din baza de date n vederea gsiri de similitudini ntre secvene# /nstrumentul este util atunci c$nd am secveniat o gen nou i dorim s gsim orice similitudine cu alte secvene incluse n bazele de date# ,n plus, genele cu funcii nrudite pot fi listate din bazele de date ceea ce ne a'ut n continuare s cercetm funcia genei pe care o studiem! Entre2 +ntrez este un sistem de cercetare pentru mai multe baze de date de legtur# 8azele de date includ informaii Pub;ed, secvenele nucleotidice A(4 sau A54 din GenebanE, secvenele de aminoacizi pentru proteine, structura tridimensional a macromoleculelor, Genome pentru asamblarea secvenelor genomice> 5ef&eM o baz de date ce conine colecia de adnotri pentru gene i proteinele derivate din transcript, i Pop&et, baza de date pentru studiile populaionale privind bolile genetice umane# 8azele de date ce dorim s le accesm pot fi selectate din meniu# B))<s 8ooEs este o colecie biomedical de cri care pot fi accesate direct# 9olecia include cri din domeniul genetic, al biologiei moleculare sau din biologia dezvoltrii# '! =%r*ile genetice

,ncep$nd cu anul %A=) au fost realizate primele "ri genetice prin analiza de linEage "rile genetice ne arat poziia genelor de-a lungul unui cromozom precum i distanele dintre acestea an de an aceste "ri au fost completate, mai ales pentru organismele e!perimentale din genetic# =ARTA DE LIN>AGE (istana genetic dintre genele situate pe acelai cromozom este rezultatul frecvenei de apariie a organismelor recombinate obinute n cadrul retro ncrucirilor i se e!prim n centi;organi (c;) +c)(ul c)nstruiri 9%r*il)r genetice nelegem modul n care sunt organizate genele de-a lungul unui cromozom (pentru a ne informa dac genele sunt situate pe acelai cromozom i dac da, ele se transmit prin linEage complet sau are loc recombinarea geneticO# 9u a'utorul "rilor genetice putem obine informaii despre secvenele unui genom# Krile fizice : distanele se msoar n uniti fizice p8 Krile genetice se suprapun peste "rile fizice P "rile cromozmiale genomice Prin secveniere - "rile moleculare ,! ORGANI+MELE MODEL 0N CERCETAREA GENETIC6 MODELUL GENETIC EUCARIOT MODELUL GENETIC PROCARIOT Organismele (entru cercetarea genetic%;)rganismele m)$el (e la nceputul secolului Q/Q , de c$nd Gregor ;endel a elaborat prima teorie a ereditii mai multe organisme au fost utilizate n cercetarea din domeniul genetic av$nd ca scop principal nelegerea funciilor i ulterior a structurii genelor# 3neori funciile anumitor gene sunt e"trem de conservate # motiv pentru care oamenii de tiin au constatat c funciile acestor gene# pot fi e"trapolate de la un anumit organism i aplicate generic i la alte organisme. Irganismele model sunt acele organisme la care se aplic acest principiu# Acestea conin n genom gene cu funcii conservate Caracteristici generale ale )rganismel)r m)$el %# Irganismele au un ciclu de via scurt astfel nc$t se poate obine un numr mare de generaii ntr-un interval relativ scurt de timp# &e pot obine date de la mai multe generaii ntr-un timp relativ scurt# (e e!emplu, la muscuia de oet ciclul generativ este ntre %= : %< zile# )# Produc un numr mare de descendeni n urma unei ncruciri# 6# Irganismele se pot ntreine uor, n spaii mici (de e!emplu, mii de musculie de oet pot fi uor crescute n sticle mici)# <# +!ista variabilitate genetic ntre indivizii populaiei sau aceasta trebuie indus prin intermediul mutaiilor astfel nc$t s poat fi studiat motenirea caracterului alterat

M)$elul genetic eucari)t At$t organismele eucariote c$t i procariotele sunt utilizate n cercetrile genetice# +ucariotele sunt organisme cu nucleu adevrat, ncon'urat de membran nuclear, n care materialul genetic este reprezentat de A(4# +ucariotele pot fi unicelulare sau pluricelulare# P$n recent au fost utilizate ase organisme model eucariot n cercetarea genetic: dro'dia Sacharomyces cerevisiae (dro'dia de bere), Drosophila melanogaster (musculia de oet), $aenorha ditis elegans (vierme nematod), %ra idopsis thaliana (plant din familia mutarului), Mus musculus (oarece), i &omo sapiens# (ei este inclus n aceast categorie omul nu ntrunete criteriile descrise mai sus pentru a fi un model e!perimental, cu toate acestea omul este cel pentru care se fac ma'oritatea studiilor din genetic# 9unotinelor dob$ndite n urma cercetrii genetice pe organismele model produc descifrri ale mecanismelor care determin bolile umane, pot fi testate medicamente noi i descifrat rspunsul la un anumit tratament 9u a'utorul lor este neles procesului de dezvoltare i evoluie# (e-a lungul anilor alte apte organisme eucariote au contribuit la dezvoltarea cunoaterii prin e!perimentele efectuate asupra acestora n calitate de organisme model: 'eurospora crasa (fungi filamentosi(, )etrahymena (protozoar), *aramecium hardtii (protozoar), $hlamydomonas reinhardtii (alg verde), *isum sativum (mazre), +ea mays (porumb) i Danio rerio (petele zebr)# )etrahymena# *aramecium# $hlamydomonas i Sacharomyces sunt organisme unicelulare, restul fiind pluricelulare#

Celula animal% /i -egetal%

Celula animal% -s celula -egetal% ambele conin o membran celular ns celula animal este lipsit de perete celular#

%=

4ucleii celulelor eucariote conin molecule de A(4 organizate n structuri liniare numite cromozomi i asociate cu proteine "istonice# 4ucleul este separat de restul celulei (citoplasm i organite celulare) printr-o membran nuclear care este strbtut de pori nucleari, de dimensiuni )=-B= nm, prin care pot trece molecule - nspre citoplasm, cum sunt moleculele de A54m care transport informaia din nucleu n citoplasm, la ribozomi, unde are loc sinteza proteinelor i dinspre citoplasm n nucleu: cum sunt de e!emplu enzimele pentru replicarea A(4, repararea A(4, transcripie i proteinele "istonice asociate A(4# Cit)(lasma /i )rganitele celulare 9itoplasma celulelor eucariote conine numeroase organite celulare# (e interes specific pentru geneticieni sunt centriolii, reticulul endoplasmatic, ribozomii, mitocondria i cloroplastele# 9entriolii, numii i corpusculi bazali se gsesc n aproape toate celulele animale i lipsesc n celulele vegetale# I perec"e de centrioli sunt localizai n poriunea central a unui centrozom, o regiune a citoplasmei nedifereniat, responsabil de organizarea fibrelor fusului de diviziune pe care se vor ataa cromozomii n timpul segregrii din mitoz i meioz# Reticulul en$)(lasmatic este o structur dublu-membranar care ncon'oar membrana nuclear# 5eticulul endoplasmatic rugos are ataai ribozomii (care conin A54r) i care dau aspectul rugos# Ca ribozomi are loc sinteza de proteine ce vor fi e!cretate n celul sau fi depozitate n membrana plasmatic sau n altete organite celulare din interiorul celulei# &inteza de proteine, altele dec$t cele distribuite via reticulul endoplasmatic rugos, sunt sintetizate de ribozomii liberi din citoplasm# Mit)c)n$ria este cel mai larg organit celular ncon'urat de o membran dublu-stratificat, ce 'oac un rol esenial n producerea energiei necesare celulei# (e asemenea mitocondria are un genom propriu format din A(4 dublu catenar circular ((4Amt) ce codific anumite proteine cu rol funcional la nivelul local i cele implicate n mainria de producere de energie mitocondrial necesar celulei# Cl)r)(lastele $in celula -egetal% 9elulele vegetale conin cloroplase : mari, triplu stratificate ce conin organite implicate n fotosintez# 9loroplastele conin A(4 cloroplastic (A(4cp) ce codific proteine cu rol funcional i alte c$teva componente ale sistemului de sintez proteic cloroplastic# A(4cl alturi de A(4mt formeaz genomul e!tranuclear (citoplasmatic) al plantelor M)$elul (r)cari)t ,n contrast cu eucariotele, procariotele nu au membran nuclear care ncon'oar nucleoidul#

%%

Loate bacteriile fac parte din categoria procariotelor, care cuprind celule de forme sferice, bastona sau spiralate# 7orma bacteriei este meninut de un perete celular rigid situat nafara membranei celulare# Procariotele sunt mprite n dou grupe mari: 8acteria i Arc"ea# Grupul 8acteria cuprinde ma'oriatatea bacteriilor cu rsp$ndire variabil: n corpul organismelor vii, n sol, n ap# Arc"ea cuprinde bacteriile strvec"i, adaptate la condiii din ce n ce mai vitrege cum sunt: ape termale, ape "iper"aline, zcminte de petrol, medii bogate n metan sau cu presiuni nalte cum sunt ad$ncurile oceanelor# M)$elul (r)cari)t4 Esc9eric9ia c)li ,n ma'oritatea cazurilor, procariotele studiate n genetic fac parte din grupul 8acteria# 9el mai mult studiat, cunoscut i complet caracterizat este E.coli, o bacterie saprofit nt$lnit n intestinul animalelor cu s$nge cald, n soluri i ape, care cuprinde nu mai puin de %=== specii, ma'oritatea saprofite# Grupul Arc"ea cuprinde i specii ce triesc n condiii naturale normale cum sunt ape i soluri# 8acteriile variaz n dimensiuni ntre %== nm i %= Rm n n diametru# 9ele mai mari specii cum este )hiomargarita nami iensis# de form sferic poate avea un diametru de S mm, fiind vizibil c"iar i cu oc"iul liber (av$nd mrimea unui oc"i de la Drosophila melanogaster)# +TRUCTURI CELULARE CU ROL GENETIC LA PROCARIOTE ?I LA EUCARIOTE GENOMUL NUCLEAR GENOMUL E@TRANUCLEAR +tructuri celulare cu r)l genetic &unt considerate c au rol genetic acele structuri celulare ce ndeplinesc dou condiii de baz: ca(acitatea $e aut)re(r)$ucere 8n m)mentul $i-i2iunii celulare i c)ntinuitate #i2ic% $e la ) genera*ie la alta# ,n celula animal, aceste condiii sunt ndeplinite de cr)m)2)mi i nucle)li la nivelul nucleului i de mit)c)n$rii /i structurile (r)$uc%t)are $e #i7rile "centri)li /i <inet)s)mi& la nivelul citoplasmei# Ca plante, (lasti$ele /i mit)c)n$riile, iar la bacterii, (lasmi$ele localizate n citoplasm, asigur ereditatea e!tranuclear# +tructura #i2ic% a cr)m)2)mil)r eucari)*i 9romozomii sunt corpusculi cu afinitate pentru colorani bazici de unde i denumirea lor: chroma : culoare, soma : corp# &e gsesc n toate celulele somatice ale organismelor eucariote, cu e!cepia "ematiilor# ;orfologia cromozomilor poate fi descris n metafaza mitozei c$nd acetia sunt mai scuri, mai groi i mai uor de identificat dup o colorare prealabil#

%)

Gru(e m)r#)l)gice $e cr)m)2)mi $u(% ()2i*ia centr)merului ;etacentrici (p-M) &ubmetacentrici (pTM) Acrocentrici (pTTM) Lelocentrici (M) +tructura m)lecular% a cr)m)2)mil)r la eucari)te 4ucleoplasma sau sucul nuclear conine ap, substane organice, substane minerale, enzime i acizi nucleici# (in punct de vedere structural nucleoplasma este o soluie coloidal format din cariolimf : mediul dispersant i cromatin : mediul dispersat# 9ariolimfa conine n proporie de J=-N=U ap i %F-)FU substane organice# Cr)matina 9romatina, substana fundamental din care sunt alctuii cromozomii, este un agegat comple! alctuit din ADN, ARN, (r)teine cr)m)2)male 9ist)nice i n)n9ist)nice, i)ni $e calciu i magne2iu! Proteinele cromozomale particip la meninerea integritii structurale a cromozomului, prote'eaz A(4-ul de aciunea dezo!iribonucleazelor i sunt implicate n reglarea activitii genice# =ist)nele Kistonele sunt proteinele cel mai abundent gsite n cromozomi> sunt molecule proteice bazice, de dimensiune mic i cu ncrctur electric pozitiv datorit predominanei aminoacizilor arginin i lizin# (atorit ncrcrii pozitive acestea se asociaz cu moleculele de A(4 ncrcate electrononegativ# ,n celulele eucariote e!ist F tipuri de proteine "istonice notate: K%, K)A, K)8, K6 i K<# 9u e!cepia "istonei K% secvena n aminoacizi a celorlalte < tipuri este nalt conservat c"iar la speciile ndeprtate filogenetic#

%6

Kistona K%, care este i cea mai mare ()%F aminoacizi), are un coninut bogat n lizin i variabilitate mare n structur# Aceasta interacioneaz cu non"istonele i cu alte proteine "istonice fiind poziionat la nivelul A(4-ului linEer, ntre doi nucleozomi# Kistona K)A este un momomer format din %)A aminoacizi reprezentai n proporie moderat de lizin i arginin i n proporia cea mai ridicat de leucin# Kistona K)8 conine %)F aminoacizi de tipul lizin n proporie de %JU, arginin n proporie de J,FU, iar restul sunt reprezentai de serin i prolin# Kistona K6 este singura fracie proteic care conine cistein alturi de arginin (%<U) i glicin (%FU) n secvena complet de %6F aminoacizi# Kistona K< cuprinde doar %=) aminoacizi i are cel mai pronunat caracter bazic# Prin gruparea terminal 4K) se ataeaz la A(4 iar prin gruparea 9IIK de la cellalt capt, care i confer caracter "idrofob se poate lega de alte "istone sau de componente ale cromatinei# N)n9ist)nele sunt nucleoproteinele, mult mai slab reprezentate la nivel de cromozom (6=U)# ;ulte dintre acestea sunt proteine acide cu ncrcare electric negativ# +le includ proteine cu rol n replicarea A(4, procese reparatorii i cele implicate n transcripie (genele cu rol de regla') dar i n recombinare# Particip la compactarea A(4 form$nd sc"ela sau scara pe care se compacteaz A(4-ul ,n contrast cu caracterul nalt conservat al proteinelor "istonice, acestea difer semnificativ at$t n numr c$t i n tipul acestora# at$t de la un tip de celule la altul dar i n cadrul aceleiai celule n perioade diferite ale vieii# 9romatina cuprinde dou stri funcionale eucr)matina "cr)matina la1%& /i 9eter)cr)matina "cr)matina $ens%&! +ucromatina este mai puin dens, se coloreaz normal i reprezint domeniul genelor structurale, transcrise n A54m, pe c$nd "eterocromatina este mai condensat, se coloreaz mai intens, este format din A(4 noninformaional, fiind dispus la nivelul centromerului, telomerelor i n satelii# Keterocromatina reprezint regiunile puin active, bogate n A,L, spiralizate, din cromozom i este facultativ i constitutiv, iar eucromatina reprezint segmentele active(bogate n 9,G), despiralizate# Keterocromatina facultativ reprezint ),FU din genom, sub form condensat, ce poate reveni la starea de eucromatin activ n timpul meiozei# Keterocromatina constitutiv reprezint %F : )=U din cromatina nuclear, fiind o entitate separat n toate stadiile dezvoltrii# Pr)(riet%*ile 9eter)cr)matinei sunt se replic t$rziu n faza &> rm$ne n stare condensat n fazele ciclului celular> este inert genic> fiziologic inactiv# Eta(ele $e c)n$ensare ale #i7rei $e cr)matin%

%<

Structura dublu helix al ADN constituie fibra cea mai subire, cu diametrul de ) nm# 7iecare cromatid a cromozomului metafazic conine o singur macromolecul de A(4# Fibra nucleozomal 4 Aceast structur a fost descoperit de ctre Hornberg n %AN<# 5olul important n plierea macromoleculei de A(4 l au "istonele# Acestea sunt de F tipuri: K%, K)A, K)8, K6 i K<# ;asa lor n cromozomi este apro!imativ egal cu masa A(4# 9$te dou molecule din "istonele K)A, K)8, K6 i K< sunt grupate sub forma unui octamer# Canul de A(4 nfoar octamerul de %,NF ori form$nd o unitate ce poart numele de nucleozom# Cegarea a doi nucleozomi ntre ei se face prin intermediul fibrei internucleozomale, format din A(4 i "istona K%# 4ucleozomii sunt cei care dau cromatinei, vzut la microscopul electronic, aspectul de mrgele nirate pe nur# (iametrul fibrei nucleozomale este de %=-%% nm# +tructura nucle)2)mului "=! =artAell /i c)la7!,

%F

Fibra solenoidal ,mpac"etarea fibrei nucleozomale la nivel superior se face cu a'utorul "istonei K%# 3n segment de F : J nucleozomi este condensat cu a'utorul a tot at$tea proteine "istonice K%, iar altul nu este prins de nicio molecul K%# Aceast form de condensare prin care se formeaz fibra de 6= nm, poart numele de solenoid# Domeniul buclat fibra de cromatid +tapa urmtoare de condensare a fibrei de 6= nm formeaz buclele sau domeniile buclate n care superrsucirile apar pe fiecare bucl n parte# (iametrul fibrei de cromatin, n domeniul buclat, este de N== nm#

%J

Cromatida cromozomial, av$nd diametrul de N== nm, reprezint ultimul nivel de organizare a cromatinei n cromozomii metafazici! Curs' Gen)mul celular Lotalitatea materialului genetic dintr-o celul formeaz genomul celulei Acesta este distribuit in dou compartimente: - in nucleu (genomul nuclear) - in citoplasm (genomul e!tranuclear) Ca eucariote: genomul nuclear cuprinde cromozomi liniari n numr caracteristic speciei i tot at$tea molecule de A(4()n) Genomul e!tranuclear: mitocondria i organitele formatoare de fibrile n celulele animale iar la plante mitocondria i plastidele Ca procariote: Genomul nucleoidal- un singur cromozom la ma'oritatea, circular (o singur molecul de A(4)# +!ist bacterii care conin mai muli cromozomi Genomul citoplasmatic- plasmidele-molecule mici de A(4 d#c# circular nc"is sau plasmide liniare Organi2area gen)mului la -irusuri 9romozomul viral unic poate fi liniar sau circular# (imensiunea genomului este de ordinul %=6 - %=F pb 7agul V are un genom A(4 alctuit din <B#F%6 perec"i de nucleotide cu J% gene# Greutatea molecular a A(4 viral variaz ntre %=J : %=B daltoni iar a A54 viral %=N : %=B daltoni# Du(% materialul gentic -irusurile ()t #i 9u genom A(4 - dezo!iribovirusuri 9u genom A54 - ribovirusuri (in categoria dezo!iribovirusurilor fac parte: virusul &imian &*<= (A(4 dublu catenar circular)> fagul L< (A(4 dublu catenar liniar)> virusuri cu A(4 monocatenar circular (bacteriofagul WQ%N<)> parvovirusuri (A(4 monocatenar liniar)# (in categoria ribovirusurilor fac parte: bacteriofagii ;&), 5%N i virusul poliomielitei, care au A54 monocatenar pozitiv (tip X.Y)# (up intrarea n celula gazd, monocatena A54., care este i catena matri, acioneaz ca un A54m, ata$ndu-se la ribozomii celulei gazd i iniiind sinteza A54-polimerazei specifice virale# Aceast enzim recunoate catena A54 care a dictat sinteza sa (catena .) i o folosete ca matri pentru sinteza unei catene complementare (catena :)# Ri7)-irusuri tum)rale cu ARN m)n)catenar care se re(lic% (rin interme$iul ADN "retr)-irusuri, )nc)-irusuri&

%N

Retr)-irusurile (oncovirusurile) conin ca material genetic A54, au proprieti cancerigene i se replic prin intermediul A(4 (Lemin i ;izutani) 5everstranscriptaza folosete ca matri A54 al retrovirusului, iar ca substrat dezo!iribonucleotidele trifosfatice pentru a sintetiza A54-ului viral o caten A(4c# 3lterior, monocatena A(4 este convertit ntr-o structur bicatenar (duple! de A(4)# A(4 bicatenar sintetizat reprezint (r)-irusul (cromozomul viral care se va integra n genomul celulei gazd)# Retrovirusurile sunt clasificate n trei familii: Incoviridae (oncogene(: virusul leucozei bovine, leucozei aviare, virusul sarcomului 5ous (5&*)> Centiviridae (neoncogenice dar patogene(: virusul encefalitei caprine, virusul imunodeficientei umane (K/*, tipurile / i //), virusul imunodeficienei bovine (8/*), virusul imunodeficienei feline (7/*), virusul anemiei infecioase ecvine> &pumavirinae# nepatogene pentru om i animale# Utili2area retr)-irusuril)r 8n genetica m)lecular% +unt -ect)ri (entru transgene, datorit capacitii acestora de a ncorpora copia A(4 a propriului lor genom A54 n cromozomii celulelor gazd infectate (rezultate bune la psri i peti)# Pentru tera(ia genic% la )m se pot obine retrovirusuri recombinate# Astfel, genele virale care controleaz proteinele de nveli ale retrovirusului 5&* (gag# pol i env) au fost nlocuite cu gena timidin-Einazei de la virusul "erpesului uman# Organi2area gen)mului 7acterian 8acteriile sunt procariote de tip celular# A(4 bacterian vine n contact direct cu citoplasma Irganizarea materialului genetic n nucleoidul bacterian (genomul nucleoidal)# ;area ma'oritate a bacteriilor au un singur cromozom format dintr-o singur macromolecul de A(4 d#c#circular, necomple!at cu proteine "istonice, aa cum este la eucariote# +!ist totui c$teva proteine de asociere numite "istone-liEe# Cungimea cromozomului bacterian este de circa % mm, reprezent$nd 6 : < U din greutatea celulei# ,n nucleoid, A(4 se afl n stare compact, condensat prin pliere i superpliere, conin$nd diferite proteine, A54, lipide# A(4 nucleoidal de la +,coli conine <,N ! %=J perec"i de nucleotide i %F== gene# Ca +# coli, macromolecula de A(4 are o lungime de %=== ori mai mare dec$t diametrul celulei (% : ) Rm), de unde rezult c, cromozomul nu poate e!ista dec$t sub form pliat i superpliat (superspiralizat) 9romozomul pliat la +# coli conine <= : F= bucle, iar la cromozomul superpliat, fiecare bucl prezint rsuciri secundare alctuite din cca# <== pb# 8uclele sunt meninute prin intermediul unui A54 cu rol de linEer

