1

Curs 3

Tehnici

analitice

utilizate

n
laboratorul

clinic
Principiul metodelor
Instrumentaie
Spectrofotometria

de absorbie

molecular

i poteniometria

direct

adaptate

specificului

de laborator

clinic.
2
Tehnici curente de analiz
Optice -(spectro)fotometria de absorbie

molecular
- fluorimetria

(hematologie)
-

nefelometria, turbidimetria

(hematologie)
-

flamfotometria
Electrochimice -poteniometrie cu electrozi ion-sensibili
-senzori

amperometrici
-conductometrie
Cromatografice
Electroforeza
separarea proteinelor
Osmometrie -pe baza msurrii punctului de nghe
-pe baza msurrii presiunii de vapori
Star Trek- Medical Tricoder
3
1. Metode optice
1. Metode optice
Un numr extrem de mare de determinri n laboratorul clinic se bazeaz
pe msurri de energie radiant:
Emis
Transmis
Absorbit
mprtiat
Reflectat n condiii controlate
4
1.1.

Spectrofotometria

de absorbie

molecular
Principiu:
msurarea intensitii radiaiei transmise
printr-un mediu absorbant la o anumit
lungime de und i corelarea cu
concentraia speciei absorbante
P
0
P
T
5
1.1.

Spectrofotometria

de absorbie

molecular
Spectrofotometru

de absorbie

molecular

monofascicol
obturator
Sursa de
radiaii

Sursa de
radiaii
Dispozitiv

de
selectare

si

izolare

Dispozitiv

de
selectare

si

izolare

Soluia
de
analizat

Soluia
de
analizat
Sistem

de
detecie i
msur

Sistem

de
detecie i
msur
Afiaj
Afiaj
Soluia
de
referin

Soluia
de
referin
A =

x b x c

: coeficient molar de extincie
(L

mol
-1

cm
-1
)
c: concentraie (mol L
-1
)
b: grosimea stratului absorbant (cm)
Absorbana probei necunoscute este comparat
direct cu cea a unei soluii de calibrare sau un set
de soluii de calibrare
6
Schema optic a spectrofotometrului cu
arie de diode
Sursa de radiaie (1)
Focalizare cu lentil plan convex (2)
Lentil convergent (3)
Cuva de msur (4)
Focalizare cu lentil plan convex (5)
Obturator

(6)
Fanta de intrare a policromatorului

(7)
Reea de difracie concav (8)
Detector (9)
Dezvantaje:
Instrument monofascicol
Interferene cauzate

de
fluorescen
7
Direct proporionalitate ntre Absorban

i
Concentraie
C
x

concentraia speciei necunoscute
C
st

concentraia standardului
A
x

absorbana

speciei necunoscute
A
st

absorbana

standardului
st
st
x
x
st
x
st
x
C
A
A
C
A
A
C
C
=
=
Concentraie etaloane
Conc prob c
x
S
e
m
n
a
l
Y=mc
Curb de calibrare
Analiz cantitativ
1 singur standard
8
9
1.2. Fluorimetrie
Fluorescena

-

apare cnd o molecul absorabe

radiaie cu o anumit
1

i reemite

radiaie la
2

>
1
Fluorimetrie

msurarea fluorescenei
Metod foarte sensibil i larg utilizat n analiza
cantitativ n chimie i biologie
Fluorofor atom sau molecul care prezint
fluorescen
10
1.3. Turbidimetria

i nefelometria

Msoar gradul de mprtiere a luminii (light

scattering)

Interaciunea luminii cu particulele din soluie (coliziune
elastic) determin mprtierea radiaiei n toate direciile

Msurarea se face la aceeai ca i a radiaiei incidente (!)

Factorii care influeneaz mprtierea:
Dimensiunea particulei
Lungimea de und
Distana de observare
Efectul de polarizare a radiaiei incidente
Concentraia particulelor
Masa molecular M a particulelor
11
Turbidimetria

i nefelometria
Msurarea intensitii radiaiei mprtiate (transmise)
Turbidimetrie
Nefelometrie
Proba
Sursa

de radiatie
Disp. optice

excitare
Filtru

excitare
Disp. optice

imprastiere
Filtru

de detectie
Detector
12
1.4.

Flamfotometria

Atomizarea i excitarea probei are loc n flacr.

Emisia atomic i cea a benzilor moleculare are loc n domeniul VIZ
Prob
250
Colector de Flacr

Fotodedector

Afiare
radiaie rezultat
(oglind)
Amplificator
Combustibil
Nebulizator
Aer
Monocro-

mator
13
Structura filmelor
multistrat

tip Kodak
Strat superior de
fixare
Strat de dispersie
Strat cu reactivi
Membrana
semipermeabil
Strat indicator
Suport
Strat inferior
de fixare
Film multistrat
Filtru
Surs
Detector
1.5.