%B

Alte ti(uri $e )rgani2%ri ale gen)mului +(ecia M)elcule $e ADN Dimensiune E.coli % molecul circular <,N ! %=J - ;ai multe molecule mici circulare (plasmide) in citoplasm %gro acterium % cromozom circular . 6 ! %= J tumefaciens un cromozom liniar ),% ! %=J ,i rio cholaere ) molecule circulare ),A ! %=J (% n cromozom, % n megaplasmid) % ! %=J Deinococcus < molecule circulare ),N ! %=J radiodurans () cromozomi i ) n =,< ! %=J plasmide) =,%N! %=J -orrelia urgdorferi

Nr! $e gene %F==

Z )N== %%%F )J66 6JA %<F

N-B molecule circulare =,=F-=,A ! %=J (plasmide) Z %% molecule liniare (% cromozom i N plasmide)

Pr)teine as)ciate cr)m)2)mului 7acterian A(4 bacterian este asociat cu mai multe proteine bazice, similare cu "istonele de la eucariote (&. - histone /li!e( *rin comple"area proteinelor &. la %D' se formeaz structuri asemntoare nucleozomilor de la eucariote (nucleosome0li!e( .n nucleozom / 1 proteine &.2 i &u3 (heli" un4inding( [ proteina iniiator %D'0% (recunoate regiunea ori$( i mpreun cu proteinele &. i 5&6 (5ntegration &ost 6actor( intervin n desfacerea punilor de hidrogen i formarea ochiului de sintez [ proteina A(4-9 are rolul de a recruta "elicaza, enzima care rupe punile de "idrogen dintre catene (A(4-8) [ proteinele 7/& (7actor for /nversion &timulation care pot determina in"ibarea iniierii nesincronizate a replicrii#

%A

[ 9omple!ul proteic denumit \cleme glisante ale A(4Y (sliding D'% clamps) este format din J subuniti ] proteice, aran'ate sub forma unui inel nc"is care fi!eaz A(4 polimeraza la catene i mrete capacitatea de procesare a A(4# [ c)m(le1 (r)teic $e sta7ili2are a m)n)catenel)r (&&8-Single Strand -inding *roteins) se ataaz pe acestea, prevenind renaturarea A(4 n timpul sintezei +ec-en*e ADN $in cr)m)2)mul 7acterian Ca bacterii genele au structur continu i ma'oritatea sunt codante# ;ai multe gene de la procariote se transcriu i sunt translatate n bloc formaz un operon (e!# operonul lactozei, triptofanului, al genelor ptr A54r, A54t) Genele ptr A54r - la procariote e!ist N uniti genice (operoni) pentru sinteza A54r# &inteza A54t la bacterii este asigurat de gene care se gsesc n una p$n la c$teva copii n cromozomul bacterian &ecvenele I57 (open reading frame) sunt situsurile de interaciune a A(4 cu enzime (A54 polimeraza)0 sau secvenele cu rol de regla' din amonte de gen ) Secvena ori$ )<F pb : originea replicrii unde este iniiat replicarea (este recunoscut de proteina iniiator A(4-A i leag "elicaza (A(4-8 i proteina de recrutare A(4-9)# &ecvenele 5ep : palindroame formate din secvene repetate situate intergenic# Situsurile $hi (de recunoatere i tiere a A(4) : circa AF= n cromozom# &unt regiuni unde are loc stimularea recombinrii omoloage a A(4# Situsuri Dam : formate din <pb sunt situsurile de metilare a adeninei Situsuri pentru inserie fagic la care se ataeaz specific protienele /K7 (/ntegration Kost 7actor) i unde are loc integrarea fagilor n genom0i iniierea ciclul lizogen Gen)mul (lasmi$ial "e1tranucle)i$al& 7acterian +!istente la unele bacterii, nu sunt eseniale pentru supravieuire, confer avanta'e selective Lipuri de plasmide dup criteriul autotransferabilitii: %, con'ugative (poart operonul tra responsabil cu iniierea con'ugrii) : 7, 7^, Kfr ), necon'ugative (9ol, 5) 6# mobilizabile : transferabile (poart secv# mo care le asigur mobilizarea n evenimente de con'ugare) Du(% structur% 9irculare (A(4dc, circular, nc"is, mai rar desc"is sau nic! ( *lasmide liniare / cu telomere hairpin sau ac de pr 7palindroame(la genul -orrelia( plasmide liniare cu capete li ere la Streptomyces (tot capete palindromice# ogate n %)( care sunt meninute liniare cu proteine )* (telomeric proteins( Du(% #unc*ie;gene Plasmidele de se! (7, 7^, Kfr), Plasmide 5, Plasmide 9ol, Plasmide Lol, Plasmide Li

)=

%# Plasmidele 7, Kfr, 7_ (plasmidele de se! sau fertilitate) mediaz transferul de gene de la celulele care dein aceast plasmid la celule care nu o dein, prin procesul de con'ugare# )# plasmidele 5 sunt plasmidele care determin rezistena la antibiotice a celulelor gazd i pot fi transferate de la celulele care le dein la celulele care nu le dein, conferindu-le proprieti noi de rezisten la unul sau mai multe antibiotice> 6# plasmide 9ol, care determin sinteza unor proteine numite n general $olicine care pot omor tulpini apropiate de bacterii lipsite de aceast plasmid# <# Plasmidele LIC : de la *seudomonas putida, au rol n degradarea unor molecule strine cum este toluenul> F# Plasmidele Li de la %gro acterium tumefaciens, ce determin boli la dicotiledonate#

Plasmi$ele 5 Prin cuplarea dintre o celul bacterian de tip mascul 7. i o celul de tip femel 7-, are loc transferul unei copii a plasmidului 7, astfel nc$t celulele 7- devin 7.# Plasmidul 7 conine gene ce codific proteinele din care sunt alctuii pili se!uali prin care migreaz materialul genetic de la celula donatoare la cea receptoare n timpul con'ugrii# Plasmi$ele =#r Lransferul implic o singur caten de A(4, iar caracterul dublu catenar este restabilit prin replicare# Plasmidul 7 poate trece din starea 7. n stare integrat n cromozom, astfel bacteriile prezint o frecven de recombinare de %=#=== ori mai mare dec$t bacteriile 7. i se noteaz &fr (Kig" freMuenc?), cu nalt frecven de recombinare# transferului unei catene ADN a lasmidului F din bacteria donatoare F! la bacteria rece toare F"

)%

*roducerea unei acterii &fr prin recom inarea genetic dintre o secven de aze din plasmidul 68 i o secven de aze omolog din cromozomul acterian

Plasmi$ele R determin rezistena la antibiotice &unt molecule spiralate de A(4 dublu catenar# &e replic autonom, fiind prezente n mai multe copii# &e pot transfera vertical la descendeni i orizontal de la o specie la alta# Pot fi pierdute i c$tigate# Ti(uri $e (lasmi$e R plasmide 5 con'ugative (autotransferabile), sunt mari i alctuite din trei secvene nucleotidice: 9)6-factorul de transfer al rezistenei, replicatorul-asigur autoreplicarea, determinanii 9- asigur rezistena la antibiotice, iar numrul lor variaz de la % : %=# Plasmidele 5 con'ugative codific rezistena la %= : %F antibiotice sau la toate antibioticele# ` plasmide 5 necon'ugative, sunt lipsite de 5L7 (5esistance Lransfer 7actor), conin numai replicator i determinani# 9odific rezistena la % : ) antibiotice, replicarea lor per generaie fiind mai rapid# Plasmi$ele 7acteri)cin)gene "Col& &intetizeaz colicine-proteine capabile s omoare bacterii din tulpini str$ns nrudite lipsite de plasmide 9ol, dar posed$nd receptori specifici pentru colicine# Aceste plasmide sunt necon'ugative (imobile)# ;a'oritatea plasmidelor utilizate n te"nologia A(4 recombinat au fost construite din plasmida 9ol +%# (intre plasmidele derivate din 9ol +% care au primit avizul pentru a fi folosite ca vectori pentru transferul genelor n celulele gazd +H% sau +H) amintim plasmidele: p85 6)), p85 6%6, p;8 A, p&9 %=%, p39 A etc# Alte gene (lasmi$iale Gene fi!atoare de azot (gele nif- de la 9hizo ium sp.( ))

Gene ce codific factori de patogenitate i virulen Gene implicate n metabolismul opinelor (plasmidele Li de la Agrobacterium) Gene ce codific enzime proteolitice, amilolitice Gene ce determin capaciti metabolice deosebite (la Pseudomonas : ptr !enobiotice) Gene ce determin tolerana la metale grele, concentraii ridicate de sare etc-# Organi2area gen)mului e1tranuclear ;mit)c)n$rial la eucari)te ;itocondriile sunt organite celulare eseniale pentru viaa celulei eucariote desfoar procese respiratorii care conduc la producerea de energie nmagazinat n substana macroergic ALP conin A(4 ce prezint %U din A(4 celular Ca mamifere are o lungime de apro!imativ %J Eb (oarece %J#)AF pb, vac %J#66B pb, oaie %J#<== pb)# Ca plante A(4mt este mult mai mare i variabil n dimensiune i structur

A(4 mitocondrial este dublu catenar i circular, alctuit dintr-o caten% grea "=& 7)gat% 8n guanin% /i ) caten% u/)ar% "L& 7)gat% 8n cit)2in%! $atena grea codific 0:1 polipeptide enzimatice, 01 molecule de %9'r i 0:; molecule de %9't. $atena uoar codific un singur polipeptid enzimatic i < molecule de %9't# ,n total, A(4-ul mitocondrial de la orice specie de mamifere are ,B gene# 9ele %6 polipeptide codificate de catenele K i C sunt componente ale enzimelor cii fosforilrii o!idative, fiind subuniti ale comple!elor enzimatice / : *# Gen)mul mit)c)n$rial )6

=& > originea replicrii catenei grele? =@ > originea replicrii catenei uoare? *& > promotorul pentru iniierea transcripiei catenei grele? *@ > promotorul pentru iniierea transcripiei catenei uoare? 'D > genele comple"ului 5? cele 11 regiuni intercalate ntre genele enzimatice# sunt genele pentru %9't

+(eciile $e ARN care $eser-esc mit)c)n$ria 9ele ) tipuri de A54r (%) & i %J &) i cele )) tipuri de A54t sunt implicate numai n sinteza polipeptidelor pe ribozomii mitocondriali cu structur diferit de cea a ribozomilor citoplasmatici# C)$ul genetic al ADN mit)c)n$rial este $i#erit $e c)$ul genetic nuclear ,n A(4 mitocondrial - codonul 3GA este pentru triptofan (nu pentru stopare)> - codonii AGA i AGG sunt codoni stop (nu pentru arginin)> - codonul A3A este pentru metionin (nu pentru izoleucin)# A(4 mitocondrial apare n electronoradiografii sub form de fibrile fine dispuse n reea, deoarece acest A(4 este de tip procariot, necomple!at cu "istone i cu organizare a genelor sub form de operoni.A(4mt al mamiferelor este codant pe toat lungimea sa i nu conine introni# +!ist c$teva secvene nucleotidice necodante cu rol n reglare: punctele de origine ale replicrii catenei grele i a catenei uoare i ) promotori ai transcripiei 5eplicarea A(4mt este asincron i ncepe din puncte de origine diferite#

)<

5eplicarea A(4 mitocondrial se desfoar pe parcursul ntregului ciclu celular, sinteza A(4 mitocondrial fiind dependent de diviziunea mitocondriei i nu de cea a celulei# 7urca de replicare a A(4 mitocondrial

Particularit%*ile ADN mit)c)n$rial A(4mt se transmite pe cale matern la fii i fiice, iar fiicele transmit A(4 mitocondrial la generaia urmtoare# ;asculii nu transmit A(4 mitocondrial> 7recvena cu care se produc mutaiile la nivelul genelor din A(4 mitocondrial este mult mai mare dec$t la nivelul genelor din A(4 nuclear# A(4 mitocondrial fi!eaz mutaiile de apro!imativ %= ori mai rapid dec$t genele nucleare ale fosforilrii o!idative# Astfel, genomul mitocondrial se caracterizeaz printr-o mare variabilitate, util n stabilirea filogeniei speciilor, nrudirii speciilor, stabilirea paternitii, alturi de grupele sanguine> =etre)(lasmia ADNmt 3neori se remarc o "eteroplasmie mitocondrial - prezena n acelai esut i celul a unei populaii mitocondriale mi!te, alctuit din A(4 mitocondrial mutant i de tip slbatic# Aceste populaii segreg i astfel unele celule motenesc numai A(4 mitocondrial mutant, altele de tip slbatic, iar altele fiind "eteroplasmice# ,n primele dou cazuri, populaiile mitocondriale vor fi "omeoplasmice# )F

9urs6 +tructura centr)meril)r /i a tel)merel)r cr)m)2)mil)r liniari +tructura centr)meril)r /i a tel)merel)r 9entromerul i telomerele sunt regiuni cu funcii speciale n celulele eucariote# Centr)merul este regiunea din cromozomi la nivelul cruia cromozomii se ataeaz de fibrele fusului de diviziune prin intermediul Einetocorului# Centr)merii si #i7rele #usului

+tructura centr)merului +ste o zon cromozomal multifuncional comple!, cu compoziie proteic foarte variat i A(4 de tip alfa satelit ,n timpul diviziunii celulare, centromerul servete ca: %# loc al integrrii cromozomului n fusul mitotic prin ataarea de microtubuli> )# motor neuroc"imic responsabil de micarea cromozomilor> 6# mediator al mperec"erii cromozomilor omologi n meioz> <# loc al separrii cromatidelor surori la sf$ritul metafazei i nceputul anafazei (duplicrii cromozomilor)# &tructural i funcional, centromerul poate fi divizat n trei zone distincte: <inet)c)rul, la e!teriorul centromerului> $)meniul central, ocup cea mai mare parte a zonei centromerului> $)meniul $e 8m(erec9ere a cr)mati$el)r, pe suprafaa intern a acestuia#

)J

)N

+tructura <inet)c)rului 1! >inet)c)rul prezint o structur trilaminar, alctuit din trei (l%ci intern%, miCl)cie /i e1tern%# I a patra zon acoper placa e!tern (corona fibroas)# ` #laca extern% este l)cul $e interaciune a (r)teinel)r <inet)c)rului cu (r)teinele micr)tu7ulil)r #usului de diviziune iar laca intern% este regiunea (rin care se as)ci2% (r)teinel)r <inet)c)rului cu ADN4ul 9eter)cr)matinei centr)merului! ` ,n zona Einetocorului e!ist ADN satelit /i (r)teine s(eci#ice ` Cel (uin 1D (r)teine au #)st i$enti#icate 8n centr)merii $e la eucari)te $intre care unele au ) sec-en% 8nalt c)nser-at%

9omple!ul proteic 9+4P al centromerului poate fi divizat pe trei nivele n funcie de poziia acestora: nucleozomul (cu proteinele 9+4P-A, K)A, K)8, K<), comple!ul de asociere la nucleozom (9+4P-9, 9+4P-K, 9+4P-L, 9+4P-4, 9+4P-; i 9+4P-3) i proteinele distale ale nucleozomului (9+4P-/, 9+4P-I, 9+4P-a, 9+4P-H, 9+4P-C) 9omple!ul /49+4P se asociaz la proteinele 9+4P ale plcii interne ale Einetocorului i mpreun cu proteinele de coeziune a cromatidelor au rolul de a menine mpreun cromatidele surori# Proteinele cu rol motor din coroana fibroas i asociate placii e!terne a EinetoEorului au rol de interaciune cu microtubulii i de micare a cromozomilor pe fibrele fusului n timpul diviziunilor

Placa intern% a <inet)c)rului ` vine n contact intim cu "eterocromatina constitutiv a centromerului i este locul n care A(4-ul satelit este asociat cu proteinele "istonice sub form de nucleozomi# 4ucleozomul centromeric: Kistona K6 este nlocuit n centromerii activi cu proteina centromeric A (9+4P-A sau 9enK6) care se asociaz A(4-ul centromeric n nucleozomi alturi de "istonele K)A, K)8 i K<# Lot 9+4P-A este recunoscut de alte proteine centromerice interne sau /49+4P (/nner 9entromere Proteins) care se asociaz cu proteinele de coeziune a cromatidelor Placa e!tern conine preponderent proteinele 9+4P-+ i 7# *ine n contact cu coroana fibroas ` Ca nivelul coroanei fibroase i asociate plcii e!terne au fost evideniate i alte proteine care ndeplinesc rol motor i sunt responsabile de micarea cromozomilor pe firele fus# ` Acestea sunt dineina, identificat doar n celulele animale i Einesina, prezent at$t n celulele vegetale c$t i n cele animale# )B

9oroana fibroas este locul de interaciune cu proteinele microtubulilor#

5unc*iile c3t)r-a (r)teine centr)merice ` ` ` 9+4P-A este o "iston specific centromerului> 9+4P-8 : este recunoscut de ctre o secven specific din A(4 de %N nucleotide i are rol n meninerea cromatinei centromerice i facultativ n asamblarea Einetocorilor 9+4P-+ : este implicat n desfurarea normal a metafazei#

+ec-entele ADN satelit $in structura centr)merului ` ndeplinesc funcii similare dar nu au structur total identic la specii diferite ` Irganizarea secvenelor de A(4 din centromer este de tip b satelit# ` &ecvena miez a centromerului de la Saccharomyces cerevisiae const din %%)%)= pb grupate n 6 domenii ` Elementele ADN centr)mer I (9(+ /) constau dintr-o secven comun de B nucleotide uL9A9uLG, unde u este o purin de tipul A sau G# ` Elementele ADN centr)mer II constau din NB-BJ pb repetiii de tip AL care reprezint mai mult de A=U din secven ` Elementele ADN centr)mer III constau din circa )J pb bogate de asemenea n AL#

` ` ` ` ` `

&ecvena centromer difer foarte mult at$t n lungime c$t i n structur c"iar n cadrul aceleiai specii# la om aceasta are lungimea de )<= pb n timp ce la alte dro'dii decat &ac"arom?ces este de <=-J= pb# +!ist n fiecare caz o regiune nalt conservat care este comun# avAnd rol de spaiator pentru alte regiuni varia ile n structur '! $)meniul central : regiunea 9eter)cr)matinei 4 l)cul $e interac*iune cu ADN satelit ,! D)meniul $e 8m(erec9ere: locul de interaciune dintre cromatidele surori n faza G), profaz i metafaz# (ou clase de proteine au fost atribuite acestui domeniu: /49+4P (/nner 9entromere Proteins) i proteinele de coeziune a cromatidelor

)A

Tel)merele Lelomerele reprezint poriunile terminale ale ma'oritii cromozomilor eucarioi implicate n stabilitatea cromatidelor, mpiedic$nd deteriorarea i alipirea acestora n timpul diviziunilor# Cungimea lor este asociat cu durata de via a organismului i iar scurtarea lor are loc progresiv n cursul vieii i accentuat n boli - cancer +tructura tel)merel)r ` Lelomerele cuprind secvene simple de A(4 repetate n tandem# ` 3nitatea repetitiv de baz este alctuit la eucariote din J pb, reprezentate de secvena Fc : LLAGGG - 6c# ` ,n funcie de organism i de perioada vieii n care se afl, telomerele cuprind %==-%=== de copii ale secvenei de J pb# ` A(4-ul telomeric nu este dublu-catenar pe toat lungimea# ` Ca sf$ritul cromozomului A(4-ul telomeric este monocatenar i formeaz o bucl, bucla-L care ptrunde n secvena dublu-catenar form$nd o bucl de nlocuire : bucla ( 9aptul telomeric al unei catene de A(4 (cea mai lung) este bogat n G, iar captul catenei opuse este bogat n 9

5unc*iile tel)merel)r ` men*in sta7ilitatea cr)m)2)mului prote'$nd cromatidele de alipire i de rearan'ri structurale care deseori duc la apariia cancerului#

6=

(r)teCea2% e1tremit%*ile $e ac*iunea e1)nuclea2el)r cu aCut)rul un)r #act)ri (r)teici ()96 / )andem 9epeat -inding 6actor# B)E6( ` asigur% -ia7ilitatea celular% (e termen lung! ` lungimea A(4 telomeric scade cu naintarea n v$rst# 7actorii care contribuie la scurtarea telomerelor sunt: -3rsta, stresul, #umatul i $i#erii #act)ri meta7)lici! *iteza scurtrii telomerelor asociat v$rstei este mai mare n primele perioade ale vieii i scade pe msura naintrii n v$rst# Aceasta scdere contribuie la instalarea instabilitii cromozomale prin pierderi de fragmente din cromozom i rearan'ri cromozmiale, ceea ce caracterizeaz fenomenul de mbtr$nire sau senescen Mecanismul m)lecular al scurt%rii tel)merel)r ` &curtarea cromozomilor se produce datorit replicrii incomplete a A(4# 5eplicarea A(4 se produce diferit pe cele dou catene: catena conductoare 6^-F^ se sintetizeaz continuu n timp ce catena decalat F^-6^ se sintetizeaz pe fragmente scurte IEazaEi, dup secvene scurte de primeri ribonucleotidici# ,n final primerii sunt nlocuii cu secvene specifice A(4 (dezo!iribonucleotidice) i fragmentele sunt asamblate de ctre A(4 ligaz# 9u toate acestea nlturarea ultimului primer ribonucelotidic de pe catena decalat nou sintetizat nu are loc deoarece naintea lui lipsete o secven A(4# Primerul ribonucleotidic n final este degradat dar nu este nlocuit, rezult$nd o scurtare a cromozomului# &curtarea telomerelor p$n la v$rsta de )= ani are loc cu circa J= nucleotide0an iar la btr$nee viteza de scurtare scade progresiv, a'ung$nd la v$rsta de B= de ani la circa )= nucleotide0an# 5eplicarea telomerelor este asigurat de ctre o enzim special (telomeraza) cu funcie dubl: structural de primer i enzimatic de reverstranscriptaz. %ceasta este activ n celulele germinale imediat dup fecundare, dup care devine puin activ sau inactiv# Alte celule n care telomeraza este activ sunt celulele stem, foliculii piloi i celulele canceroase - n A=U din cazuri# Re(licarea ADN tel)meric ` &inteza unui capt telomeric (bogat n G) se realizeaz cu enzima special telomeraz# ` &inteza captului telomeric al catenei 6c - Fd cu a'utorul sistemului enzimatic primaz : polimeraz

6%

Tel)mera2a /i a(ari*ia cancerului ;ecanisme n cancer# 9elulele maligne se divid necontrolat 7oreaz sistemul imunitar care ncearc s fac fa bolii sau agenilor infecioi prin diviziunii din ce n ce mai rapide /n celulele maligne telomerele nu se scurteaz deoarece telomeraza devine activ i alungete telomerele n scopul supravieuirii i propagrii celulelor canceroase printr0un mecanism alternativ, diferit ce cel propriu celulei sntoase#

6)

/nactivarea telomerazei n culturi celulare cu fenotip malign a dus la in"ibarea creterii i proliferrii celulelor maligne &curtarea telomerelor a fost asociat cu mbtr$nirea sau senescena, diabetul za"arat de tip //, obezitatea, bolile cardiovaculare, etc# &-a constatat e!perimental c lungimea telomerelor este un caracter "eritabil *aloarea ") a lungimii telomerelor la om variaz ntre =,6J i =,B) fiind stabilit o corelaie mai ridicat ntre printele patern i descendeni dec$t ntre cel matern i descendeni

Curs.

Aci2ii nucleici4structur% /i #unc*ii


ADN ?I ARN ca material genetic
A(4 este purttorul informaiei ereditare la ma'oritatea organismelor lumii vii 0 organismele eucariote i la unele organisme procariote (bacterii, dezo!iribovirusuri)# - A54-ul poate fi materialul genetic al unor virusuri : ribovirusuri Procariotele ( eubacteriile, ar"ebacteriile i algele albastre-verzi)# sunt un grup "eterogen de unicelulare care nu au nucleu adevrat ncon'urat de membran nuclear# *irusurile: entiti infecioase formate din - material genetic (A(4 sau A54, liniar sau circular, mc sau dc) - ,nveli lipoproteic - 9apsid proteic ADN P(escoperit n %BJA de ctre cercetrtorul elveian Do"ann 7riedric" ;iesc"er P\nucleinY P %A)B : fenomenul de transformare genetic determinat de A(4# +!perimentele lui Griffit" pe oareci cu Streptococcus pneumoniae : ) tulpini a) netede : virulente : determin moartea, b) rugoase :nevirulente : neletale Goarecii in'ectai cu tulpina neted virulent &/// (omor$t iniial prin cldur) mpreun cu tulpina rugoas nevirulent 5// au murit de pneumonie iar n s$ngele acestora au fost detectate tulpini vii i virulente ale bacteriei &///# Griffit" concluzioneaz c tulpinile rugoase 5// s-au transformat n tulpini netede virulente de tip &///, ns natura materialului care confer virulen bacteriilor nu a fost cunoscut de ctre Griffit" (Griffit", %A)B)# P %A<< Aver?, ;cCeod, ;c9art? refac e!perimentele lui Griffit" i analizeaz bioc"imic natura materialului care a determinat transformarea (prin tratare cu enzime proteolitice, ribonucleaze i dezo!iribonucleaze) - concluzioneaz c natura materialului genetic care determin transformarea bacteriilor este de tip A(4 C)m()2i*ia c9imic% /i structura aci2il)r nucleici ADN /i ARN &tructura primar a A(4 i structura A54 9atene polinucleotidice (monocatenare) formate din monomeri nucleotide:6 elemente %# Pentoza- dezo!iriboza n A4( - 5iboza n A54

66

'! $)u% ti(uri $e 7a2e a2)tate purinele (A,G), structuri cu dou nuclee ciclice i pirimidinele (9,L n A(4 i 3 n A54 n loc de L) formate dintr-un singur nucleu ciclic

Prin legarea unei 7a2e a2)tate la ) (ent)2% re2ult% un nucle)si$ Cegturile ntre acestea sunt covalente i se realizeaz ntre carbonul 9% din pentoz i azotul 4A dintr-o purin sau 4% dintr-o pirimidin#

6<

4ucleotida : un nucleosid .un radical fosforic Polimerizarea nucleotidelor de pe o caten se face prin intermediul radicalului fosforic, prin carbonii 6c i Fc din pentoze

&tructura polinucleotidic a A54 %# Pentoza 0 riboza )# 8azele azotate purinice (A,G), pirimidinice (9, 3) 6# 5adical fosforic &tructur monocatenar, uneori cu false poriuni bicatenare (A54dc)

6F

+tructura secun$ar% a ADN


(escoperit de eatson i 9ricE pe baza studiilor anterioare %# : de difracie cu raze Q efectuate de 5osalind 7ranElin i ;aurice eilEins model sub forma de dublu-"eli! cu dou caracteristici distincte: distanele de-a lungul a!ului moleculei se repetau regulat i erau de =,6<nm i respectiv 6,< nm#

6J

)# studiile compoziiei cantitative a A(4 efectuate de +r@in 9argaff la dif# specii5egulile lui 9argaff (%) UA - UL i UG - U9 ()) 5aportul- purine (A,G): pirimidine(L,9)-%:% (6) A.L09.G f%

+tructura $u7lu49eli1 a ADN


;olecula de A(4 const din dou catene polinucleotidice rsucite una fa de alta spre dreapta n 'urul unui a! imaginar, sub forma unui model "elicoidal# 9ele dou catene sunt antiparalele, adic sunt orientate n direcii opuse# 3na are direcie ascendent 6^-F ^ iar cealalt este descendent F^-6^# Cegturile fosfodiesterice dintre nucleotidele unei catene sunt la e!teriorul "eli!ului iar bazele azotate sunt orientate spre a!# 8azele fiecrui lan polinucleotidic sunt legate de bazele celuilalt lan prin puni de "idrogen rezult$nd astfel structura secundar a A(4# Cegturile sunt ntotdeauna specifice, adenina se leag la timin prin legturi duble de "idrogen iar citozina la guanin prin legturi triple# 9u alte cuvinte ntotdeauna o baz purinic se leag n mod specific de una pirimidinic# Aceste legturi specifice dintre A-L i 9gG au confirmat teoriile emise de 9argaff# &pecificitatea legrii A de L i a 9 de G este cunoscut sub denumirea de

6N

c)m(lementaritate# Prin complementaritate nelegem c secvena n nucleotide de pe o caten dicteaz secvena n nucleotide a catenei antiparalele care trebuie s corespund n succesiunea nucleotidic prin complementaritate#

Punile de "idrogen fac simpl separarea celor dou catene prin simpla nclzire a soluiei n care se afl A(4-ul la o temperatur apropiat de punctul de fierbere (cca# A=-A<o9)# Astfel A(4-ul devine denaturat# 5enaturarea A(4 sau refacerea punilor de "idrogen se poate realiza prin rcirea lent a soluiei# (ac rcirea se face brusc A(4-ul rm$ne denaturat# 8azele azotate se gsesc la o distan de =,6< nm una fa de alta iar nlimea un tur complet al "eli!ului se defoar pe o distan de 6,< nm ceea ce nseamn c un tur c)nine 1E (erec9i $e 7a2e a2)tate# (iametrul e!tern al "eli!ului este de ) nm, cea mai subire fibr n cadrul modelului de compactare a A(4 n cromozomi : ,4 9I47I5;Ah/A 8 A A(4

A(4-ul poate e!ista n trei modele conformaionale diferite notate A, 8 i i# conformaiile A i 8 corespund structurii dublu-"eli! n care catenele sunt r%sucite s(re $rea(ta n 'urul unui a! imaginar iar dimensiunea unui tur A(4 comple!at cu "istone este de 1E411 nm "nucle)2)mul& ,n toate situaiile n urma rsucirii catenelor apar dou anuri, unul ma'or i unul minor# C)n#)rmaia A a A(4 este nt$lnit n caz de umiditate redus fiind o molecul mai groas i mai scurt cu diametrul e!tern de ',F nm! C)n#)rmaia B a ADN apare n condiii de umiditate mai ridicat fiind conformaia cea mai apropiat de cea nativ sau celular. 7orma 8 este mai subire i mai alungit dec$t forma A pentru acelai numr de nucleotide n lan#

6B

,nlimea unui tur complet al fibrei de A(4 n conformaia 8 este de 6,< nm iar n conformaia A de apro!imativ ),J nm# C)n#)rmaia G a A(4 corespunde rsucirii celor dou catene spre st$nga n care fiecare tur este format din %) pb iar diametrul e!tern al fibrei este de 1,H nm! ,nlimea turului complet la forma i este de <,F nm# (e asemenea anul minor este mai ad$nc iar cel ma'or este aproape de suprafaa "eli!ului +PECII DE ARN 0N CELULE Ca A54 nu se mai respect regulile lui 9argaff deoarece A54-ul este monocatenar (ei toate tipurile de A54 din celul sunt monocatenare unele prezint numeroase poriuni fals bicatenare realizate n urma unor plieri ale catenei c nd apar regiuni complementare ntre care se stabilesc legturi de "idrogen# Aceast conformaie la A54 este denumit structura secundar# ,ntr-o celul se gsesc mai multe specii de A54 care ndeplinesc roluri funcionale diferite - ARNmesager "ARNm&, ARN $e trans#er "ARNt&, ri7)2)mal "ARNr) i diferite specii cu rol reglator sau speciile mici $e ARN, denumite astfel datorit lungimii reduse a moleculelor> A54m : sau informaional se numete astfel deoarece transport informaia codificat de A(4 (mesa'ul genetic) n citoplasm la ribozomi, locul sintezei proteice# +ste monocatenar cu direcia F-6 Cungimea sa este variabil n funcie de cantitatea de informaie copiat (transcris) din A(4# - durata de via scurt - &e sintetizeaz continuu (A54m policistronic la procariote) (A54m precursor-intermediar :matur la eucariote) &inteza A54m la procariote cu singura ARN ()limera2% iar la eucariote sinteza se realizeaz cu a'utorul ARN ()limera2ei II!

ARN ri7)2)mal "ARNr& reprezint B=-BFU din cantitatea de A54 din celul, este monocatenar i stabil i nu se modific n cursul sintezei proteinelor# ;onocatena se pliaz : structur secundar i teriar cu poriuni dc# (e regiunile monocatenare se ataeaz A54m i A54t A54r este asociat cu proteinele ribozomale form$nd poliribozomii Loi ribozomii conin dou subuniti - una mic i alta mare, difereniabile prin constanta de sedimentare &vedberg (&) (%u&- %=-%6 s)# 5ibozomii B=& de la eucariote sunt formai dintr-o subunitate mare J=& (conine A54rF&, F#B& i )B&) i o subunitate mic <=& (conne A54%B&) # 5ibozomii N=& de la procariote sunt formai dintr-o subunitate mare F=& (conine A54r F& i )6&) i o subunitate mic 6=& (conine A54 %J&) 6A

sinte2a ARNr Ca procariote e!ist N uniti genice (operoni) pentru sinteza A54r cu un singur promotor# &inteza este realizat de A54pol/ Ca eucariote e!ist mai multe copii ale genelor pentru sinteza celor patru subuniti ribozomale# Genele pentru subunitile %B&, F,B& i )B& ale A54r sunt plasate una dup alta ntr-o secven repetat n tandem de %==-%=== ! n zona oragnizatorului nucleolar iar transcripia lor PARN ()limera2a I &inteza A54rF& P gene situate diferit n genom-cu a'utorul ARN ()limera2ei III ARN $e trans()rt "ARNt& reprezint %=-%FU din totalul A54 celular i are rol n procesul de biosintez a proteinelor, deoarece are proprietatea de a transporta aminoacizii activai la ribozomi, centrul de sintez al proteinelor# +!ist cel puin at$tea tipuri de A54t c$i aminoacizi eseniali e!ist, diferenierea se face pe baza compoziiei particulare n r4LP# Are structura monocatenar cu < regiuni bicatenare i forma de trefl

Re$iunea acce toare are $)u% e1tremit%*i ,I /i JI li7ere Loate speciile de A54t au la e!tremitatea 6c tripletul 99A (citozin-citozin-adenin) care servete <=

ca loc de ataare pentru aminoacizi n vederea transportului lor iar e!tremitatea Fc este permanent guanilat, fiind de structur GGG# %ucla & dihidrouracil "D=U&, sau 7ucla D Bucla num%rul II : secv antic)$)n format din trei nucleotide care se leag pe baz de complementaritate codonului din A54m# %ra'ul su limentar &&& (e!trabraul) cu numr variabil de nucleotide %ucla &( ) * C G (ribotimin-pseudouracil-citozin-guanin)

+inte2a ARNt &inteza A54t la bacterii este asigurat de gene care se gsesc n una p$n la c$teva copii n cromozomul bacterian (realizat de singura A54 polimeraz) iar la eucariote de gene care se repet de mai multe ori n genom (cu ARN ()limera2a III&

+(eciile mici $e ARN $in celuleKsmall RNA+


Inter#eren*a ARN Inacti-area e1(resiei genei ,n ultimii ani au fost descrise mai multe specii de A54 care nu codific proteine# (ei sunt transcrise de pe secvene de A(4 acestea nu sunt decodificate n secvene de aminoacizi# (eoarece toate au dimensiune redus au fost grupate generic sub terminologia de specii mici de A54 sau n englez small 9'%# &peciile mici de A54 e!ercit rol reglator n transcripia i translaia genelor care codific celelalte specii de A54 care intervin n sinteza proteinelor# Mecanismul en$)gen al inter#eren*ei ARN /nterferena A54-ului (A54i) este un proces celular normal prin care molecule scurte de A54 inactiveaz e!presia (translaia) unei gene de la eucariote Procesul const n: %# producerea a dou tipuri de A54dc: A54si i A54mi ( nt$linite la fungi, plante i animale) )# (igestia moleculelor A54dc cu enzimele Dicer n fragmente scurte

<%

6# Ataarea A54si i A54mi la comple!ul proteic 95S$ (9'% induced silencing comple")care conine proteinele Argonaut i care degradeaz una dintre catene din duple! 3neori n citoplasm moleculele mici de A54 pot iniia procesul de inactivare a %9'm prin: degradarea %9'm sau prin inhi area translaiei# Aceste molecule sunt speciile mici de A54 denumite A54si (A54 mic de interferen) i A54mi (micro A54) care au lungimea de )=-)J nt# %# A54si rezult din molecule lungi de A54 care devin dublucatenare - A54dc pe anumite portiuni# Acestea provin fie din celul (virusuri) fie sunt introduse n celul prin te"nicile /G ,n continuare, o protein cu funcie de enzim (Dicer) taie aceste molecula dc n segmente scurte de )=-)F nt : form$nd molecule de A54si (small interfering 54A) - )# A54mi rezult n nucleu, din secvenele de A54m care devin complementare pe regiuni scurte denumite - ucle ac de pr. Acestea sunt decupate de proteina Drosha i a'ung n citoplasm unde aceeai protein Dicer taie molecula n secvene scurte de )=-)% nt denumite miA54 - At$t siA54 c$t i miA54 se leag la comple!ul proteic de interferen 5/&9 (9'% induced silencing comple") care conine proteinele Argonaut i care degradeaz una din catene ,n moleculele de microA54 mature una dintre catene este denumit g"idant iar cealalt pasager# - 9omple!ul ribonucleoproteic va degrada catena pasager ls$nd secvena de A54si - A54mi monocatenar i activ, responsabil de inactivarea e!presiei genei# - ,n continuare secvenele monocatenare de A54si i A54mi mpreun cu proteinele 5/&9 se leag la A54m pe care l scot din funcie (prin degradarea lui sau in"ibarea translaiei)# - 5ezulatul interferenei A54si i A54mi cu A54m este inactivarea e!presiei genei# - ,n cazul plantelor aciunea miA54 este foarte eficient printr-un mecanism care funcioneaz prin degradarea A54m, deoarece miA54 se poate lega complementar de A54m at$t cu regiunile codificatoare c$t i cu cele de regla' ale genei n timp ce la animale complementaritatea este doar parial iar inactivarea e!presiei are loc mai ales prin reprimarea translaiei# - ;ecanismul ancestral al interferenei A54 intervine n activarea sistemului imunitar ca rspuns la atacul transpozonilor (la plante) sau al virusurilor la animale - ;oleculele de A54i endogen pot fi complementare regiunii promotor de la captului F^ (upstream regulation of gene) fie captului 6^ al A54m (do@nstream regulation of gene) i produc efecte variate - A) 5eglarea pozitiv a e!presiei genice: prin legarea A54si i (A54mi) la regiunile promotor ale genei c$nd are loc creterea e!presiei genei - 8) inactivarea sau scoaterea din funcie a A54m i a genei prin legare la captul 6 ^ sau F^ A54m

<)

;ecanismul interferenei A54si i A54mi

<6

A(lica*ii (ractice ale ARNi;inter#eren*a ARN e1)gen /n ingineria genetic A54i este utilizat n strategia antisens %# Presupune introducerea n celule de secvene scurte de A54 antisens 6^ -F^ (A54mi, A54si) complementare unei molecule sens F^ -6^ de A54m# )# /ntroducerea n celul de molecule A54dc corespunztoare unei gene care au ca efect inactivarea sau descreterea drastic a e!presiei genei (EnoEdo@n of gene) 0n me$icin% terapia antiviral pentru infecia virus "erpes simple! - tipul ) /n"ibarea e!presiei retrovirusurilor (tumorale) /nactivarea (HnocEdo@n) genelor pentru receptorii i coreceptorii virusului K/* /nactivarea genelor pentru "epatita A i 8 0n 7i)te9n)l)gii Ca plante: /n"ibarea produciei de to!ine n plante (la seminele de bumbac, bogate n proteine dar care produc i to!ine terpenoide> la manioc care produce compui cianici) - creterea rezistenei la virusuri i fortificarea plantelor prin creterea sintezei de antio!idani, producerea de tomate rezistente la nmuiere, flori variabil colorate la petunii etc - /n"ibarea alergenilor din tomate (solanina din frunze, tulpini i fructele verzi) - (escreterea coninutului de precursori carcinogenici din plantele de tutun (benzpiren, nitrozoamine) /nterferena A54 a fost descoperit n anul )==J de ctre 7ire i ;ello, laureai cu premiul 4obel Alte s(ecii $e ARN $in celul% ARN nuclear mic "ARNsn4 de la englezescul small nuclear 9'%& : este o clas de A54 identificat n nucleul celulelor eucariote, cu lungimea de %F= nucleotide care intervine n procesarea A54m prin e"cizia intronilor din transcript i asam larea e"onilor. +!ist mai multe specii de A54sn notate 3%, 3), 3<, 3F i 3J, fiecare asociate cu un numr variabil de proteine i prezente n numeroase copii n nucleu (cca# %=F copii0celul A54sn este transcris cu a'utorul A54 polimerazei // sau /// i formeaz comple!e ribonuceloproteice care se ataeaz la regiunile intronice din A54m precursor i produc tieturi ntre doi e!oni nvecinai# Procesul are loc n nucleu iar rezultatul este eliminarea intronilor din transcript# I alt funcie a ARNsn este aceea $e reglat)r /i $e men*inere a tel)merel)r! ARNsn) : ARN nucle)lar mic A54sno (small nucleolar 54A) : este o clas de molecule mici de A54 care se gsesc n nucleolii celulelor eucariote i care au rol n biogenza A54 n nucleoli i n prelucarea unor specii de A54 (A54t i A54sn), precum i n modificarea postranslaional a moleculelor A54r#

<<

9ursF REPLICAREA ADN 5UNCTIA AUTOCATALITICA 5eplicarea A4( este semiconservativ i semidiscontinu ;odelul propus de eatson i 9ricE (emonstrat n %AFB de ;att"e@ ;es"elson i 7ranE &ta"l

Mecanismul m)lecular al re(lic%rii ADN i En2imele (entru re(licarea ADN

<F

5eplicarea macromoleculei de A(4 dup modelul semiconservativ are loc n trei etape: ini*ierea re(lic%rii, el)nga*ia /i terminarea re(lic%rii care presupun: %# recunoaterea unor secvene din A(4 denumite \originea replicriiY )# 5uperea punilor de "idrogen dintre catene i formarea ochiului de sintez 6# Ataarea enzimei A(4 polimeraza dup secvene scurte denumite primeri i nceperea sintezei bidirecional, la nivelul furcii de replicare &inteza fiecrei catene se va realiza pe baz de complementaritate cu catena matri# &inteza se realizeaz continuu pe catena 6-F i discontinuu pe catena F-6 (pe fragemnte scurte IEazaEi)- semidiscontinuu Lerminarea sintezei i nlocuirea primerilor cu secvene A(4 3nirea fragmentelor IEazaEi cu enzima A(4 ligaza En2imele (entru re(licarea ADN /i r)lul l)r T)()i2)mera2ele de tip / i // sunt enzime care scindeaz reversibil una sau ambele catene de A(4 la nivelul legturilor fosfodiester, a'ut$nd la rela!area "eli!ului T)()i2)mera2ele de tip / scindeaz tranzitoriu o caten a A(4 (nic! translation) i produc o singur dezrsucire a "eli!ului iar cele de tip // scindeaz tranzitoriu ambele catene i produc dou dezrsuciri ntr-o intervenie la nivel A(4# Lopoizomeraza /, at$t la procariote c$t i la eucariote aparine tipului / iar topoizomeraza // de la eucariote i giraza de la procariote aparin tipului //# ,n timpul naintrii furcilor de replicare molecula de A(4 se superspiralizeaz prin aciunea "elicazei i se tensioneaz tot mai puternic# T)()i2)mera2a I la eucariote poate nltura at$t supersucirile negative c$t i pe cele pozitive din "eli! iar la bacterii topoizomeraza / poate nltura doar superrsucirile negative nu i pe cele pozitive care sunt nlturate de ctre A(4 giraza (topoizomeraza //) care n acelai timp introduce superrsuciri negative n "eli!