Fotometria

de reflectan
http://www.roche.ro/portal/roche_romania/reflotron
Reflotron Reflotron
http://www.fujifilm.com/products/medical/products/clinical_chemistry_system/slides/
14
2. Metode electrochimice
2. Metode electrochimice
Electrozi cu membran ion-selectiv
Electrozi cu membran selectiv pentru molecule
Senzor amperometric
15
Electrozi ion selectivi (ISE)
Electrozi ion selectivi (ISE)

ISE sunt semicelule

electrochimice

Celula electrochimic conine:

Electrodul de referin

Electrod de msur

Diferite membrane selective sunt dispuse la vrful electrodului
de msur

Potenialul msurat al celulei poate fi corelat cu concentraia
analitului

Analii msurai cu ISE: pH, Na, K, Cl, Ca
ionic
16
Electrod cu Electrod cu
membran de sticl membran de sticl
de pH de pH
Electrod combinat de Electrod combinat de
pH pH
Ag/AgCl
Sol ref

int
Membrana
de sticl
Spre pH-

metru
Orificiu de
umplere
Ag/AgCl
Sol ref

int
Ag/AgCl
jonciune
Sol ref a
electrodului
de sticl
Msurarea pH
Msurarea pH
-
-
ului
ului
17
Electrozi cu membran lichid
Electrozi cu membran lichid
Cu schimbtori de ioni Cu schimbtori de ioni, pentru Ca , pentru Ca
2+ 2+

S.I. lichid (dodecilfosfat) dizolvat ntr-

un solvent nemiscibil

cu apa,

imobilizat
ntr-o membran hidrofob

L.D. ~

10
-5

M

Domeniu de pH: 5.5-11
Configuraia electrodului cu
membran lichid pentru ioni de Ca
Ca [(RO)
2

PO
2

]
2

Ca
2+

+ 2 [(RO)
2

P
2

]
-
Faza organic Faza apoas

Faza organic
E
ind

= K + (0.059/2) lg

a
Ca2+
18
Electrozi cu membran lichid
Electrozi cu membran lichid
Cu Cu ionofori ionofori

neutri, pentru K neutri, pentru K
+ +

Valinomicina- macromolecul ciclic format
din aminoacizi i esteri

Fixeaz selectiv K
+

Electrozi miniaturizai pentru msurri in
vitro

Mult mai sensibili la K
+

dect la Na
+
Valinomicin
19
Electrozi cu enzime
Electrozi cu enzime

Enzime imobilizate n membrane permeabile pentru gaze

Produii reaciei catalizate enzimatic sunt molecule (gazoase)
mici (H
+
, NH
3

, CO
2

)

Sonda msoar modificarea concentraiei gazului n soluia
intern

Electrozii sunt

Selectivi

Scumpi

Utilizai

in vivo

Condiii de utilizare limitate de pH, temperatur
20
Electrozi cu enzime
Electrozi cu enzime
Exemple: Exemple:

Electrozi pentru glucoz, colesterol, uree
+ =
+ +
4
2
3
7
2 2 2
2 2 ) ( NH CO O H CO NH
pH ureeaza
O H NH OH NH
pH
2 3
9 8
4
+ +
= +
21
Electrod
Electrod
Clark
Clark
(A) Pt-

(B) Ag/AgCl-electrod (C) electrolit KCl (D)
membrana Teflon (E) inel de cauciuc

(F) sursa
tensiune

(G) galvanometru
Electrodul Clark

msoar O
2

pe baza
reaciei:
O
2

+ 4 e

+ 2 H
2

O 4 OH

22
Electroforeza
Electroforeza

Utilizat pentru separarea i determinarea
fraciunilor proteice

Va fi discutat la capitolul despre proteine
23
3. Cromatografice
Metodele cromatografice pentru separarea unor
componeni din fluide biologice sunt utilizate mai mult
n studii de cercetare dect n analizele de rutin
24
4. Osmometrie
Presiune osmotic mrime coligativ, dependent de
numrul de particule dizolvate
Numrul de particule dizolvate n soluie determin
sensul de transport al apei prin membrane
semipermeabile

Apa se deplaseaz din zona de concentraie sczut
spre cea de concentraie mai ridicat

Osmometre

instrumente analitice de msurare a
concentraiei totale de substan dizolvat care
contribuie la presiunea osmotic a soluiei
25

Cum se realizeaz calibrarea pentru analiza cantitativ a unui analit?

Pe ce se bazeaz determinarea unui analit prin spectrofotometria

de absorbie
molecular?

Ce este

fotometria de reflectan?

Ce sunt electrozii cu membran lichid?

Cum se pot determina Ca total i Ca ionic ntr-o prob de ser?

Ce informaii importante furnizeaz osmometria?

Ce exte

oximetria?