<J

ADN 9elica2ele ADN 9elica2ele degradeaz punile de "idrogen dintre cele dou catene asigur$nd desfacerea moleculei de A(4 n dou monocatene> ADN ()limera2ele ADN ()limera2ele sunt enzime care catalizeaz sinteza noilor catene de A(4, adug$nd nucleotid dup nucleotid pe baz de complementaritate cu catena matri, 8n $irec*ia JL4,L, n continuarea unui primer# *iteza cu care polimerazele fac sinteza A(4 - aprovimativ :CCC nucleotide7secund. 4umrul de nucleotide pe care l poate aduga polimeraza n timpul procesului de replicare se numete capacitate de procesare. 9apacitatea este specific fiecrei polimeraze i poate varia foarte mult, de la c$teva nucleotide p$n la F=#=== Nuclea2ele sunt enzime care degradeaz moleculele de A(4 prin clivarea legturilor fosfodiester dintre dou nucleotide nvecinate# <N

(egradarea legturilor se poate produce fie n interiorul duple!ului A(4 (endonucleaze) fie la capetele acestuia (e!onucleaze)# ,n replicarea A(4 e!onucleazele au rol corector al moleculei de A(4 iar acest rol este ndeplinit c"iar de ctre una dintre su unitile %D' polimerazei denumit exonucleaz de corectare, Acti-itatea e1)nuclea2ic% ,L4JL, prin care enzima corecteaz greelile de mperec"ere Acti-itatea e1)nuclea2ic% F^-6^ prin care enzima ndeprteaz nucleotidele din primer, n aceeai direcie n care se face i sinteza A(4#

9ele dou catene care se sintetizeaz diferit au denumiri diferite la procariote i la eucariote: $onductoare respectiv progresiv Decalat respectiv retrograd

<B

Prima2a &inteza primerilor, secvene scurte de circa F-%= ribonucleotide la procariote i B-%) ribonucleotide i %=-)= dezo!iribonucleotide la eucariote este asigurat de ctre o A54 polimeraz modificat, denumit A(4 (rima2a, respectiv A(4 polimerazab0primaza ADN4liga2ele ADN4liga2ele sunt enzimele care unesc fragmentele IEazaEi nou sintetizate de pe catena decalat prin formarea legturilor fosfodiester# +le intervin dup terminarea sintezei A(4, c$nd primerii sunt de'a nlocuii cu secvene dezo!iribonucleotidice i refac legturile fosfodiester dintre fragmente, d$nd natere unei secvene ne ntrerupte# En2imele im(licate 8n re(licarea ADN la 7acterii 9romozomul bacterian conine o singur molecul circular de A(4 a crui replicare implic J ADN ()limera2e n)tate I4V! A(4 polim / (Hornberg) s-a crezut iniial c este singura enzim e replicare de la bacterii# 3lterior s-a descoperit c ADN ()limera2a I /i III sunt principalele enzime de replicare# A(4 pol / este specializat n ndeprtarea primerului iar A(4 pol /// este responsabil cu replicarea ntregului cromozom bacterian (<,J Eb), av$nd o capacitate ridicat de procesare (%===nt0s) spre deosebire de A(4 pol / care poate procesa doar )=-%== nucleotide, suficient ns c$t s poat degrada primerul i s umple golul format cu dezo!iribonucleotide# Ambele enzime au activitate polimerazic F^-6^ i activitate e!onucleazic de corectare, n direcia 6^-F^, fenomen care apare cu o frecven de apro!imativ %=J# (oar A(4 polim / are activitate e!onucleazic F^-6^ de ndeprtare a primerului# 0n (r)cesele re(arat)rii ale ADN inter-in /i en2imele ADN ()limera2a II , IV /i V Genele (entru sinte2a ADN ()limera2el)r necesare re(lic%rii ADN &inteza ADN ()l I : ) sg gen% olA

<A

&inteza ADN ()l III : este ) 9)l)en2im% care const din %= subuniti din care 6 formeaz miezul enzimei cu rol catalitic &ubunitile miezului catalitic al "oloenzimei i funciile ndeplinite sunt: (5ussel, P#, )=%=): - +u7unitatea M (alfa, c)$i#icat% $e gena ADN4E), ndeplinete activitatea de polimerizare a A(4 F^ -6^ - +u7unitatea N (epsilon, c)$i#icat% $e gena ADN4O) - ndeplinete activitatea e!onucleazic 6^-F^ - +u7unitatea P (teta, c)$i#icat% $e gena holE), rol structural, stimuleaz activitatea de corectare a subunitii j =)l)en2ima ADN ()limera2a III conine pe l$ng secvena miez alte ase polipeptide (k, l, m, n, o, ]) care alctuiesc mai multe comple!e proteice cum sunt cele k (tau) i l (gamma) mpreun cu care enzima realizez sinteza#

R)lul c)m(le1el)r Q /i R &ubunitatea k este implicat n dimerizarea centrului catalitic al enzimei care prin dou brae ataaz la capete cele dou structuri miez ale enzimei A(4 polimeraza ///#, cu rol catalitic# 9omple!ul proteic l are rolul de recrutare a clemei glisante a %D' format din subunitile ] ale enzimei# 9omple! l mpreun cu o molecul de ALP desc"ide formaiunea inelar denumit clem glisant care nfoar molecula de A(4 i fi!eaz "oloenzima la catenele de A(4# 9omple!ul l de la procariote, poart numele de #act)r $e re(licare C la eucariote Clema glisant% $lema glisant se asociaz la cele dou centre catalitice ale A(4 polimerazei /// i mrete capacitatea de procesare a polimerazelor# +ste format din J subuniti ]

F=

Alte c)m(le1e (r)teice im(licate 8n re(licare 9omple!ul de preiniiere - proteina iniiator A(4-A - "elicaza (A(4-8) i proteina de recunoatere a "elicazei (A(4-9) 9omple!ul de iniiere primozom - 7ormat prin recrutarea primazei la comple!ul de preiniiere

c)m(le1ul (r)teic $e sta7ili2are a m)n)catenel)r (&&8-Single Strand -inding *roteins) se ataaz pe acestea, prevenind renaturarea A(4# M)$elul m)lecular al re(lic%rii semi$isc)ntinue al ADN la 7acterii Ini*ierea re(lic%rii ncepe ntotdeauna n aceeai poziie a moleculei de A(4 denumit originea replicrii (ori9)# &ecvena ori9 la E. coli este format din )<F nucleotide n care este prezent un fragment de %6 nucleotide de tip AL- repetat de trei ori n tandem i o secven de A nucleotide repetat n tandem de patru ori, la nivelul creia are loc startul replicrii#

F%

Procesul de iniiere se desfoar cu a'utorul (r)teinei ini*iat)r (A(4-A) care recunoate secvena tandem format din A nucleotide de care se ataaz# Aceeai protein se asociaz cu ADN 9elica2a (A(4-8), recrutat de o proteina specific (A(4-9& #)rm3n$ c)m(le1ul $e (reini*iere care degradeaz legturile de "idrogen din regiunea tandemic de %6 nucleotide, bogat n AL - d$nd natere ochiului de sintez# Prin desfacerea punior de "idrogen se formeaz monocatenele cu rol de matri i furca de replicare# Procesul de rupere a punilor de "idrogen dintre cele dou catene se numete $enaturare# Idat produse furcile de replicare stabilizarea i meninerea lor n formei literei p are loc cu a'utorul comple!ului proteic de stabilizare a monocatenelor &&8 care previne reformarea structurii dublu-catenare (renaturarea ADN)# /mediat dup ruperea punilor de "idrogen este recrutat ADN (rima2a (c)m(le1ul $e ini*iere (rimi2)m) care are rolul de a sintetiza (rimerul ARN format din F-%= ribonucleotide i cu direcia F^-6^, structur dup care va ncepe sinteza A(4# Pentru catena conductoarea primaza va sintetiza un singur primer iar pentru catena decalat enzima va sintetiza c$te un primer pentru fiecare fragment IEazaEi format din %===-)=== nucleotide la procariote El)nga*ia ,ncep$nd cu punctul ori9 sinteza noilor catene se va realiza bidirecional, la baza furcilor de replicare (fiecare de forma literei p) p$n la punctul numit terminarea re(lic%rii ter &inteza este asigurat de 9)l)en2ima ADN ()limera2a III care se prinde cu clema glisant de catena de A(4 i cu centrele catalitice imediat dup primer desfur$nd adugarea de nucleotide n direcia F-6 &inteza se face continuu pe catena conductoare i discontinuu pe catena decalat# Pe msura completrii furcii de replicare cu noile catene de A(4, "elicazele (A(4-8) rup punile de "idrogen din "eli! n faa "oloenzimei cre$nd tensiuni n molecula aflat n replicare prin producerera de superrsuciri# ,n acest moment intervine gira2a o topoizomeraz de tip // care nltur supersucirile pozitive prin producerea de tieturi dc ns acceai enzim poate induce i superrsuciri negative# Acestea din urm sunt nlturate de t)()i2)mera2a I!

F)

Pe tot parcursul sintezei, monocatenele furcii de replicare sunt meninute de (r)teinele $e sta7ili2are a m)n)catenel)r ++B care previn renaturarea A(4# Terminarea re(lic%rii +ste marcat de nt$lnirea punctului ter sau terminarea replicrii# Pentru producerea unei secvene continue de A(4 trebuie nlocuite secvenele primer care au structur de tip A54 ADN ()l I diger secvenele primer prin activitatea e!onucleazic F-6 i completeaz intervalul cu d4LP e!ercit$nd activitatea polimerazic F-6# 7ragementele IEazaEi sunt acum structuri A(4 iar unirea lor sub forma unei secvene continue se face cu ADN liga2a! M)$elul re(lic%rii cr)m)2)mului 7acterian : mecanismul t9eta

F6

Mecanismul m)lecular al re(lic%rii ADN la eucari)te Genomul nuclear eucariot este format din cr)m)2)mi cu structur% liniar%, fiecare conin$nd o singur molecul de A(4 de lungime enorm# 7iecare molecul de A(4 este comple!at cu proteine "istonice i compactat prin spiralizare, pliere i superpliere# 5eplicarea A(4 cromozomial la eucariotelor are loc n interfaza mitozei, n perioada sintetic & dei unele procese ncep c"iar din perioada presintetic G%# (atorit dimensiunii mari a A(4 de la eucariote replicarea este iniiat n mai multe ori$ini ale re licrii care vor da natere la mai multe ochiuri de sintez#

F<

7iecare unitate n care este iniiat sinteza se numete re(lic)n sau unitate $e re(licare! (e e!emplu omul are ntre %=#=== i %==#=== origini ale replicrii, cu alte cuvinte c$te una la fiecare 6== Eb (Eilobaze), iar dro'dia Saccharomyces cerevisiae are circa 6== origini, c$te una la fiecare <= Eb# Ca eucariote viteza de sintez este mult mai mic, de circa %==pb0s# Astfel, la om ntregul genom nuclear (care conine J,< ! %=Apb), este replicat n B ore iar la alte specii poate dura o lun de zile Ini*ierea re(lic%rii Pr)teinele ini*iat)r la eucariote aparin comple!ului de recunoatere a originii ORC (=rigin 9ecognition $omple"- I59)# C)m(le1ul ORC este o structur format din ase subuniti: trei dintre subuniti (orcp%, orcp< i orcpF) ndeplinesc rolul proteinei iniiator A(4-A de la procariote, de recunoatere i legare la regiunea originea replicrii o subunitate specific de legare la origine care se ataeaz n maniera situs specific i mpreun cu o alt protein (cdcJp) proceseaz originea i recruteaz "elicaza ;9; de la eucariote# Ca eucariote #iecare )rigine a re(lic%rii este acti-at% ) singur% $at% 8n ciclul celular Primul pas n iniiere este recun)a/terea simultan% a tutur)r )riginil)r re(lic%rii care are loc prin intermediul comple"ului proteic =9$# proces care se desfoar n faza D:# /mediat dup legarea comple!ului I59 la originile replicrii sunt recrutate alte proteine care formeaz c)m(le1ele (re4re(licati-e "(re4RC&# ,n contrast cu procesul de replicare bacterian denaturarea nu are loc imediat ci este am$nat p$n n momentul n care celula trece n faza & c$nd acest comple! pre-replicativ este activat Am$narea iniierii replicrii p$n n faza & este controlat de anumite proteine (licensin$ factors)# &inteza acestor proteine are loc tot n faza G% c$nd proteinele trec din citoplasm unde au fost sintetizate, n nucelu i se leag la comple!ul pre-replicativ (pre-59)# ,n faza sintetic & comple!ului prereplicativ i se altur alte proteine0enzime (9elica2a MCM, clema glisant) care vor iniia denaturarea A(4 i vor da startul replicrii# En momentul iniierii replicrii proteinele (licensing factors( sunt inactivate astfel nc$t replicarea are loc o singur dat la nivelul unui replicator# El)nga*ia este procesul de sintez a noilor catene de A(4 care se realizeaz n manier asemntoare cu cel de la procariote# Ca eucariote sec-en*a (rimer este $e ti( ARN4ADN! cele $)u% catene se -)r sinteti2a cu en2ime $i#erite En2imele im(licate 8n re(licarea ADN la eucari)te

FF

se cunosc mai mult de %F A(4 polimeraze implicate n replicarea A(4 la eucariote ale cror funcii ns sunt incomplet descifrate# ,n mod curent, n replicarea A(4 nuclear intervin trei A(4 polimeraze: - ADN ()limera2a b0primaza (Pol b0primaza) : sinte2a (rimerului - ADN ()limera2a N (Pol j0epsilon) N realizeaz sinte2a c)ntinu% a catenei conductoare - ADN ()limera2a S (Pol m0delta) realizez sinte2a $isc)ntinu%, pe fragmente IEazaEi a catenei decalate Pe l$ng enzimele Pol b0primaza i Pol m care intervin n replicarea catenei retrograde la eucariote mai intervin i alte enzime i proteine# Clema glisant% a ADN sau c)m(le1ul (r)teic PCNA (*roliferating $ellular 'uclear %ntigen), #act)rul $e re(licare C (579) ($omple"ul F la proc( c)m(le1ul (r)teic $e re(licare A (replicating protein %( din categoria comple"elor proteice de sta ilizare a monocaternelor SS-# nuclea2ele 5EN 1 /i RN4a2a = i ADN liga2a! etape 5)rmarea c)m(le1el)r $e recun)a/tere a )riginil)r ORC n G% Ata/area (r)teinel)r "licensin$ factors&! 5)rmarea c)m(le1el)r (re4re(licati-e prin ataarea odat a "eli!azei ;9; i ulterior a clemelor glisante (P94A) n faza & care vor iniia denaturarea A(4 i vor da startul replicrii# en2ima ADN ()limera2a M;(rima2a are rolul de a sintetiza primeri A54-A(4 cu direcia F_-6^ care la eucariote sunt formai din B-%) ribonucleotide la care enzima mai aduga la captul 6_ i o secven scurt dezo!iribonucleotidic format din %=-)= nucleotide# &ecvena primer A54-A(4 este recunoscut de 5act)rul $e re(licare C (579) care se ataaz comple!ului i elibereaz Pol b0primaza# (up disocierea enzimei Pol b0primaza este recrutat c)m(le1ul (r)teic PCNA "Proliferating 9ellular 4uclear Antigen) sau clema glisant care are ca rezultat legarea enzimei ()limera2a S dup secvena primer, unde va fi iniiat sinteza catenei decalate (retrograde) i totodat fi!arez enzima n timpul naintrii i i mrete capacitatea de procesare# Pe catena 6^-F^ se ataeaz ADN ()limera2a N care realizeaz sinteza continu a catenei progresive 0nl%turarea (rimerului /i 8nl)cuirea lui cu ) sec-en*% $e2)1iri7)nucle)ti$ic% se reali2ea2% $i#erit la eucari)te# ADN ()limera2a S continu sinteza p$n nt$lnete urmtorul fragment IEazaEi c$nd iniiaz dislocarea captului F^ al fragmentului IEazaEi produc$nd o regiune monocatenar sub forma unei clapete# (igerarea primerului ribonucleotidic este asigurat de dou nucleaze 7+4% i 54-aza K iar nlocuirea lui de ADN ()limera2a S!

FJ

Terminarea re(lic%rii : 9romozomii eucariotelor au structur liniar ceea ce nseamn c au si capete numite telomere# &tructura telomerelor este format din uniti &&5 "e!anucleotidice (6-LLAGGGF) repetate n tandem de %==-%=== de ori# Ca sf$ritul cromozomului A(4-ul telomeric este monocatenar i formeaz o bucl, bucla-L care ptrunde n secvena dublu-catenar form$nd o bucl de nlocuire : bucla (# ,nlturarea ultimului primer ribonucelotidic de pe catena nou sintetizat nu are loc deoarece naintea lui lipsete o secven A(4# 5eplicarea este incompleta insa procesul este remediat de telomeraza Lelomeraza este o enzim cu funcie de transcriptaz invers care este activ doar n anumite perioade ale vieii (celule germinale) i n unele celule proliferative (celule stem, canceroase etc#)# Activitatea ei scade progresiv n celulele adulte Pierderea telomerelor duce la dezorganizarea cromozomilor si in final liza celulelor#

Tel)mera2a
+ste format din $)u% su7unit%*i: una cu r)l structural $e (rimer i cealalt% cu r)l en2imatic $e transcri(ta2% in-ers%! Lelomeraza se ataeaz la captul mai lung al unei catenei de A(4 (retrograd) prin prima secven A54 cu rol de primer i realizeaz propria reverstranscripie dup primerul A54# 9ealalt caten 6-F se sintetizeaz obinuit cu A(4 PIC/;+5AiA#

CursF ORGANIGAREA +ECVENTELOR DE ADN 0N NUCLEII CELULELOR EUCARIOTE

FN

Ca nivelul fiecrei cromatide surori din cromozomul metafazic se afl c$te un dublu "eli! de A(4# Ca eucariote genomul este mult mai comple! (la om: genomul "aploid cuprinde 6 ! %=A pb din care doar )F#=== sunt gene codante pentru proteine, apro!# )U)# M%rimea gen)mului eucari)t nu este corelat cu comple!itatea organismului

(up frecvena de apariie a secvenelor n genom acestea sunt grupate n 6 categorii: %# 4 +ECVENTELE UNICE : o copie, dou sau c$teva copii# 9uprind: - genele structurale care codific proteinele ((oar 'U din genom cuprinde secvene care se transcriu i se traduc : acestea formeaz e!omul celulei) '! +ec-en*e m)$erat re(etate, $is(ersate 8n gen)m Genomul eucariot conine o cantitate cu mult mai mare de A(4 repetitiv, dec$t A(4 care codific proteine# &ecvenele repetate moderat (c$teva-%=F0genom) sunt distribuite prin genom i sunt reprezentate de gene care unele se transcriu $ar nu se tra$uc altele nu se transcriu /i "inacti-e& - trans()2)niiV.JU - gene (entru s(eciile $e ARN $in celul% - genele (entru (r)teinele 9ist)nice .! +ec-en*ele 8nalt re(etate /i tan$emi2ate &ecvenele nalt repetate sunt secvene simple de A(4 repetate n tandem (%=F%=N0genom) (in aceast categorie fac parte: sateliii ()==pb) distribuii n telomere i n centromer i secvenele simple repetate &&5 (&imple &eMuence 5epeats):

FB

a)- ;inisateliii sau secvenele *4L5 (*ariable number in tandem repeats) (zeci de pb)n b)- ;icrosateliii sau secvenele &L5 (&"ort tandem repeats) (%-J pb)n &unt noninformaionale (nu se transcriu0traduc) Clase $e sec-en*e ADN +ec-en*ele care c)$i#ic% (r)teinele &tructura genelor eucariote este discontinu fiind format din uniti informaionale sau e!oni i uniti noninformaionale sau introni - acetia sunt eliminai din A54m precursor n timpul prelucrrii informaiei genetice# Lotalitatea e!onilor din gene alctuiesc e!omul celulei ce reprezint doar )U din genom# Acestea se transcriu i se traduc ntr-un produs polipeptidic Alte gene care se transcriu $ar nu se tra$uc I proporie foarte mare din gene se transcriu n ARN #unc*i)nal nec)$ant $ar nu sunt translatate 8n (r)teine ".;J $in transcri(t)mul celulei&

Alte clase $e sec-en*e (%) Intr)nii $in gen% reprezint o proporie semnificativ din genom : 'FU! ()) Pseu$)genele - 1'U (6) +ec-en*ele 8nalt re(etate $e ti( micr)satelit, minisatelit : ,U, i secvenele slab repetate (&egmental duplication or lo@-cop? repeats) : FU (<) +ec-en*e $istri7uite (rin gen)m 4 trans()2)nii sunt grupate n dou clase: trans()2)nii ADN ",U& i retr)trans()2)nii $in care #ac (arte sec-en*ele L)ng Terminal 5epeats (BU), secvenele +INE +9)rt Inters(erse$ Elementes "1,U& i secvenele LINE L)ng Inters(resse$ Elements "'EU&! (F) +ec-en*ele im(licate 8n reglarea structural% la nivel "eterocromatic reprezint o proporie de HU din genomul nuclear#

FA

9ursN GENOMIC6 CARTAREA ?I +ECVENTIEREA GENOMULUI 9e este genomicaO Denomica este tiina care se ocup cu izolarea i analizarea secvenelor complete de %D' dintr0un genom. Ca baza acestei tiine st te"nologia A(4 recombinat prin care se realizeaz clonarea fragmentelor de A(4 i secvenierea acestor fragmente pentru descifrarea stucturii i caracterizarea lor ulterioar din punct de vedere funcional Primul genom complet descifrat, care provine de la o entitate celular eucariot, a fost cel de A(4 mitocondrial, care cuprinde %J%FA p8, este dublucatenar i circular# Genomul nuclear uman este de )==#=== de ori mai mare, fc$nd astfel studierea lui mult mai dificil# (ezvoltarea pe la mi'locul anilor %AB= a te"nicilor de secveniere i analiz computerizat a fcut posibil caracterizarea unui numr mare de secvene, nregistr$ndu-se un progres vizibil, care, de altfel, a fcut posibil i apariia tiinei denumit genomic# Idat ce o secven de A(4 genomic a fost complet descifrat, datele obinute sunt stocate n bnci de date "GeneBan<& i apoi pot fi utilizate pentru cutarea prezenei lor la alte specii# Pentru a nelege irul descifrrii unui genom este necesar cunoaterea: +tapelor parcurse n descifrarea unui genom> tehnicilor utilizate pentru studierea genomului (ce sunt hrile fizice i cele genetice( modalitile de a reviere, J=

identificarea i descrierea unei gene, precum i a altor secvene din genom# CARTAREA GENIC6 Primul obiectiv din analiza oricrui genom este reprezentat de cunoaterea distribuiei genelor pe fiecare cromozom, ordinea n care sunt aceste gene n cromozomi i distana dintre ele# Aflarea poziiei diferiilor loci n cromozomi este urmat de reprezentarea grafic denumit "art cromozomial# 7iecare cromozom al unei specii are "arta sa genic# ,ntocmirea "rilor cromozomale constituie procesul de cartare sau cartografiere genic# Krile genice ,ntr-o prim etap este necesar realizarea unui sc"elet al "rii prin acoperirea genomului cu mar!eri polimorfici situai la intervale regulate (&L& 0 seMuence taget sites)# ,n etapa a doua, acest sc"elet este utilizat pentru a obine o "art de rezoluie mai mare# ,n etapa a treia are loc o secvenierea nucleotidic a genelor clonate# Ti(uri $e 9%r*i cr)m)2)male ,n funcie de metodele de cartare se disting: "arta genetic (de linEage)> "arta fizic Karta genetic este reprezentarea grafic a distribuirii genelor pe cromozomi, realizat prin ncruciri (intercross, bacEcross, analiza segregrilor mendeliene, relaiei de linEage)#,n acest caz distanele sunt date n uniti de recombinare (c;) Karta fizic este reprezentarea grafic a distribuirii genelor pe cromozom, n care distanele sunt date n uniti fizice (p8)# 7iecare tip de "art are propriul sistem de marEeri ce se mpart n trei categorii: gene> fragmente de A(4 anonime> loci de traiect scurt la e!tremitile secvenelor delimitate (&L&)# ,n clasificarea lui Ic8rien i col# (%AA6), genele constituie loci de tip 5 iar fragmentele de restricie i mini0 microsateliii loci de tip // polimorfici n cadrul speciei ()# ;arEerii (&L& )SeGuence )agget Sites reprezint legtura critic ntre "rile genetice i cele fizice# 9ele ) tipuri de "ri sunt complementare i nu identice# Pentru realizarea "rii moleculare, "arta genetic se va contopi cu "arta fizic# Met)$e $e cart)gra#iere genic% 9artarea genetic utilizeaz metodele clasice: studii de linEage familiale realizate n cadrul pedigreelor, sau prin bacErossuri i intercrossuri n populaiile de animale

J%

9artarea fizic utilizeaz te"nici moderne ale biologiei moleculare (P95, "ibridarea acizilor nucleici, te"nologia A(4 recombinat) Datele $e sec-en*e )7*inute 8n stu$iile $e gen)mic% Sunt utilizate de Gen)mica #unc*i)nal% care se ocup cu descifrarea funciilor genelor, ofer informaii despre c$nd i cum este utilizat informaia genetic din gen, etc i de gen)mica c)m(arati-% n care sunt comparate genomuri ntregi (sau fragmente) de la specii diferite pentru a nelege procesul evolutiv i diferenele de ordin biologic dintre specii# Pr)iectul -enomul uman Ca inierea proiectului genomului uman, costurile au fost estimate ca fiind n 'ur de 6 miliarde de dolari pe o durat de %F ani, startul proiectului fiind dat n %AA=# 9onsoriul internaional implicat n realizarea acestui proiect s-a reunit sub denumirea de =UGO "=UMAN GENOME ORGANI+ATION&, fiind format din foarte muli cercettori i susinut financiar din diferite surse guvernamentale (4/K), companii ((epartamentul +nergetic al &3A) i de numeroase ri care au participat la proiect: &3A> ;area 8ritanie, 7rana i Daponia# 3lterior s-a alturat 9ompania 9elera Genomics care a iniiat un proiect paralel de descifrare i a a'utat la finalizarea proiectului# ,n anul )==) proiectul a fost finalizat ns publicarea lui complet a avut loc un an mai t$rziu# E1tensia (r)iectului 9a parte integrant a proiectului genomului uman au fost i studiile genomice asupra organismelor simple, (model) deoarece genomul acestora este mai puin comple! dec$t cel al omului, datele obinute au fost utilizate de genomica comparativ n scopul gsirii de similitudini cu genomul uman : (bacteria E.coli, dro'dia S.cerevisiae, musculia de oet, viermele nematod $aenora ditis elegans i oarecele)# Cum se reali2ea2% 9%r*ile #i2ice 9romozomii liniari eucarioi au lungime foarte mare iar descifrarea structurii lor este posibil doar dac A(4-ul este fragmentat# 7ragmentele obinute trebuie secveniate i apoi asamblate n structura lor original# Acest proces este foarte dificil deoarece ma'oritatea fragmentelor au dimensiuni similare# ,n acest scop au fost iniiate dou strategii pentru asamblarea corect a fragmentelor: - secvenierea shotgun 0 chromosome 4al!ing (escifrarea genomului uman s-a realizat cu strategia s"otgun i pe msura avansrii au fost automatizate o parte din te"nici a'ung$ndu-se n prezent la posibilitatea descifrrii unui genom eucariot ntr-o singur zi# Asamblarea genomului n forma sa original, dup secveniere este un proces foarte dificil care s-a realizat etapizat, primul proces fiind acela de clonare a fragmentelor genomice sub forma unor librrii genomice prin intermediul te"nologiei A(4 recombinat#

J)

CONVERTIREA UNUI GENOM 0N CLONE ?I A CLONELOR 0NTR4UN GENOM Primul pas n studierea genomului este acela de a fragmenta molecula de A(4 n piese mai mici care pot fi clonate n diferite gazde ce pot fi cultivate uor i pot fi manipulate n laborator# (intre acestea bacteria E.coli i dro'dia Saccharomyces cerevisiae sunt gazdele cel mai bine cunoscute i caracterizate, care pot clona fragmente de A(4 n numeroase copii, fragmente ce pot fi meninute la nivel celular, de unde pot fi apoi recuperate i caracterizate# (e cele mai multe ori n caracterizarea unui genom se ncepe cu ntocmirea sc"eletului 9%r*il)r #i2ice (rin ()2i*i)narea mar<eril)r +T+ "+eWuence Taget +ites&, capete descifrate ale fragmentelor din librriile genomice care au poziie fi! n genom (unele fiind situsuri ale enzimelor de restricie cu a'utorul crora s-a realizat digestia genomului)# 3lterior sunt poziionate genele structurale pentru care sunt ntocmite librriile de A(4c pornind de la A54m al genei# Idat cu acestea "arta fizic este completat cu secvenele structurale denumite +&L "E1(resse$ tagget +ites&! 5egiunile intergenice sunt ultimele poziionate n "art iar la final are loc adnotarea i caracterizarea secvenelor# *ariaiile e!istente n genom (polimorfismele) completeaz "rile cu marEeri de tip &4P av$nd ca rezultat obinerea celor mai detaliate "ri fizice# Reali2area unei 9%r*i #i2ice Pentru a realiza o "art fizic trebuie mai nt$i ca genomul s fie fragmentat n secvene cu capete suprapuse, prin digestie parial n vederea clonrii i alctuirii librriilor de gene# Aceasta re realizez prin te"nologia A(4 recombinat# CLONAREA MOLECULAR6 A ADN 9lonarea molecular a A(4 cuprinde c$iva pai eseniali: (%) /zolarea A(4 de la un organism ()) Lierea A(4 n mai multe fragmente de dimensiuni variabile cu a'utorul enzimelor de restricie i ligarea (cu enzima A(4 ligaza) la molecula vectorului care a fost desc"is cu aceeai enzim de restricie cu care a fost izolat fragmentul de A(4 (6) /ntroducerea moleculei de A(4 recombinat n celule gazd de tipul +#coli care astfel vor suferi un proces de transformare genetic# (<) 5eplicarea moleculei de A(4 recombinat este numit cl)nare m)lecular%! Acest prooces are loc n celula gazd# Prin multiplicare ulterioar a celulei gazd moleculele de A(4 recombinat vor trece la descendeni care, la r$ndul lor, vor produce numeroase copii ale clonei iniiale#

J6

ENGIMELE DE RE+TRICTIE 7ac parte din categoria nucleazelor acestea fiind endonucleaze, care acioneaz n interiorul catenei# 3nele dintre ele taie moleculele de acizi nucleici numai ntre unele baze particulare sau numai la nivelul unor secvene specifice de nucleotide# Acestea sunt en2imele $e restric*ie. ;area ma'oritate a enzimelor au situsuri de recunoatere formate din < pb (taie des) sau J pb (taie rar) i taie mai ales n interiorul situsului de recunoatere Ti(uri $e restric*ie /i situsurile en2imel)r Denumirea enzimelor de restricie se formeaz dup o anumit regul, astfel: spre e!emplu enzima Eco5/ prima liter definete genul (Escherichia), urmtoarele dou specia bacterian de la care a fost izolat (coli), acestea fiind urmate uneori de alte litere care definesc plasmida care o produce (5) i cifra roman /, // sau /// care indic modul de aciune# Pot produce capete boante sau adezive VECTORII PENTRU CLONARE ?I CLONAREA ADN *ectorul este un element esenial al te"nologiei A(4 recombinat care are rolul de transporta fragmentului de A(4 ctre o celul gazd i pe care l prote'eaz de aciunea de degradare a enzimelor din celula gazd# ,n funcie de mrimea fragmentului ce urmeaz s fie clonat, au fost construite mai multe tipuri de vectori care se replic numai n anumite gazde specifice: Plasmi$ele4 pot clona fragmente de A(4 cuprinse ntre =,% i %= Eb> 5agii : derivai din bacteriofagul lambda, av$nd materialul genetic format dintr-o molecul de A(4 liniar, la care o regiune neesenial poate fi nlocuit cu un A(4 strin fr ntreruperea ciclului celular, i care pot clona fragmente de A(4 de p$n la )6 Eb> Vect)rii 9i7ri2i $e ti( #agemi$e 4 *ectorii fagemide sunt plasmide modificate artificial, ce conin inserate secvene de la fagii filamentoi, cum sunt ;%6, fd i f%# &ecvenele selecionate de la fagi conin n ntregime elementele cis-responsabile cu replicarea A(4 i asamblarea n particulele virale mature# Aceti vectori permit clonarea unui insert de c$teva Eb, iar dup transformarea celulelor bacteriene de tip E.coli, cu un fagemid recombinat , celulele bacteriene sunt suprainfectate cu un fag a'uttor filamentos ("elper p"age), cum este fagul f%, ce conine informaia necesar sintezei proteinelor din nveli# C)smi$ele : molecul de A(4 circular e!tracromozomial ce combin proprietile fagilor i a plasmidelor, limitele mrimilor de clonare fiind cuprinse ntre 6=-<F Eb> Bacteri)#agul P1 : pentru clonarea moleculelor de A(4 de circa %== Eb >

J<

Vect)rii PAC : sunt vectori recombinai P% ce au unele elementele virale de la bacteriofagul P% i elemente de la plasmide, n ei se pot clona fragmente mai mari de A(4 de p$n la %F= Eb# Cr)m)2)m 7acterian arti#icial "BAC& : fiind construit pe baza miniplasmidelor bacteriene 7 care poate clona fragmente mari de 6== Eb> ;a'oritatea librriilor genomice au fost realizate cu aceti vectori Cr)m)2)m arti#icial $e $r)C$ie "XAC&- un cromozom artificial ce conine telomerele, originea replicrii i un centromer de la dro'die, precum i un marEer de selecie pentru identificarea celulelor de dro'die cu A(4 recombinat# ;rimea fragmentului ce poate fi clonat n aceti vectori este cuprins ntre =,)-)= ;8# Vect)rul $e cl)nare M%rimea insertului *ectori plasmidiali standard *ectori de inserie derivai din bacteriofagul V %= Eb %= Eb

*ectori de nlocuire derivai din bacteriofagul V )6 Eb *ectori cosmide 8acteriofagul P% *ectorii PA9 (cromozomul artificial P%) *ectorii 8A9 (cromozom bacterian artificial) *ectorii pA9 (cromozom artificial de dro'die) << Eb %== Eb %F= Eb ;ai mult de 6== Eb )#= ;b

Vect)rii (entru li7r%riile gen)mice *ectorii care stau la baza construirii librriilor genomice sunt (lasmi$ele sau -ect)rii 9i7ri2i #agemi$e, -ect)rii BAC, PAC /i XAC! *ectorii plasmidiali cuprind c$teva elemente eseniale i anume: )riginea re(lic%rii mar<eri $e selec*ie (gene de rezisten la antibiotice sau gena laci din operonul lac de la +#coli) unul sau mai multe situsuri $e restric*ie> unii vectori construii mai recent conin un situs multi(lu $e cl)nare unde, se poate aciona cu mai multe enzime de restricie: 3n astfel de e!emplu este -ect)rul (Bluescri(t II care se re(lic% 8n ga2$a E!c)li! Caracteristicile -ect)rului JF

poate fi prezent n circa %== copii0celul datorit regiunii ori foarte active> marEeri de selecie - gena de rezisten la ampicilin (Amp5) situs multiplu de clonare (&;9) pentru %B enzime de restricie &;9 este inclus n interiorul genei laci, un marEer de selecie a clonelor recombinate dup culoarea alb0albastr ,n vectorii p8luescript pot fi clonate fragmente mai mari dec$t n plasmide, respectiv de %F E8 Karta vectorului p8luescript//

I2)larea rec)m7inan*il)r cu -ect)rul (Bluescri(tII 9u a'utorul coloraiei Q-gal, prezena sau absena genei pasager poate fi detectat dup coloraia coloniilor astfel: coloniile care vor produce 8-galactozidaz, codificat de gena lac+ nu au gena pasager integrat n vector, gena laci fiind activ acestea se vor colora n alb> n timp ce coloniile care nu produc 8

JJ

galactozidaz (gena fiind integrat n vector) vor determina coloraia albastr a coloniilor Cl)narea 8n -ect)rul BAC "7acterial arti#icial c9r)m)s)me& *ectorii 8A9 sunt vectori de clonare ce conin )riginea re(lic%rii $e la (lasmi$ele 5 , un situs $e restric*ie multi(l% /i mai mul*i mar<eri $e selec*ie! Aceti vectori au fost creai n scopul mririi capacitii de clonare a insertului# (ac un plasmid bacterian poate clona un fragment de ma!im %= Eb, vectorii 8A9 pot include un fragment de ,EE <7# 3n avanta' n plus a acestor vectori este acel c pot fi introdui n gazde bacteriene, de tipul E.coli cu un insert enorm# 7actorul 7 confer avanta'ul ca aceti fi meninui ntr-o singur copie n celul, elimin$ndu-se astfel posibilitatea recombinrii sau a pierderii insertului (ezavanta'e: prezena n insert a unor regiuni bogate n AL (mini i microsateliii) sunt to!ice pentru celula gazd E.coli care ncearc s le elimine# Categ)rii $e -ect)ri BAC *ectorul (Bel)Bac poate fi clonat n gazde de E.coli# selecia recombinanilor fc$ndu-se dup culoare alb0albastr a coloniilor# I alt gen de selecie prezent n vector este gena de rezisten la cloramfenicol (9;5.) care omoar celulele nerecombinate, cloramfenicolul in"ib$nd replicarea A(4 genomic al bacteriei i nu afecteaz replicarea vectorului# Lransferul genei se poate face cu a'utorul unui fag# *ectorii (Bel)BAC11 are mai multe situsuri de clonare n interiorul genei Caci# /ntroducerea insertului n interiorul genei @aci va represa transcripia i sinteza enzimei ] galactozidaza iar selecia clonelor dup culoarea alb n mediu cu lactoz ( n prezena Q-gal) va indica coloniile transformate# *ectorul p8elo8ac %% are la baz miniplasmidele 7 ce conin informaia genetic pentru autoreplicare unidirecional (rep +) i informaia pentru reglarea numrului de copii0celul (parA i par8)# Ca vector sunt adugate mai multe situsuri de clonare (;9&) flancate de promotorii universali a fagului LN i &PJ i regiuni bogate n 9G pentru situsul enzimelor de restricie (e!cizia pasagerului)# Adiional s-a adugat un marEer de rezisten la cloramfenicol pentru selecia bacteriilor netransformate (cloramfenicolul in"ib replicarea A(4 genomic)#

JN

Cl)narea 8n -ect)rul XAC ".east Artificial Chromosome& Vect)rii XAC sunt vectori e clonare artificiali care fac posibil clonarea unor fragmente mai mari de A(4 n celule bacteriene sau de dro'dii# Cungimea fragmentului de A(4 ce poate fi clonat n aceti vectori este mult superioar vectorilor 8A9, adic =,) : ) ;b# Genomul vectorului pA9 n form liniarizat conine urmtoarele elemente: secvena Lel (telomere) la fiecare capt> secvena 9+4 (centromer) responsabil cu segregarea cromozomilor n mitoz> un marEer de selecie pe fiecare bra pentru detectarea i meninerea vectorului pA9 n celula de dro'die (cu genele L5P% i 35A6 care necesit prezena adoi aminoacizi n mediu: triptofan i uracil)> Iriginea replicrii (ori) responsabil cu circularizarea vectorului n momentul ptrunderii acestuia n gazde bacteriene de tip E.coli i un marEer de rezisten la ampicilin (Amp5.)# Iriginea replicrii A5& (pentru replicare autonom) de la S.cerevisie care permite replicarea vectorului n conformaie liniarizat n droHdii. 3n situs de clonare multipl care permite introducerea genei pasager cu mai multe enzime de restricie De2a-antaCele cl)n%rii 8n acest -ect)r sunt 0n tim(ul cl)n%rii -ect)riii XAC ()t su#eri $ele*ii i s piard o parte din insert sau la nivelul lor pot avea loc recombinri cu alte molecule de A(4 din celula gazd# Vect)rii XAC circulari2a*i se (r)(ag% 8n celule $e /,coli 8n tim( ce -ect)rii liniari se (r)(ag% 8n ga2$a S, cerevisiae!

JB

,n cazul circularizrii, secvenele tel de la cele dou e!tremiti sunt unite# Ca clonarea n bacterii, responsabil de replicarea vectorului este originea replicrii ori, secvena A5& fiind inactiv , n timp ce la clonarea n dro'dii, responsabil cu replicarea este secvena A5& iar secvena ori este inactiv# ,n plus promotorii care determin iniierea transcripiei n +#coli sunt diferii de cei de la S.cerevisiae, nsemn$nd c A54 polimeraza bacterian nu poate transcrie genele L5P% i 35A6 din aceste gene, deci marEerii vor fi funcionali numai n gazde de &#cerevisiae# ,n mod similar A54 polimeraza // este activ numai n gazde de &#cerevisiae i nu va transcrie gena A;P5., specific bacteriei# 9lonarea cu a'utorul vectorului cromozom artificial de dro'die pA9

JA

Pentru clonare n vectorul pA9 se utilizeaz dou enzime de restricie, una care desc"ide vectorul ntre cele dou telomere# ,n acest caz se cloneaz fragmente mici n celule bacteriene de +#coli# ;oleculele mari de A(4 sunt introduse la nivelul situsului de clonare multipl &9;, iar vectorul este desc"is n acest caz cu aceleeai enzim cu care s-a acionat la izolarea insertului# ,n acest caz clonarea se face n dro'dia S. cerevisiae iar selecia se face pe medii cu aminoacizii 35A i L5P# Met)$e $e sec-en*iere a ADN METODA MA@AM ?I GILBERT "1DBB& se bazeaz pe degradarea c"imic a catenelor de A(4# Pentru prima dat, cu aceast metod a fost descifrat secvena operonului lac de la E. coli (;a!am i Gilbert, %ANN> %AB=)# Lot cu a'utorul acestei metode s-au detectat apoi rapid secvenele nucleotidice ale genomului virusului &* <= i ale plasmidei p856)), metoda devenind o rutin astfel nc$t astzi se cunoate secvena a numeroase fragmente de A(4# Eta(e $e lucru /zolarea unei gene sau a unui fragment de A(4 la care se dorete stabilirea secvenei, cu a'utorul enzimelor de restricie> Lratarea fragmentului cu fosfataza alcalin pentru eliminarea radicalului F^ : fosfat> ;arcarea cu 6)P a unui capt cu a'utorul enzimei polinucleotid- Einaza> Populaia de catene este mprit n patru tuburi de reacie# ,n fiecare tub e!ist un reactiv care ndeprteaz (cliveaz) selectiv i parial o anumit baz: tu7ul 1 4 reacti-ul 8n$e(%rtea2% G tu7ul ' 4 reacti-ul 8n$e(%rtea2% AYG tu7ul , 4 reacti-ul 8n$e(%rtea2% TYC tu7ul . 4 reacti-ul 8n$e(%rtea2% C +e(ararea catenel)r /i alegerea unei ()(ula*ii $e catene i$entice, marcate la un ca(%t cu ,'P, (rin tratament alcalinZ Migrarea #ragmentel)r re2ultate 8ntr4un gel $e ()liacrilami$% (entru se(arare (e 7a2a greut%*ii m)leculareZ Aut)ra$i)gra#ia gelului /i citirea sec-en*ei #ragmentului su(us sec-en*ierii $e sus 8n C)s! ;etoda de secveniere ;a!am Gilbert (adaptat dup eatson i colab#, %AA)) METODA DIDEO@I +AU METODA TERMINATORILOR DE LANT "+anger& Primul genom la care s-a determinat succesiune n nucleotide prin aceast metod este cel al bacteriofagului q Q%N< format din A(4 monocatenar circular ce cuprinde %= gene i F6BJ nucleotide (&anger, 7# i colab#, %ANN)# Principiul metodei se bazeaz pe ntreruperea controlat a replicrii enzimatice a A(4#

N=

Amplificarea prin P95 a A(4 monocatenar sau pe o molecul vectoare sunt metode dezvoltate pentru reacia &anger care utilizeaz dideo!inucleotidele pentru ntreruperea controlat a sintezei A(4# 5eacia de secveniere are la baz replicarea in vitro a A(4 monocatenar produs prin P95 sau n vectorul fagic ;%6 (cu a'utorul unui primer universal), patru deo!inucleotidtrifosfai: d4LP (dALP, dGLP, d9LP i dLLP) i r din analogii d4LP-urilor : dideo!inucleotidtrifosfai sau dd4LP (ddALP, ddGLP, dd9LP i ddLLP) (&anger, 7#, %AB=)#

N%

+ec-en*ierea aut)mat% a ADN Principiul secvenierii automate : secvenierea automat a A(4 : presupune ncrcarea deodat n gel a sevenei supuse descifrrii n prezena a patru

N)

dideo!inucleotide marcate fruorescent diferit i a celor <d4LP i, electroforeza capilar a fragmentelor amplificate Pentru identificarea celor patru baze azotate diferite se utilizeaz patru colorani fluoresceni, c$te unul pentru fiecare n parte# Prin marcarea fluorescent a dideo!inucleotidelor, fiecare tip de baz va fi marcat cu o alt culoare (adenina n verde, timina n rou, guanina n negru i citozina n albastru)# (eci, fiecare fragment prezint o nucleotid terminal, o dd4LP marcat fluorescent, a crei baz azotat (A, L, G, 9) este indicat de tipul colorantului# ,n timpul desfurrii electroforezei un fascicul laser este poziionat pe gel# 7asciculul laser msoar fluorescena caracteristic fiecrrei nucleotide i transform$nd matricea coloranilor fluoresceni n secvena de nucleotide a genei studiate# Eta(ele sec-en*ierii: /zolarea A(4 genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce urmeaz s fie clonat sau secveniat> Purificarea A(4 izolat> Amplificarea prin P95 a fragmentului de analizat cu a'utorul primerilor specifici sau a primerilor universali, n prezena celor patru d4LP i a < dd4LP marcai florescent, fiecare cu alt culoare - (adenina n verde, timina n rou, guanina n negru i citozina n albastru)# 5eacia de polimerizare este realizat de polimeraza secvenaza> +lectroforeza capilar : aparatul este prevzut cu un sistem de capilare foarte fine n care este ncrcat gelul de poliacrilamid i n care migreaz produii P95 supui secvenierii# *izualizarea produilor de amplificare se face sub forma unei electroforegrame (ca succesiune n nucleotide) realizat de aparat PIRO+ECVENTIEREA : 4e!tGen &eMuencers Pirosecveierea este o metod de secveniere care este iniiat n aceeai manier ca i metoda dideo!i (&anger) , cu o singur caten de A(4 i cu un primer de secveniere, n aparatul numit pirosecveniator# Acest aparat detecteaz n reacia P95 nucleotidele ncorporate de ctre A(4 polimeraz n lanulul n cretere fr prezena dideo!inucleotidelor n mediul de reacie# (enumirea de pirosecveniere vinde de la gruparea pirofosfat (format din dou molecule fosfat, legate covalent) care sunt eliberate n momentul n care un anumit d4LP este adugat de ctre A(4 polimeraz# A(4-ul monocatenar (matri) este ncrcat pe bile microscopice ce sunt amplasate n godeurile de la pirosecveniator# ,n godeuri este introdus amestecul P95 format din primer, A(4 polimeraza i alte trei enzime# Precursorii d4LPs nu sunt prezeni de la nceput n reacie, acetia sunt adugai secvenial ca mai apoi, n urma cuplrii unui d4LP pe baz de complementaritate, pirofosfaii eliberai s poat fi ndeprtai iar aparatul s nregistreze nucleotida care a fost ncorporat n lan#

N6

Acest ciclu de adugare i ndepratre de d4LP se repet, n fiecare godeu nregistr$ndu-se o singur reacie de secveniere a c$te unui fragment A(4# Astfel n aparat se desfoar n paralel mii de reacii de secveniere simultan# 5eacia ncepe cu d9LP 0dezo!icitozintrifosfat, ca singur nucelotid adugat n reacie# (ac prima nucleotid din lan este guanina, d9LP se va cupla la captul 6^ al primerului cu a'utorul A(4 polimerazei i se elibereaz molecula pirosfosfat# I alt enzim din amestec utilizeaz acest pirofosfat ntr-o reacie cu producere de ALP iar a 6-a enzim utilizeaz ALP ntr-o reacie cu producere de luminescen# Aceasta este detectat de ctre pirosecveniator care cuantific cantitatea eliberat i o coreleaz cu tipul de nucleotid de la care provine# (ac lumina afost emis c$nd n mediul de reacie a fost prezent d9LP-ul nseamn c nucleotida din secvena supus secvenierii a fost G, #a#m#d# Picurile duble ca dimensiune semnific prezena a dou baze consecutive de acelai fel# CursH

GENOMIC6
Desci#rarea gen)mului uman +tu$ierea unui gen)m Pentru descifrarea unui genom este necesar sec-en*ierea /i cartarea acestuia precum i a$n)tarea secvenelor din genom# &ecvenierea genoamelor: Mici : relativ simpl Mari- comple! i lung ;etode de secveniere: -,n anii %ANN - disponibile dou metodologii : ;a!am0Gilbert (clivare c"imic) i &anger (dideo!i)# ,n %ABJ primele aparate automatizate pentru secveniere i electroforez capilar (Applied 8ios?stems) +ec-en*iat)arele Next-en - ,n anii )==B : apar primele aparte : Ne1t Generati)n +eWuencers cu capacitate foarte mare de procesare a A(4 : PI&/8/Cs &+9*+4h/+5+A 343/ G+4I; ,4L5-I i/ <F< 7CQ P?roseMuencer (Cife &ciences, 5oc"e), /llumina from &ole!a Genome Anal?ser Applied 8ios?stem &ICi( L; &?stem Kelicos Kel?scopeL; Pacific 8iosicences &;5L ETAPE 0N DE+CI5RAREA GENOMULUI /# 9artarea i secvenierea // Asamblarea i adnotarea secvenelor genomice Eta(e I! Cartarea /i sec-en*ierea

N<

5ragmentarea ADN gen)mic 8n #ragmente cu ca(ete su(ra(use met)$a s9)tgun a) ;ecanic b) +nzimatic : digestia total- nefuncional : Digestia (ar*ial% : potrivit "'& Cl)narea m)lecular% a ADN (rin te9n)l)gia ADN rec)m7inat /i c)nstruirea li7rariil)r gen)mice "' li7rarii ADN& ()) - enzimele de restricie - *ectorii : plasmidiali> - - "ibrizi: fagemide i cosmide Artificiali (8A9 i pA9) A(4 recombinat introdus n celule gazd Li7r%rie gen)mic% 9u dimensiunea prestabilit ",& +ec-en*ierea 4 $esci#rarea sec-en*el)r (rin met)$a Shot$un 0i chromosome 1al2in$ A) 9livarea c"imic ;a!Gilb 8) (ideo!i sau &anger () secvenierea automat bazat pe principiul dideo!i sau &anger Secven'ierea aralel a ntre$ului $enom 9) Pirosecvenierea (4e!t Generation seMuencers) 1! Met)$a s9)tgun Pentru cartarea genomului uman s-a utilizat metoda s"otgun care presupune: - fracionarea genomului n fragmente cu capete suprapuse care sunt secveniate i asamblate sub forma unei secvene continue# ,n acest scop genomul este mai nt$i fracionat i fragmentele sunt stocate n librrii genomice care conin ntregul genom 7ragmentele din librrii sunt apoi secveniate i asamblate ca secvene continue (contig i supercontig( 3rmeaz adnotarea genomului prin poziionarea tuturor secvenelor n cromozomi (secvenele unice c$t i cele repetate, regiunile cu rol de regla' a genelor, a marEerilor i variaiile sau polimorfismele din genom etc) Chromosome 1al2in$ 7ragmentele A(4 din librrii sunt descifrate pas cu pas: &e secveniaz primul fragment (de restricie) ncep$nd cu un capt (primeri din secvene linEeri) Pe baza secvenei primului fragment se construiesc primeri ptr amplificarea fragmentului urmtor (cu te"nica %nchored *$9) i procesul continu din aproape n aproape p$n la descifrarea ntregului fragment (cromozom) Eta(a '! Asam7larea /i a$n)tarea sec-en*el)r gen)mice A# Asamblarea - 8n met)$a s9)tgun secvenele scurte sunt descifrate la capete# sunt suprapuse i sunt asam late n secvene continue (c)ntig) iar cele lungi n aceeai manier

NF

prin suprapunere peste primele secvene rezultAnd secvene nvecinate lungi sau su erconti$-uri# Asamblarea fragmentelor se realizeaz computerizat utiliz$nd algoritmi complecsi B A$n)tarea gen)mului - (up prima asamblare se face sc"eletul "rii i se poziioneaz mar<erii +T+ "si R5LP& - (up a doua asamblare a secvenelor acestea se suprapun peste sc"eletul "rii rezult$nd "arta complet ns n care rm$n uneori mici goluri nedescifrate - A$n)tarea sec-en*el)r 8n gen)m se #ace 8n eta(e %# mai nt$i sunt poziionate genele structurale A) - n acest scop se realizeaz o nou librrie de A(4c care va fi secveniat i rezultatul secvenelor descifrate se suprapune peste "arta A(4# 8) se scaneaz "arta A(4 cu a'utorul unor soft@are pentru poziionarea regiunilor I57 (Ipen 5eading 7rame) : regiunile de regla' a genelor structurale )) poziionarea secvenelor repetate ;ai dificil deoarece multe secvene repetate (care aparin unor familii) au similitudine ridicat i secvenele sunt mult mai lungi dec$t genele structurale poziionarea secvenelor repetate mediu i nalt presupune : a) amplificarea P95 cu a'utorul primerilor construii din regiunile &L&, clonare, secveniere b) te"nici de "ibridare in situ P)2i*i)narea alt)r mar<eri 8n gen)m - "1& +NP : urile (&ingle 4ucleotide Pol?morp"isms) cele mai numeroase 0 n medie la fiecare 6==-%===pb (cca %)! %=A n genomul uman) - ()) : alc%tuirea 9%r*il)r +NP : cele mai saturate "ri n polimorfisme - (6) : alc%tuirea 9%r*il)r 9a(l)ti(uril)r : se caut% +NP4urile 8n s oturi reci de recombinare (&4P-uri care alctuiesc blocuri "aplotip ntre care nu are loc recombinarea genetic) : cca F==#=== n genomul uman : bazele pentru alctuirea c"ip-urilor microaray 5inali2area Acoperirea golurilor din genom poart numele de finalizare# ultimul obiectiv al finalizrii este descoperirea erorilor, astfel nc$t la fiecare %=#=== pb s e!iste cel mult o eroare# 9aracteri2area sec-en*el)r structurale Denomica funcional se ocup cu studierea funciilor genelor i a celorlalte secvene din genom Genomica comparativa : studiaz similitudinile i diferenele e!istente ntre genomuri ntregi sau doar ntre anumite pri din genomul unei specii i ne a'ut s detectm comuniti de microorganisme (metagenomica) sau virusuri n probe 1! Cartarea /i sec-en*ierea (rin met)$a s9)tgun -7ragmentarea genomului i recuperarea fragmentelor mici de A(4 (%F-%F= Eb)

NJ

9lonarea i alctuirea librriilor genomice (librrie mic) &ecvenierea capetelor fragmentelor i asambalarea lor n secvene continue cu capete suprapuse (contig( Poziionarea marEerilor &L& n "art Psc"eletul "rii CON+TRUIREA LIBR6RIILOR GENOMICE Li7r%ria gen)mic% este ) c)lec*ie $e cl)ne, care c)n*ine cel (u*in ) c)(ie a #iec%rui #ragment $e ADN $intr4un gen)m! Crearea unei librrii func'ionale" - conine toate fragmentele de A(4 din genom reprezentate cel puin o dat n librrie - 7ragmentele pot fi asamblate ca secvene continue (fiecare fragment din librrie este suprapus parial peste vecinul su a# s poat fi refcut secventa continu)# Aceasta se realizeaz prin digestie enzimatica partiala Restrictia en2imatic% t)tala si (artiala Ca restrictie se tine cont de mrimea fragmentelor rezultate a# # acestea sa poata fi clonate in vectori adecvati Aceasta presupune: - digestia cu enzime care taie des pentru obinerea de fragmente de dimensiuni reduse i construirea unei li rarii ImiciY -digestia cu enzime care taie rar si construirea unei librarii \mariY E1em(lu $e restric*ie si cl)nare A(4 genomic este restrictat cu enzima SauJA/ care are situsul de recunoatere: F : GAL9 -6 6 - 9LAG : F 9apetele obinute sunt complementare cu cele produse de enzima de restricie -am&% utilizat la desc"iderea vectorului, care are situsul de recunoatere, : F : GGAL99-6 6 - 99LAGG : F (igestia cu &au///A%

NN

&ecvenele GAL9 de la enzima &au6A/ se suprapun cu secvena GAL9 produs de enzima 8amK%# 7ragmentele suprapuse obinute prin digestie cu enzima &au6A/ trebuie selectate dup mrime ()=-%F= Eb) pentru a putea fi introduse n vectori# 9ele de dimensiuni prea mici sau prea mari sunt eliminate 9onsider$nd o populaie de fragmente de A(4 obinute prin digestie parial, selecia acestora se face n urma migrrii lor n gel de agaroz, n care se mai migreaz i un martor nedigerat,un marEer de greutate molecular, de obicei genomul fagului lambda digerat cu enzima &ind555# care produce fragmente de )6,% Eb> A,< Eb> J,J Eb> <,< Eb> ),6 E8, ) Eb i =,F Eb# Met)$a $e calcul a num%rului $e c)l)nii necesar (entru alc%tuirea unei li7r%rii 9onsiderm o prob de A(4 ce conine fragmente de o asemenea mrime nc$t fiecare fragment reprezint o fracie XfY din A(4 genomic# Probabilitatea (P) ca o secven s fie prezent ntr-o colecie de X4Y colonii este: P [ 1 : "1 : #&N , $e un$e N [ ln "1 : P& ; ln "1 : #& Presupunem c dorim ca fiecare secven s fie n bibliotec cu o probabilitate de AAU, de unde P - =,AA# (ac A(4 donor este A(4 "aploid, provenit din dro'dii (a cror mas molecular este de %=%=) i media masei moleculare a fragmentelor este de Bc ! %=J, atunci:
f = B %=J = =,===B %=%=

'=

[ ln(% =,AA) ] = FNF< [ ln(% =,===B) ]

NB

5nterpretare: Astfel, dac biblioteca conine apro!imativ FB== colonii, probabilitatea ca orice gen de la dro'dii s fie prezent n cel puin o copie n librrie este de AAU# +!emple (e c$te clone avem nevoie pentru a constitui o librrie genomic din A(4 provenit de la o specie de maimu (J ! %=A pb0celul), dac fragmentele de A(4 utilizate sunt n medie de ) ! %=< pb i dac dorim ca AAU din genele provenite de la maimu s fie n bibliotecO 9ezolvare: Pentru a micora cantitatea de A(4, se lucreaz cu A(4 "aploid provenit din celule se!uale, la care numrul de pb este redus la 'umtate: J ! %=A 0 ) - 6 ! %=A#
) "%= < f = = J,JN "%= J A 6 "%=

'=

[ln(% J,JN "%= )]


J

[ ln(% =,AA) ]

= J,A%"%= J

$ac% 7i7li)teca c)n*ine a(r)1imati- F!D'1!EEE c)l)nii, (r)7a7ilitatea ca )rice gen% $e la maimu*% s% #ie (re2ent% 8n cel (u*in ) c)l)nie este $e DDU! Pentru prima librrie sunt clonate doar fragmentele scurte ()=-%F= Eb)

+ec-en*ierea ADN
&unt recuperate din librrii fragmentele scurte si sunt secventiate la capete (F==%=== pb) 3rmeaz alinierea i asam7larea lor n secvene continue continue cu capete suprapuse (contig) cu a'utorul unui soft@are (unul dintre ele fiind Short =ligonucleotide %nalysis *ac!age( Asam7larea #ragmentel)r su(ra(use 8n sec-en*% c)ntinu% \conti$ ,n interiorul secvenelor contig se regasesc fragmente nedescifrate de A(4 (gaps) ns prin suprapunere se reconstitue o secven original a crei lungime este cunoscut# Alc%tuirea sc9eletului 9%r*ii 7ragmentele scurte, descifrate la capete sunt poziionate n "arta primar realiz$ndu-se astfel sc9eletul 9%r*ii! 9apetele secvenelor caracterizate (secveniate) se numesc &L& (&eMuence Lagget &ites) si constituie (rimii mar<eri ai 9%r*ii! Pe baza acestei "ri sunt recuperate din genom secvene mai lungi care s acopere tot cromozomul i care se suprapun peste secvenele din sc"elet Cl)narea #ragmentel)r lungi $e ADN /n urma digestiei cu a doua enzim (care taie rar) rezult unele fragmente lungi de A(4 Acestea sunt clonate n vectorii 8A9 (PA9) i se construiete a doua librrie A(4

NA

&trategia asamblrii acestor secvene se numete ierarhic pentru ca pornete de la secvene mai lungi de A(4 care conin n interior secvenele contig din librria anterioar# A $)ua li7r%rie va fi realizat din fragmente mai mari de A(4, cuprinse ntre F=-)== Eb, deasemenea suprapuse ca urmare a digestiei pariale, i care vor fi clonate n vectori 8A9 Scopul construirii li rriei -%$ este acela de a clona i fragmente cu secvene repetitive. 3nlele secvene repetitive au lungimea mai mare i nu se regsesc n librria construit anterior, dec$t parial# &ecvenierea i asamblare se face n maniera similar cu prima librarie rezult$nd fragmente lungi asamblate continuu (supercontiguri) care conin n interior subfragmentele din librria anterioar Pentru asamblare se folosesc soft@are care utilizeaz algoritmi mai compleci (care caut at$t suprapunerile dintre fragmente i subfragmente c$t i secvenele &L& din sc"eletul "rii anterioare)# 3rmeaz saturarea avansat a "rii cu secvene mai lungi i ali marEeri &L&# ,n "art rm$n nc poriuni nedescifrate (gaps) Ac)(erirea gen)mului Prin acoperire se nelege numrul mediu de \citiriY efectuate asupra unei secvene nucleotidice $u cAt gradul de acoperire a genomului este mai ridicat, prin clonele coninute n librrie, cu at$t acurateea rezultatelor este mai mare iar certitudinea poziionrii secvenelor n genom este sporit (e e!emplu pentru o acoperire de N ori a unui genom de %== ;b, sunt clonate i secveniate secvene de N== ;b# 5INALIGAREA +ECVENTELOR GENOMICE Acoperirea golurilor din genom poart numele de finalizare# 9a ultim obiectiv al finalizrii este i descoperirea erorilor astfel nc$t la fiecare %=#=== pb s e!iste cel mult o eroare# 9elera Genomics : a lansat cea mai avansat aplicaie pentru completarea proiectului genomului uman utiliz$nd metodologia s"otgun &copul - Acoperirea de F ! a genomului (adica fiecare nucleotid dintr-un fragment s fie secveniat de F ori)# Ca finalul proiectului genomului uman acesta era saturat n proporie de ANU ns mai e!istau regiuni neidentificate Golurile din genom- cauze : Asamblarea regiunilor bogate n secvene repetitive este un proces foarte dificil datorit similitudinii foarte mari dintre secvene care aparin aceleiai familii ,n timpul clonrii n gazde bacteriene, aceste secvene se pot recombina sau pot aprea deleii n interiorul lor# 6U din genomul uman a rmas nedescifrat B=

ADNOTAREA VARIATIILOR 0N +ECVENTELE GENOMULUI 3rmtorul pas dup realizarea secvenei complete a unui genom o reprezint procesul de adnotare, adic de identificare, descriere i descifrare a funciilor genelor i a altor secvene importante din genom# Adnotarea ncepe cu pozitionarea genelor structurale ale unui genom# Pentru poziionarea genelor structurale-secvene codificatoare e!ist dou abordri: - sunt ntocmite librriile de A(4c# - secvenele structurale sunt poziionate computaional prin scanarea regiunilor Ipen 5eading 7rame (I57)

I IDENTI5ICAREA +ECVENTELOR UNICE DIN GENOM "GENE +TRUCTURALE&4 li7r%riile $e ADNc genele structurale codific un produs proteic: proteine, enzime sau "ormoni# (in acest motiv i$enti#icarea genel)r structurale $in gen)m are la 7a2% c)nstruirea li7r%riil)r $e ADNc "c)m(lementar&, copii ale speciilorde A54m mesager din celul# A54m are transcris informaia dintr-o gen (care se e!prim), i care este mai apoi tradus ntr-o protein la nivelul ribozomilor# ,n celule unele gene sunt transcrise frecvent, altele sunt transcrise mai rar# ,n general, ntr-o celul este transcris la un moment dat doar o mic parte din informaia genetic, e!ist$nd diferene mari de transcriere ntre diferite tipuri de celule# A54m este destul de instabil, iar clonarea i secvenierea nu este posibil# Aceste nea'unsuri pot fi evitate dac se lucreaz cu li7r%rii $e ADNc# Cibrriile de A(4c sunt colecii de clone A(4 obinute prin reverstranscriere de pe molecule funcionale de A54m# &inteza A(4c : se realizeaz cu a'utorul enzimei reverstranscriptaza de pe o matrice de A54m# Acest A54m matur la eucariote are ndeprtai intronii n procesul de prelucrare, prin urmare librriile de A(4c sunt de dimensiune mai mic dec$t clonele rezultate din fragmentarea A(4-ului total ,n prima etap se obine copia A(4c, complementar unui A54m dup care A(4 polimeraza sintetizeaz cea de-a doua caten de A(4 &ecvena complementar A(4c difer de secvena original de A(4 de pe care s-a copiat informaia prin aceea c n locul L n A54m este transcris nucleotida 3# ,n cazul procariotelor nu se ntocmesc astfel de librrii deoarece genele de la procariote au structur continu, fiind formate doar din e!oni, prin urmare clonele de A(4c nu ar fi mai reduse n dimensiune dec$t cele de A(4# Recu(erarea ARNm $in ARN t)tal e1tras B%

,n procedeul de e!tracie a A54, nu poate fi e!tras doar A54m ci A54 total din celul# A54m mesager de la eucariote este singura molecul de A54 prevzut cu cozi poli (A) spre deosebire de alte molecule de A54 (A54r, A54t)# Prin trecerea tuturor speciilor moleculare de A54 pe o coloan (de sep"ade!) prevzut cu fragmente nucleotidice formate doar din timin (cozi poliL) acestea se vor "ibrida la cozile poliA din A54m i astfel moleculele de A54m vor fi imobilizate pe coloan, recuperate i selectate de celelealte specii de A54 rezultate la e!tracie# Re-erstranscri(*ia ;oleculele de A54m imobilizate pe coloane sunt eluate i convertite n copii de A(4c cu a'utorul unui primer poli(L) i n prezena reverstranscriptazei# A54m este ulterior degradat din duple!ul A54m-A(4c cu 54-aza K rezult$nd catena de A(4c, ce conine informaia genetic complementar A54m# Acest A(4c devine n continuare matri pentru sinteza celei de-a doua catene de A(4 cu a'utorul A(4 polimerazei /, care va ndeprta i primerul A54 9onstruirea librriilor de A(4c - +&L (+!pressed &eMuences Lag) : ncepe cu selectarea moleculelor complete de A(4 i continu cu clonarea acestora n vectori ce vor fi propagai apoi n gazde bacteriene# ,n reverstranscripie apar i molecule incomplet sintetizate, datorit activitii defectuoase a reverstranscriptazei care nu copiaz integral informaie genetic din A54m# (up migrarea n gel de agaroz a moleculelor de A(4 doar fragmentele cu dimensiuni mai mari de % Eb sunt recuperate din gel i clonate# M)$alit%*i $e cl)nare a ADNc 9lonarea moleculelor de A(4c cu a'utorul linEerilor sau a adaptorilor ;oleculele de A(4c sunt mult mai scurte dec$t cele din A(4 genomic, datorit eliminrii intronilor# Aceste molecule, care n general au dimensiuni mici, de %- F Eb, sunt clonate ntregi, fr a se aciona asupra lor cu enzime de restricie pentru obinerea de capete adezive# ,n acest caz, la capetele moleculelor se adaug linEeri (%) cu a'utorul A(4 ligazei care au n structura lor situsul unei enzime de restricie, asupra cruia se acioneaz cu +5 pentru obinerea de capete adezive ce se potrivesc cu capetele vectorului prin complementaritate# K@in!erii sunt fragmente scurte de %D' du lu catenare (< 0 :1p (# sintetizate in vitro# n a cror structur se regsete situsul de restricie al unei enzimeL. Prin ligarea linEerilor la capetele fragmentelor de A(4 rezult concatemeri formai din tandemul: linEer . fragment A(4 . linEer P linEer . fragment . linEerP etc#, n etapa urmtoare aceste molecule pot fi atacate de ctre enzime de restricie ce formeaz capete adezive i astfel fragmentele de A(4 rezultate vor putea fi unite cu eficien sporit#

B)

M)$alitatea $e )7*inere a ca(etel)r a$e2i-e la m)leculele $e ADN cu aCut)rul lin<eril)r 7igura tttilustreaz clonarea fragmentelor de A(4c cu a'utorul unui linEer ce conine situsul de recunoatere pentru enzima 8amK/# At$t moleculele de A(4c c$t i linEerii au capete boante care pot fi unite cu eficien ridicat cu a'utorul enzimei ligaza L<# ,n etapa urmtoare se acioneaz asupra acestor molecule cu enzima 8amK/ care va produce capete adezive # /nsertul rezultat poate fi clonat n vector care a fost desc"is cu aceeai enzim de restricie : 8amK% (7ig#tt)#

Pr)7leme ()si7ile 8n ca2ul utili2%rii lin<eril)r n timpul utilizrii linEerilor i a formrii de capete adezive cu enzime de restricie este posibil ca fragmentul clonat (gena) s prezinte n interior un situs pentru aceai enzim de restricie, caz n care gena poate fi fragmentat# Problema poate fi rezolvat prin adugare a :01 nucleotide metilate la capetele moleculei# n locul analogilor lor# ,n acest caz, linEerul nemetilat va prote'a fragmentul clonat de aciunea enzimei n timp ce enzima va aciona doar asupra linEerului#

"'&Cl)narea ADNc cu aCut)rul a$a(t)ril)r


Adaptorii sunt asemntori linEerilor, cu deosebirea c un capt este bont, iar cellalt adeziv#

B6

Cigarea adaptorilor la A(4 total, digerat cu aceeai enzim de restricie, nu necesit etapa restriciei ulterioare deoarece adaptorii se vor fi!a i liga prin captul adeziv, direct la fragmentul de A(4# 3n adaptor conine la un capt al moleculei o structura nucleotidic adeziv, prin urmare A(4c nu trebuie clivat cu enzime de restricie pentru a obine capete adezive# (e e!emplu, dac utilizm adaptorul ce are structura: J : GATCCAGAC : , , : GTCTG : J i l unim cu molecula de A(4c, prin captul su bont, n final molecula de A(4c d#c# va prezenta un capt adeziv# ,n acelai mod se procedeaz i cu cellalt capt al moleculei de A(4c astfel nc$t, ambele e!tremiti vor fi complementare cu capetele vectorului desc"is cu enzima 8amK/# (ei clonele A(4c nu conin informaia intronilor dintr-o gen, aceste librrii au scopul de furniza informaii cu privire la #unc*ia genel)r, spre deosebire de clonele A(4 care ne ofer informaii mai cuprinztoare cu privire la structura genei# I singur librrie de A(4c nu este suficient pentru a identifica toate genele structurale dintr-un genom, deoarece esuturile din care a fost izolat A54m nu conin n acelai timp toate genele e!primate# (in acest motiv se c)nstruiesc mai multe li7r%rii $e ADNc, $in $i#erite ti(uri $e celule 7ragmentele din librria de A(4c sunt secveniate direct i apoi sunt poziionate n "arta A(4# Aceste secvene se numesc +&L (+!pressed &eMuences Lag) '!IDENTI5ICAREA GENELOR IN +ECVENTELE GENOMICE PRIN ANALIGA COMPUTATIONAL6 (in punct de vedere procedural, adnotarea secvenelor unui genom implic analiza computaional care cuprinde algoritmii de identificare a genelor structurale sau a secvenelor care codific o protein# &ecvenele codificatoare sunt cutate ntr-un genom prin regiunile l)r OR5 (=pen 9eading 6rame( care cuprind c)$)nul +TART (A3G) separat de mai multe nucleotide sau codoni i unul din c)$)nii +TOP "UAA, UAG sau UGA&! Aceste regiuni I57 se gsesc mai ales n regiunile genomice bogate n G, 9 (eucromatice) i mai puin n regiunile bogate n A,L ("eterocromatice), caracteristice regiunilor de A(4 repetitiv# Procesul este mai dificil la eucariote dec$t la procariote deoarece genele procariotelor sunt lipsite de introni# Prezena intronilor n cadrul unei regiuni codificatoare dintr-o gen de la eucariote necesit algoritmi mult mai sofisticai pentru a putea fi identificat# este utilizat de e!emplu un algoritm pentru identificarea 'onciunilor dintre e!oni, reprezentate de introni i alt algoritm pentru identificarea e!onilor n cadrul A(4#

B<

(e e!emplu o gen conine trei e!oni i doi introni i codific o polipeptid de %=) aminoacizi# Presupunem c primul fragment conine regiunea netranscris (de regla'), urmat de codonul &LA5L, i de ali %F codoni, al doilea e!on conine informaia de la codonul %J p$n la codonul AF (fr regiuni netranscrise), iar e!onul 6 conine codonii AF - %=), urmat de codonul &LIP i regiunea netranscris 6 (3L5)# 3n singur algoritm nu poate detecta aceast gen n genom deoarece distana dintre regiunea de regla' i codonul &tart este mic iar prezena unui codon &top n primul e!on adiacent intronului / poate induce n eroare cum c n acest punct se termin gena# Al doilea e!on va conine i el un codon &LA5L i unul &LIP, un alt impediment al descifrrii corecte a unei gene c$nd se utilizeaz algoritmi simpli# Algoritmii compleci sunt concepui astfel nc$t s citeasc informaia genetic pe distane lungi i s ignore codonii &LIP, nceap$nd scanarea e!onului urmtor, etc# ,n funcie de genomul speciei analizate programul are setai c$iva parametri cu privire la lungimea regiunilor I57# (e e!emplu, la dro'dii se iau n considerare doar regiunile I57 cu lungime minim de %== codoni# ;a'oritatea genelor ce codific proteine au reginuea OR5 $e $imensiuni mai mari $e 1EE c)$)ni, ns nu toate# 3n astfel de e!emplu este gena P;P% ce codific lipoproteinele membranei plasmatice care au lungimea de doar <= aminoacizi# &e estimeaz c din totatlul de JJ=N regiuni I57 detectate n genomul de dro'die, apro!imativ J-NU nu corespund genelor structurale, ceea ce nseamn c la dro'dii e!ist apro!imativ FN== regiuni I57 ce corespund genelor structurale# ,n genomica comparativ studierea regiunilor I57 a dus la concluzia c multe din regiunile I57 de la o specie corespund aceleiai gene, respectiv aceleiai proteine#Prin analiza comparativ a regiunilor I57 din genomul uman s-a descoperit c circa %=== de gene nu se regsesc n genomurile altor specii studiate# 3lterior prin reanalizarea regiunilor I57 de la aceste gene s-a a'uns la concluzia c probabil, acestea nu corespund unor gene structurale adevrate# +!plicaia a fost gsit ulterior dup descoperirea speciilor mici de A54 - aceste gene corespund speciilor microA54 care au o stabilitate sczut n timpul transcrierii i nu pot fi identificate prin scanarea regiunilor I57, deoarece sunt lipsite de regiunea I57 (ele nu codific proteine) (eci n librriile A(4c nu regsim aceste gene deoarece acestor transcripturi le lipsesc cozile poli(A) i nu r m$n imobilizate pe coloane# +aturararea 8n mar<eri a 9%r*il)r 3rmtorul pas dup realizarea secvenei complete a unui genom o reprezint procesul de adnotare a variaiilor sau polimorfismelor din genom sau saturarea "rii cu ali marEeri (&4P) Aceasta servete la nelegerea variaiilor genetice ntre indivizi i a rolului acestor polimorfisme de la nivel A(4# 9utarea variaiilor la nivelul ntregului genom, ntre toi indivizii unei specii, este comple! i costisitoare# (in acest motiv, variaiile sunt cutate pe regiuni mici din genom# +NP : urile /i 9a(l)ti(urile :9tt( ;;AAA!nc7i!nlm!ni9!g)-;sn( BF

9ele mai detaliate "ri fizice sunt "rile &4P (&ingle 4ucleotide Pol?morp"ism) care conin toate variaiile determinate de substituia unei singure nucleotide cu alta# Acest tip de polimorfism este cel mai frecvent nt$lnit, fiind determinat fie de ageni mutageni c"imici, fie de greelile A(4 polimerazei din timpul replicrii A(4# Pot fi evideniate astfel de diferenele de secven e!istente ntre alele, cum ar fi de e!emplu substituia A n L n 9-G (AAGG9LAA n AGGG9LAA)# Pentru ca o variaie de secven s fie considerat &4P, ea trebuie s apar cu o frecven de p$n la %U, ceea ce n populaia uman nseamn apariia mutaiei la fiecare %== -6== perec"i de baze din totalul de 6 miliarde# ,n genomul uman e!ist apro!imativ %6 milioane &4P, conform datelor +NP C)ns)rt]um, organizaie ce coordoneaz cercetrile de detectare a &4P# (in totalul de %6 milioane de polimorfisme punctiforme, circa %==#=== sunt polimorfisme de tip 57CP# (ou din trei polimorfisme &4P sunt determinate de nlocuirea citozinei cu timina, ce apare at$t n regiunile codificatoare c$t i n cele necodificatoare# Abundena polimorfismelor de tip &4P a dus la ntocmirea de "ri foarte detaliate care arat localizarea mutaiilor punctiforme de tip &4P pe cromozomii unei specii# 5esursele pentru depistarea &4P :urilor sunt de tip comparativ, fiind realizate n meniul 8CA&L (8asic Cocal Alignment &earc" Lool) de pe 498/# *ariaiile e!istente ntre indivizii unei specii n regiuni mici din genom sunt utilizate la construirea "rilor genetice ale "aplotipurilor# 3n "aplotip este un set specific de alele &4P de la un anumit locus situate foarte apropiate una de alta pe cromozom, astfel nc$t aceste &4P-uri de transmit prin linEage, fr e!istena recombinrii i pot fi urmrite n descenden De#inirea l)cil)r /i alelel)r unui 9a(l)ti( ,n general, toi locii &4P dintr-un "aplotip se regsesc ntr-un singur spot rece de recom inare# (eoarece fiecare regiune rece de recombinare din cromozom cuprinde mai muli loci &4P foarte apropiai pe cromozomi ("aplotip), motenirea acestora se va face prin linEage complet, fr recombinare genetic intracromozomial# Etic9etele sauTag4urile +NP $in gen)m Lransmiterea nlnuit a genelor de la aceti loci &4P ne permite s testm (pentru diagnostic, sau genotipizare) un singur &4P numit etic9et% +NP (S'* tag)# Lermenul +NP tag definete unul sau mai muli loci &4P utilizai ca marEeri genetici pentru testarea ntregului "aplotip# (in totalul celor %6 milioane de &4P-uri descoperite n genomul uman mai mult de JEEEEE sunt considerate etic9ete +NP pe baza crora se pot face predicii i se poate realiza selecia asistat de marEeri n populaiile de animale# Lestarea a 'umtate de milion de &4P-uri ntr-un genom poate fi considerat imposibil din punct de vedere

BJ

te"nic, ns dezvoltarea te"nicii microarra? ne d posibilitatea testrii ntr-o singur analiz A(4 a mii de astfel de &4P-uri# A(lica*ii $e2-)ltate 8n urma $esci#%rii unui gen)m &aturarea genomului n marEeri &4P a dus la dezvoltarea de aplicaii n medicina uman i n ameliorarea speciilor de ferm# Le"nica A(4 microarra? face posibil identificarea ntr-o singur reacie a zeci sau sute de mii de polimorfisme de tip &4P#Acestea sunt utilizate n diferite aplicaii pentru predicii n bolile umane sau pentru calcularea valorii de ameliorare n populaiile de animalele i la plante# (ac se lucreaz cu A(4c n aceeai reacie poate fi detectat transcriptomul unei celule iar dac se lucreaz cu material genetic viral pot fi detectate foarte rapid virusurile# ,n cazul n care se lucreaz cu A(4 provenit din diferite microbiomuri pot fi detectate comuniti de microorganisme (din mediu: ap, sol sau din rumen) TE=NOLOGIA ADN MICROARRAX "DNA ci(sL& Kibridarea acizilor nucleici se bazeaz pe proprietile unei catene de A(4 de a forma molecule dublu catenare sau de a "ibrida una cu cealalt, dac bazele azotate sunt complementare ntre ele# Acest lucru se nt$mpl n cazul n care e!ist complementaritate n proporie mare ntre moleculele de A(4 nemarcate i sonde# Analiza de "ibridare a acizilor nucleici implic utilizarea s)n$el)r marcate $e aci2i nucleici pentru a identifica molecule de A(4 i A54, cu grad nalt de similitudine, dintr-un amestec de molecule de acizi nucleici nemarcai sau acizii nucleici int# ,n te"nologia microarra? sunt utilizate suporturi solide, miniaturale, pe suprafaa crora sunt imobilizate un numr mare de probe A(4 sau A54, fiecare cu alt secven oligonucleotidic i amplasate ntr-o poziie diferit una fa de cealalt# Probele sunt secvene oligonucleotidice sintetizate c"imic sau secvenele scurte de A(4 cum sunt cele de A(4c# Le"nologia A(4 microarra? a fost dezvoltat n scopul realizrii mai multor e!perimente de "ibridare n acelai timp# Le"nica are aplicaii multiple i, datorit automatizrii producerii plcilor utilizate n reacie, ea este astzi disponibil n laboratoarele de biologie molecular din ntreaga lume# *ec"ea te"nic Yarra?Y utiliza ca suport de fi!are a sondelor oligonucleotidice lamele microscopice sau membrane de nitroceluloz# /n te"nologia S'* microarray plcuele conin un numr foarte mare de secvene oligonucleotidice cu un numr foarte mare de marEeri etic"et &4P (F==#=== n cazul genomului uman, F=#=== sau F==#=== la vaca, porc, cal, c$ine, oaie)# u9ipurile &4Pau fost dezvoltate i pentru cartof, mr, roie, porumb, orez i cire#v Prin diri'area probelor ctre sonde, "ibridarea se va produce doar ntre secvenele ntre care e!ist complementaritate n proporie destul de mare *izualizarea secvenelor "ibridate se face n lumina 3*, la scanarea plcilor culorile indic poziiile de "ibridare &canarea tuturor marEerilor &4P din genom este utilizat pentru stabilirea de asocieri i ameliorarea speciilor de ferm i a plantelor de cultur#

BN

Ca om te"nica &4P microarra? este util n predicii privind unele boli genetice i a cancerului> n farmacogenomic etc# A(lica*ii : 1! +elec*ia gen)mic% a ()(ula*iil)r $e taurine %# I parte a populaiei este genotipat la cca F=#=== loci S'*- uri prin te"nica microarra? i sunt nregistrate fenotipurile ( nsuiri ale produciilor, rezistena la boli etc# )# +fectele tuturor &4P sunt estimate n populaia de referin prin modele statistice n care se stabilesc asocieri ntre fenotip i polimorfisme P ecuaii predictive cu privire la valoarea de ameliorare (A) a populaiei de referin 6# 9ealalt parte a populaiei se genotipeaz cu acelai &4P-c"ip iar valoarea genetic total este estimat pe baza ecuaiei predictive ntocmit pentru populaia de referin ()) Micr)arra] (entru (r)gn)sticul 8n cancerului $e s3n ,n analiz sunt utilizate probe de A54m din celule sntoase i canceroase, marcate florescent (9?6 i 9?F) &unt comparate genele care se e!prim activ n tumori cu genele din celulele sntoase# 7iecare spot colorat indic genele care se e!prim i intensitatea de e!presie n stare normal i n cancerul de s$n ( n anumite esuturi) Genele care se e!prim mai puternic n celulele canceroasespot rou Genele care se e!prim la acelai nivel spot galben Genele represate n trancripie spot verde ;ic"ael eigler i 5obert Cucito au dezvoltat o metod de laborator prin care pot fi identificate variaiile n numrul de copii ale unei gene la nivel de genom, denumit 9epresentational oligonucleotide microarray analisys sau ROMA# Prin aceast metod pot fi detectate genele cu numr alterat de copii prezente n celulele canceroase# Dosep" de5isi a dezvoltat o aplicaie a te"nicii (4A microarra? pentru identificarea virusurilor, denumit Vir)c9i(, care utilizeaz apro!imativ )==#=== de probe provenite de la toate virusurile cunoscute (cum sunt "erpes virusurile, po!virusurile etc#)# Planuri /i (r)grame ale Institutului Na*i)nal $e Cercetare Gen)mic% "N=GRI& Planurile i programele centrului n urmtorii ani sunt: creterea acoperirii genomurilor de la N specii de mamifere cu acuratee sporit# Acestea sunt: vaca, c$inele, cimpanzeul, omul, macacul, oarecele i obolanul)# Proiectele sunt demarate de c$iva ani iar genomurile sunt saturate aproape complet la ma'oritatea speciilor incluse n proiect# Alte <= de specii sunt n lucru, n procesul de descifrare a genomului# (intre acestea fac parte: cangurul, pisica, delfinul, elefantul, dou specii de lilieci i iepurele# 4KG5/ are demarate programe de descifrare a genomurilor i la procariote n care sunt incluse multe bacterii patogene (I%FN:KN care produce otrvuri n m$ncare> sau tulpini ale bacteriei E.coli patogene pentru tractul urinar sau care BB

produc septicemii)) i fungi care produc boli la om# Prin compararea secvenelor genomice de la tulpina de laborator +#coli H%) cu cele patogene au fost evideniate regiunile genomice responsabile de afeciunile pe care le produc la om# 9oncluziile trase n urma descifrrii genomului uman : genomurile mamiferelor nu difer foarte mult ca mrime fa de genomul uman> pentru mamiferele la care s-a nc"eiat secvenierea genomului sau aceasta este aproape nc"eiat, ma'oritatea genelor sunt similare cu ale omului> proiectul de secveniere a genelor a artat c AAU din genele de la oarece i obolan (dou animale model) au corespondent la om, incluz$nd aici i gene asociate cu anumite boli genetice Im(lica*iile etice, legale /i s)ciale ale $esci#r%rii gen)mului uman ,nafara avanta'elor reprezentate de secvenierea genomului uman prin care pot fi depistate anumite mutaii cauzatoare de boli, e!ist o serie de implicaii de ordin etic, legal i social, Pe msur ce secvenierea genomului devine din ce n ce mai puin costisitoare i destul de accesibil se pune problema pstrrii confidenialitii acestor informaii# (e e!emplu, dac genomul uneui persoane este secveniat i mutaiile depistate la nivelul unora dintre alele confer riscul dezvoltrii unei maladii genetice, ar trebui ca acea persoan s aib acces la aceste informaiiO Lrebuie informai oamenii c vor dezvolta o maladie pentru care nu e!ist tratamentO Lrebuie s tie compania de asigurri dac avem riscul s dezvoltm anumite boli incurabile sau care necesit costuri ridicate pentru a fi tratateO Anga'atorul trebuie s tie dac anga'aii si au o speran de via mai redus sau dac prezint riscul unor boli care i vor face inapi s muncescO Ar trebui ca familia s cunosc acetse riscuriO Acestea /i multe alte 8ntre7%ri tre7uie re2)l-ate 8naintea intr%rii 8n era gen)micii (ers)nale! Resurse "ttp:00@@@#ncbi#nlm#ni"#gov0sites0entrezOdb-genome L"e Gen)me $ata7ase provides vie@s for a variet? of genomes, complete c"romosomes, seMuence maps @it" contigs, and integrated genetic and p"?sical maps# L"e database is organized in si! ma'or organism groups: Arc"aea, 8acteria, +uEar?otae, *iruses, *iroids, and Plasmids and includes complete c"romosomes, organelles and plasmids as @ell as draft genome assemblies# 9urs %=

Gen)mica #unc*i)nal% /i c)m(arati-%


,ntrebri care se pun n ramurile genomicii: (%) 9um este determinat funcia unei gene din genom prin intermediul datelor de secvenO ()) 9um sunt identificate gene noi pe baza comparrii lor cu cele studiate anteriorO (6) 9um pot fi determinate funciile unei gene nou identificate n condiii e!perimentaleO

BA

(<) 9um sunt organizate genele i alte secvene A(4 la nivelul unui genomO (F) 9um poate e!ista variabilitate ntre transcriptele acelorai gene i proteinele codificate de acestea n diferite tipuri de celule sau n condiii diferiteO (J) 9e aport aduce genomica la studierea terapiei alopate n creterea eficienei medicamentelorO (N) ,n ce fel secvenierea genomurilor poate aduce informaii cu privire la evoluia speciilorO (B) 9um descoperim modificrile ce apar n funciile genelor care produc cancere sau alte boli0infecioase, studiind comparativ diferenele e!istente ntre secvene individuale genomice# (A) 9um putem utiliza datele din genomic n studierea unor comuniti comple!e de microorganisme din probeO Reali2%ri /i (ers(ecti-e Genele sau genotipul fiecrui individ acioneaz diferit de la un individ la alt individ n metabolizarea unui anumit medicament# 5ezultatele genomice obinute p$n n prezent au creat premisa ca n viitorul apropiat, medicii s poat prescrie un medicament pe baza informaiilor genetice# Le"nica %D' microarray va face posibil acest lucru, deoarece permite analizarea unui genom particular, iar pe baza datelor obinute medicul va putea personaliza un tratament pentru cancer, sau alt maladie# Gen)mica #unc*i)nal% se ocup cu studierea funciilor genelor i a celorlalte secvene din genom Gen)mica c)m(arati-% ne a'ut s facem comparaii ntre genomuri ntregi sau doar ntre anumite pri din genomul unei specii, tulpini sau de la un individ, n scopul mbuntirii nelegerii funciilor ntregului genom# Lot aceast ramur ne a'ut s descoperim ce virus sau microorganism este prezent ntr-o prob, fie ea alimentar sau din mediul ncon'urtor# Gen)mica #unc*i)nal% /i c)m(arati-% ;i$enti#icarea #unc*iei genei &pre deosebire de genetica clasic care studiaz funcia unei gene pornind de la fenotip, genomica funcional se bazeaz pe studierea invers a caracterului, pornind de la secvena nucleotidic, i de aceea este denumit i genetica in-ers% (reverse $enetics)# ,n genetica invers se ncearc stabilirea corespondenei ntre un anumit genotip i fenotipul e!primat de acesta# &tudierea funciei unei gene presupune modificarea structurii unei gene prin inducerea unor mutaii, clonarea genei i transferul ei ntr-un organsim model pentru studierea fenotipului produs de gena mutant# Primele cercetri s-au realizat prin analiza computerizat a corespondenei dintre gen i funcie n cadrul tiinei 7i)in#)rmatica 8ioinformatica utilizeaz n asociere, datele din biologie, matematic i informatic# *oate fi utilizat n : gsirea secvenei unei gene ntr-un genom, A=

alinierea secvenelor n bazele de date pentru determinarea gradului de similitudine dintre gene, prezicerea structurii i funciei genelor, descrierea interaciunilor dintre gene i proteine la nivel celular, ntre celule sau ntre organisme i la postularea relaiilor filogenetice pe baza secvenelor A(4# ;ulte din organismele studiate de genetica clasic nu conin stocate n bnci secvenele tulpinilor mutante 9unotinele sunt limitate doar la nivelul secvenelor nucleotidice# 9unoaterea unui proces fiziologic ne ofer informaii prin care putem deduce genele implicate n proces# 9utarea lor poate fi realizat online pornind de la secvena nucleotididic i realiz$nd alinieri cu secvene din bazele de date genomice# Acestea sunt genele candidat# (up adnotarea genelor candidat dintr-un genom, este important s descoperim funcia lor, sau corespondentul proteinei codificate# "1& I$enti#icarea #unc*iei genei (rin anali2a c)m(uteri2at% a similarit%*ii sec-en*el)r gen)mice &tudierea funciei unei gene se face scan$nd regiunile I57 din genom, identificate prin codonii &LA5L i &LIP, regiuni de dimensiuni mai mari, care codific proteine cu mrimea de cel puin %== AA sau mai mult# Ca eucariote aceste regiuni sunt mai dificil de identificat din cauza prezenei intronilor, motiv pentru care la aceste specii se ntocmesc librriile de A(4c# 9utarea unei secvene n bncile de date pentru determinarea similaritii se poate realiza prin accesarea bazelor de date : instrumentul 8CA&L (8asic Cocal Alignment &earc" Lool)> &e poate porni prin introducerea secvenelor I57 a genei, sau prin introducerea secvenei n aminoacizi a genei dac aceasta este cunoscut ,n general cutrile n bazele de date nu produc potriviri perfecte deoarece acestea sunt e!trem de rare ntre specii diferite#,ns poriuni din acestea pot fi similare, caz n care se pot face predicii cu privire la structura genei i a produsului codificat de aceasta +ec-en*ele can$i$at categ)rii Analiza computerizat a secvenelor aliniate va propune potriviri pariale (dac acestea e!ist) i va calcula ansa ca dou secvene luate aleator s fie complementare ntr-o proporie c$t mai mare# 5ezultatul acestor cutri va genera o colecie de secvene numite sec-en*e can$i$at! 7oarte multe din genele identificate n bazele de date (dei nu sunt %==U identice n structur ndeplinesc aceeai funcie, cel puin parial pentru un anumit domeniu (regiune cromozomial care corespunde funciei unei anumite secvene pariale(# de e!emplu la 9#elegans -FJU) +!emple: /dentificarea funciilor genelor la dro'dii

A%

Ca iniierea determinrii funciei genelor la dro'die, 6=U din gene erau cu funcii cunoscute# Pentru nc 6=U s-au obinut potriviri n structur prin alinieri n bazele de date cu alte secvene care aveau funcie cunoscut# (intre acestea %=U nu aveau funcia similar cu a secvenelor cu care s-au comparat# Aceste secvene sunt notate generic cu denumirea 734 (function unEno@n) iar aceste gene i omologii lor poart numele de gene orfan (=rphan gene)# 3n alt procent de 6=U din genele candidat nu au avut nici un corespondent n bazele de date# (in acest procent, J-NU sunt probabil gene fr funcie, fiind gene mici lipsite de regiuni I57, deci care nu se transcriu (specii microA54)# 5estul de gene neidentificate (%=U), probabil gene structurale, sunt notate cu denumirea de sin$le or han, ,n cazul genomului uman apro!imativ %=== de gene sunt considerate F3N, grupate ntr-o singur clas single orphan# "'& I$enti#icarea #unc*iei genei (rin Analiza ex erimental a func'iei $enelor Aceast analiz presupune scoaterea din funcie a genei (numit !noc! out) urmat de analizarea fenotipului rezultat# ,n acest scop studierea se face pe diferite organisme model cum sunt dro'dia, oarecele, $. elegans sau porc# +!ist mai multe metode pentru scoaterea din funcie a unei gene: Mecanisme $e sc)atere $in #unc*ie a genel)r "<n)c<)ut /i <n)c<$)An& 9ele mai utilizate mecanisme ale te"ncii sunt: (%) cunoscute sub denumirea de !noc!out i ()) !no!do4n prin intermediul A54i (A54 de interferen) Genele EnocEout sunt produse prin disrupia genei la nivelul cromozomului# Genele A54i !noc!do4n sau 9'% silencing pot fi obinute prin scoaterea temporar din funcie a e!presiei unei gene# ,n ambele cazuri scopul este ca aceste gene s nu produc proteina codificat de ele# Genele <n)c<)ut la $r)C$ii Acestea pot fi produse utiliz$nd o strategie bazat pe reacia P95# Premisa de la care se pornete este de a obine un vector liniar prin P95, care are omologie ridicat cu gena pe care dorim s o scoatem din funcie, astfel nc$t, la clonarea vectorului recombinat n celule de dro'dii, gena nemutant din cromozomi s fie nlocuit cu vectorul prin recombinare omolog# Procesul de recombinare a cromozomilor omologi este un proces natural care apare n celulele ce se divid prin meioz# ,n acest caz, dorim ca gena de interes i gena modificat (vectorul liniarizat) s se recombine, proces care se produce cu frecven ridicat la dro'dii# ,n acest scop se amplific prin reacia P95 cu a'utorul unor primeri construii pe baza secvenei genei, un construct genic care poart numele de modul A(4 cu deleie (vector int), cu urmtoarea structur:

A)

(%) Poriunea din gena structural cu codonul &LA5L, urmat de ()) un marEer de selecie (gena Ean5) i de cealalt parte (6) captul cellalt al genei structurale, ce se nc"eie cu codonul &LIP# ,n acest fel gena este \ruptY n dou av$nd n interior marEerul de selecie la antibioticul Eanamicin, care nlocuiete cea mai mare parte din regiunea central, codificatoare a genei# Acest marEer confer rezisten la in"ibitorul D;:<. Gena alterat nu va mai putea sintetiza produsul proteic codificat de gena slbatic# Acest construct A(4 n form liniarizat este transferat n celulele de dro'die iar coloniile rezistente la in"ibitorul G<%B sunt selecionate# Plasmidul liniarizat se va integra n cromozomul de dro'die prin recombinare omolog i va scoate din funcie gena de interes deoarece cea mai mare parte din regiunea codificatoare a genei este nlocuit cu gena de rezisten la Eanamicin# ,n termeni genetici, rezultatul obinut prin recombinare duce la obinerea unei alele nule "alel% care nu c)$i#ic% un (r)$us ()li(e(ti$ic&! Alela nul nu va determina sinteza proteinei, iar celula mutant va avea un defect funcional care, dac este vital pentru celul, va produce moartea celular# (ac pe mediile de cultur cresc colonii, vectorul este integrat ntr-o alt regiune a cromozomului prin recombinare neomolog, gena rm$n$nd funcional# Pentru confirmarea deleiei produse de vector, se e!trage A(4-ul i se realizeaz o amplificare P95 pentru a determina dac gena recombinat este prezent n cromozomi# ,n acest caz, se utilizeaz < primeri care vor amplifica regiunile din amonte i aval de gena marEer (A i () i ) primeri pentru gena Eanamicinei (Ean8 i Ean9) care vor amplifica regiunea intern a genei# (ac gena este prezent n cromozomi (fr deleie) n urma reaciei P95 se produc fragmente de aceeai mrime (gena ntrag)# (ac s-a produs deleia, deci gena Han5 este integrat n vector, fragmentele obinute vor avea dimensiuni previzibile, toi cei patru primeri produc$nd amplificarea pe segmente# Loate genele descifrate de la dro'die (JJ==) au fost supuse te"nicii EnocEout, c$teva dintre ele av$nd rol vital n celul care n urma clonrii au determinat moartea celular# 9ele mai multe (<)== din JJ==) au produs fenotipuri via ile, av$nd probabil rol nevital au fost ulterior analizate pentru determinarea funciilor lor# ,n urma deleiilor produse se e!amineaz modificrile ce apar n fenotip: modificri la nivelul ciclului celular, a meiozei, a sintezei de A(4 i A54, n energetica metabolic, n mecanismele de transport molecular etc# +c)aterea $in #unc*ie a genel)r la animale m)$el "/)arece) Goarecele este un organism model utilizat n studiile de genomic datorit omologiei ridicate a genomului cu cel al omului#

A6

Le"nica gene !noc!out aplicat la oarece aduce informaii valoroase pentru studiul genelor umane, at$t n ceea ce privete structura c$t i n funcia Pr)$ucerea /)arecil)r <n)c<)ut Procedeul este similar cu cel de la dro'dii: Gena int este ntrerupt de gena marEer neo5 ce confer rezistena celulelor de oarece la antibioticul neomicin, urmat de un alt marEer tE (gen viral ce codific timidinEinaza, responsabil de in"ibarea liniilor celulare pe medii cu ganciclovir) situat nafara constructului genic# (ac este adugat ganciclovirul n mediile de cultur n care cresc celulele de oarece acestea vor fi in"ibate n cretere datorit imposibilitii sintezei precursorilor A(4 (timina)# ;odulul de gen este transferat n celule stem embrionare aflate n cultur, care prin recombinare omolog va duce la obinerea de celule transformate ce vor fi selectate pe medii cu neomicin i ganciclovir deoarece acestea vor conine gena neo5 integrat i deci sunt rezistente la neomicin, ns nu conin gena tE, situat nafara regiunii recombinrii omologe, care va fi pierdut# (ac insertul nu se integreaz n gazd, va fi pierdut n cursul meiozei# 9elulele transformate se obin doar prin recombinare omolog iar care sunt selectate pe medii cu neomicin i ganciclovir n care nu supravieuies celulele netransformate# &unt transformate celule stem provinite de la o linie de culoare agouti care ulterior sunt transferate n blastociti de oarece ce provin de la o linie de culoare neagr ,n urma creterii blastocitilor pe medii de cultur, embrionii sunt transferai n mame receptoare n care se vor dezvolta ca animale "imere# Animalele "imere sunt identificate dup culoarea combinat negru-agouti# 9uloarea agouti este dominant asupra culorii negre (.), astfel nc$t din retro ncruciarea oarecilor "imer cu oareci negri vor rezulta "eterozigoi agouti (.0Eo) i oareci negri (..) Pentru obinerea de animale "omozigote EnoEout agouti (Eo0Eo) , "eterozigoii se ncrucieaz ntre ei (intr-o mperec"ere ulterioar a oarecilor "eterozigoi 5% de culoare agouti (.0Eo), vor rezulta "omozigoi EnoEout agouti (Eo0Eo) i "eterozigoi EnoEout agouti (.0Eo) i "omozigoi negri (..)# Pentru studierea funciei genei sunt utilizai "omozigoii EnoEout agouti# &e urmrete ce se nt$mpl cu aceti indivizi n descenden (dac nu pot produce o anumit protein codificat de o gen mutant)# Pentru "omozigoi dac gena are rol vital acetia mor# Pentru "eterozigoi de cele mai multe ori descendenii nu sunt viabili ceea ce ne arat importana sintezei unei anumite proteine n viabilitatea embrionilor sau a descendenilor# +c)aterea $in #unc*ie a e1(resiei unei gene "<n)c< $)An& (rin interme$iul ARNi "ARN $e inter#eren*%& /nterferena A54i este un proces celular normal prin care molecule reglatoare mici de A54 fac imposibil e!presia unei gene de la eucariote# Procesul se realizeaz prin producerea unei molecule dublucatenare de A54dc, dei moleculele de A54 sunt monocatenare#

A<

Aceasta form dublucatenar rezult datorit e!istenei unor secvene complementare n A54 desprite de o mic regiune monocatenar care va forma o bucl n momentul complementrii celor dou regiuni# Acest A54dc iniiaz un proces de tiere (splicing( prin intermediul unor proteine celulare care taie molecula de A54dc n fragmente mici de )%-)6 pb# 3na din proteinele celulare numit slicer se leag de aceste molecule mici de A54dc rezult$nd pierderea uneia din catene, A54 devenind monocatenar# A54 monocatenar se leag n continuare prin complementaritate de A54m sco$ndu-l din funcie (EnocEing do@n) adic mpiedic$nd translaia# ,n esen aceast scoatere din funcie rezult ca urmare a fragmentrii A54m de ctre A54i# C)nclu2ii 7uncia unei gene poate fi determinat e!perimental prin scoaterea complet din funcie a genei - EnocE out sau prin inactivarea e!presiei acesteai - EnocE do@n urmat de identificarea modificrilor ce apar n fenotip# Procesul de EnoE out al genei se refer la integrarea unei copii ntrerupte a genei n cromozom n locul genei normale, iar procesul de EnocE do@n al genei, se refer la inactivarea translaiei unei gene care se realizeaz cu a'utorul A54i, ce degradeaz A54m# Ar9itectura gen)mului 5ezultatele cercetrilor recente asupra genomului uman ne arat c at$t cromozomii c$t i secvenele A(4 sunt organizate specific n genom Genele structurale, care se transcriu frecvent, sunt grupate n cromozomi sub forma unor ciorc"ini n care densitatea genelor este mare ns intronii din aceste gene au densitate mic# ,n contrast cu aceste regiuni, genele care se transcriu mai rar au i ele tendina de grupare n clustere ns densitatea genelor este mic iar intronii din aceste gene au o densitate ridicat# Secvenele repetitive scurte dispersate n genom (&/4+), cum sunt secvenele %lu de la primate, se gsesc mai frecvent n regiunile genelor ce se transcriu frecvent n timp ce secvenele repetitive lungi C/4+ sunt situate n regiunile cromozomiale acoperite cu gene ce se transcriu mai rar# ,n interfaza clusterele cu densitate mic se gsesc n apropierea membranei nucleare n timp ce clusterele cu densitate mare a genelor se gsesc nspre centrul nucleului# Idat cu secvenierea genomurilor unor specii s-au desc"is ci noi de studierea a e!presiei unei gene at$t pentru fenotipul normal c$t i pentru cel alterat aprut ca urmare a inducerii unei mutaii n gen# Lotalitatea materialului genetic transcris la un moment dat n interiorul unei celule este determinat cantitativ prin msurarea cantitii de A54m din celul# Aceaste msurtori ofer o imagine de ansamblu asupra stadiului global de e!presie a genelor structurale ntr-un organism#

AF

&eturile de A54m e!istente la un moment dat n celul formeaz transcri(t)mul celulei iar /tiin*a care stu$ia2% transcriptomii unui organism poart numele de transcri(t)mic%! (eoarece A54m codific un anumit produs polipeptidic cu rol funcional n organism transcriptomii sunt un indicator celular al funciei i fenotipului unui organism# Prin e!tensie, setul complet de proteine sintetizat de o celul poart numele de (r)te)m! Transcri(t)mii Lranscriptomii nu sunt identici n toate celulele organismului# I celul muscular i una "epatic vor transcrie gene diferite din genom# 9$nd o celul funcioneaz normal iar A54m din aceast celul este identificat i msurat vom obine un transcriptom constant, ns c$nd celula i modific funcia transcriptomul ei se va modifica n consecin# (e e!emplu, o celul de dro'die creia i se modific condiiile de cretere sau o celul stem va activa gene care apoi sunt transcrise, n funcie de necesitile celulei# (eterminarea e!act a e!presiei genei,a momentului n care gena se e!prim i a nivelului ei de e!presie n funcie de diferii factori poate duce la nelegerea global a funciei acestei gene la nivel celular# Prin nivel global nelegem rspunsul concertat al ntregii celule la diferite condiii de cretere, respectiv la toate modificrile produse n celul, inclusiv cele aprute n transcripie i mai puin la modificrile care apar la nivelul unei gene particulare# Determinarea transcri(t)mului (rin te9nica DNA micr)arra] "DNA c9i(s& 9ea mai e!act metod pentru determinarea transcriptomilor dintr-o celul este te"nica D'% chips sau microarra?# ,n continuare este prezentat modalitatea de evideniere a transcriptomilor din celule de dro'die n vederea determinrii genelor implicate n procesul de sporulaie# 9elulele de dro'die sunt n stare "aploid doar n starea de spor care rezult n urma diviziunii meiotice# ,n timpul meiozei intr n funcie secvenial anumite gene care se transcriu, ele fiind grupate n patru clase: Gene care se transcriu: rapid# tArziu# genele care se transcriuIintermediarM i cele care se transcriuIfoarte tArziuM. Ca nceputul e!perimentului erau cunoscute %F= de gene din genomul dro'diei care au e!presie difereniat# Met)$)l)gia $e lucru AJ

9elulele de dro'die cultivate au fost forate s intre n sporulaie ,naintea sporulaiei i dup, a fost e!tras A54m (e pe matriele de A54m a fost obinute populaii de A(4c prin reverstranscripie care au fost marcate cu dou substane fluorescente la nivel nucleotidic# Pentru populaia de A54m dinaintea sporulrii s-a utilizat colorantul 9?F (d3LP) care emite culoare roie n lumina 3*# Pentru A54m e!tras din celulele "aploide, dup sporulaie marcarea s-a fcut cu 9?-6 (d3LP) care emite o culoare roie mai desc"is, la alt lungime de und. Pentru fiecare e!periment cercettorii au diri'at aceste sonde ctre probe de A(4 imobilizate pe plcile microarra?, care au fost sintetizate prin P95,dup scanarea tuturor regiunilor I57 din genomul de dro'die# Probele de A(4 obinute prin P95 au fost denaturate, marcate cu 9?F i imobilizate pe plci# (up realizarea e!perimentelor de "ibridare cu sondele de A(4c, plcile "ibridate au fost scanate pentru depistarea poziiilor de "ibridare i a culorilor din spoturi &of@are-ul pentru analiz convertete semnalul luminos emis de colorantul fluorescent 9?F n rou, iar pe cel emis de 9?6 n verde# (ac un anumit tip de A54 este prezent n cantitate mai mare n spori dec$t n celulele nesporulate (cum este cazul genei L+P%) rezultatul apare sub forma unor spoturi de culoare rou intens iar genele represate n transcripie n sporulaie apar colorate n verde fluorescent# Genele care se e!prim apro!imativ constant n ambele tipuri de celule vor aprea colorate n galben# 9uloarea portocalie indic modificri temporare ale nivelului de transcripie, ce au loc n timpul e!perimentului, iar culoarea neagr indic faptul c aceste gene nu se transcriu nici n celulele nesporulate i nici n cele aflate n sporulaie# Astfel au fost depistate %=== de gene a cror nivel de transcripie se modific n timpul sporulrii# M)$i#ic%rile transcri(t)mil)r 8n cancer 5armac)gen)mica este un domeniu din cercetarea medical care implic studierea e!presiei genelor n cazul anumitor afeciuni, deoarece v$rsta, starea de sntate, dieta i mediul modific acest rspuns la fiecare individ n parte# 5armac)gen)mica se bazeaz pe procesele bioc"imice ce au loc n organism n corelaie cu genele, mutaiile sau polimorfismele A(4 i cu proteinele codificate de acestea &copul farmacogenomicii este acela de a dezvolta tratamente care au la baz molecule de acizi nucleici i de proteine n str$ns corelaie cu genele i proteinele defective dintr-o anumit maladie (ei este o ramur nou a genomicii, aceasta a reuit de'a producerea de compui utilizai ca ad'uvani n tratarea unor boli#

AN

3n astfel de e!emplu este gena cit)cr)m (.JE "CXP& implicat n sinteza unei enzime care a'ut organismul n eliminarea compuilor medicamentoai, nemetabolizai i remaneni n organism# ;ulte dintre medicamente, cum sunt cele din clasa opiaceelor sunt metabolizate mai greu de organism fiind remanente un timp ndelungat i produc efecte to!ice ;etabolizarea insuficient a unui medicament are ca efect i un rspuns sczut la terapie, fenomen care apare la persoanele care poart alele nule, sau au o singur alel funcional dar i cele la care a avut loc o duplicare a genei la care produc un rspuns e!cesiv# 3n alt produs ce se ncearc s se dezvolte n farmacogenomic este leagat de rspunsul organismului aflat n c"imioterapia diferitelor forme de cancer# 5ezultate promitoare au fost obinute n c"imioterapia limfoamelor cu celule 8, la care au fost determinate dou fenotipuri distincte determinate genetic : unul care prezint rspuns rapid la c"imioterapie i un alt fenotip care nu rspunde deloc la acest tip de tratament fiind necesare alte abordri, mai agresive pentru stoparea proliferrii celulelor# Pr)te)mul Proteomul este totalitatea proteinelor sintetizate ntr-o celul la un moment dat# &copul cercetrilor de proteomic este de (%)a identifica fiecare protein din proteom ()) (e a-i determina secvena n aminoacizi (6) (e a analiza proteinele la nivel global n diferite tipuri de celule (<) (e a nelege funciile bioc"imice ale tuturor proteinelor din proteom

(escifrarea secvenelor proteice este un proces mult mai comple! dec$t descifrarea secvenelor A(4 dintr-un genom Anali2a (r)te)mului 9ompania 9elera Genomics 'oac un rol important n descifrarea structurii proteinelor din genomul uman alturi de K3PI (Kuman Proteome Irganisation) (escifrarea proteomului se bazeaz pe trei mari te"nici de laborator: electroforeza bidimensional i spectrometria de mas, te"nici care nu sunt c"iar at$t de sensibile atunci c$nd e vorba de proteine mici sau care se sintetizeaz la nivel sczut# I a treia te"nic dezvoltat recent : (r)teine mic)rarra] se bazeaz pe acelai principiu ca i te"nica A(4 microarra?# Le"nica este complet automatizat desc"iz$nd posibilitatea de a analiza rapid i precis un numr foarte mare de proteine simultan# Proteinele marcate fluorescent sunt imobilizate pe plcue (chip), sau pe membrane ctre care sunt diri'ai anticorpi de legtur pentru detectarea proteinelor# Lotalul de )=#=== de gene estimate ca fiind gene structurale funcionale n genomul uman, codific F==#=== de proteine, prin urmare procesul de identificare a acestora este mult mai comple!# C)nclu2ii

AB

&etul complet de proteine dintr-o celul se numete proteom &copul proteomicii este acela de a identifica proteinele, de a le determina structura i funcia, de a dezvolta baze de date cu secvenele n aminoacizi ale tuturor proteinelor i de a analiza proteomul n diferite celule i diferite stadii ale dezvoltrii#

AA

S-ar putea să vă placă și