EXPERIMENTUL 2

Steroizii anabolici androgeni sunt derivai sintetici ai formonilor

masculini endogeni primari din categoria testosteronului. Efectul anabolic al
steroizilor androgeni (AAS) ajut corpul s rein proteinele din nutrimente,
contribuind la creterea muchilor, oaselor i pielii. Proprietile androgene ale
AAS includ activarea sistemului reproductiv masculin i dezvoltarea
caracterelor sexuale secundare, cum ar fi distribuia pilozitii i configuraia
musculo-scheletal. AAS se dezvolt n glandele cu secreie intern masculin i
au fost folosii iniiali n tratamentul disfunciei hipogonadale, ncepnd cu
pubertatea la brbai. Datorit efectelor anabolice AAS au devenit foarte folosii
de ctre sportivi n special n atletism. Ei au ca efect creterea masei musculare
striate, a forei i rezistenei muchilor. Totui, mecanismele exacte prin care
acioneaz AAS sunt puin nelese. S-a confirmat prin studii localizarea
receptorilor androgenici n nucleii celulelor satelit (SC). Activarea SC de ctre
AAS se face prin mecanisme care conduc la hipertrofia muchilor striai.
Steroidul numit nandrolon decanuat este unul dintre cele mai populare i
frecvent folosite substane steroide anabolice. i datoreaz popularitatea
faptului c prezint un efect anabolic semnificativ cu efecte secundare reduse.
Aceasta l face s fie foarte bine tolerat i folositor pentru tratamentul unei largi
varieti de boli clinice, cum ar fi bolile obstructive, pulmonare cronice,
osteoporoza i osteopenia i , de asemenea, pentru HIV. La pacienii cu HIV ,
nandrolonul a prezentat efecte sigure n creterea masei musculare a acestor
pacieni. Doza terapeutic recomandat pentru nandrolon este de o,4 mg/kg i pe
zi la om. Totui, dozele pot varia larg n funcie de boal i severitatea sa.
Nandrolonul este cel mai folosit steroid de ctre sportivi n special n culturism.
Pn de curnd nu au existat studii care s detecteze efectele directe
asupra distribuiei SC i mionucleilor de ctre steroizi de tipul nandrolon.
Experimentul examineaz efectele nandrolonului decanuat asupra numrului i
distribuiei SC i morfologiei fibrelor musculare scheletice la muchiul tibial
1

anterior (TA) la obolan. Se testeaz ipoteza c administrarea de steroizi duce la

creterea masei musculare i a diametrului fibrelor musculare n muchiul TA de
obolan. n plus exist ipoteza c ar determina o mai mare frecven i
concentraie a celulelor satelit (SC) la animalele tratate cu steroizi fa de grupul
martor. obolanii au fost mprii n dou grupe: primul grup a primit
nandroloni injectabili n timp ce al doilea grup a primit soluie de ser fiziologic
(grupul martor). S-au calculat numrul de SC i mionuclei n interiorul fibrelor
musculare prin tehnici de morfometrie comparat. S-a nregistrat o cretere
semnificativ (P< 0,01) n diametrul fibrelor musculare tratate cu nandroloni
decanoat. De asemenea, frecvena i concentraia SC au fost semnificativ mai
mari (P<0,05) la subiecii tratai cu steroizi dect la cei din grupul martor.
Studiul indic faptul c administrarea steroizilor poate induce hipertrofie
muscular scheletic corelat cu creterea numrului de SC.
Material i metod
obolani femeli din rasa Sprague Donan au fost selectai de la aceeai
mam i crescui n condiii identice n biobaza Facultii de Biologie din
Universitatea Piteti, la temperatur constant i n aceleai condiii de via i
hran. La vrsta de 63 de zile s-au administrat injectabil n muchiul TA la
membrul posterior drept patru injecii timp de o sptmn la lotul de
experiment. Pe aceeai durat lotul martor a fost injectat cu o soluie clorur de
sodiu N/1. Ambele soluii au fost n doz de 300 ml nandroloni decanuat
respectiv ser fiziologic. Tibialul anterior (TA) este un muchi reprezentativ i de
aceea, a fost ales pentru studiul morfometric.
Prepararea i secionarea esutului
Trei eantioane de esut muscular au fost excizate din regiunea median a
TA de la obolani pentru fiecare animal din loturile martor, respectiv de
experiment. Fiecare prob a avut dimensiunile aproximative: 0,5 x 0,5 x 2 cm.
Axul longitudinal al fiecrei probe era paralel cu direcia fibrelor musculare
striate. Fiecare prob a fost inclus n OCT i imediat ngheat n 2-metilgutan
2

rcit cu azot lichid. Probele au fost apoi stocate la o temperatur de -80C .

Seciuni transversale seriate de 10 microni grosime au fost realizate la 20 C
folosind un criostat. Dou seciuni seriate au fost folosite din fiecare prob
pentru examen microscopic pe lam. Microscopul folosit a fost un nikon eclipse
600 cu soft de analiz de imagine instalat (LUCIA-NET).
Analiza imaginilor i colectarea datelor
Cinci cmpuri microscopice diferite au fost analizate i capturate folosind
videomicroscopul menionat, fiecare imagine fiind apoi prelucrat i stocat
digital i analizat morfometric din punct de vedere al structurilor
histopatologice.
Imaginile rezultate au fost comparate ntre loturile de experiment i
martor. Prelucrarea digital a

luat n considerare profilele morfologice pe

unitate de suprafa i volum, fiecrui profil fiindu-i analizate dimensiunile,

forma i coloraia. Imaginile referitoare la lamina bazal au fost folosite pentru
msurarea axei eliptice minime a fiecrei fibre musculare n parte. Programul de
morfometrie poart numele SCION. Numrul de nuclei ai celulelor satelit i de
mionuclei a fost numrat pentru fiecare din cele 200 de fibre musculare luate n
calcul pentru fiecare animal n parte. Frecvena celulelor satelit a fost calculat
pentru fiecare animal folosind formula: frecvena = (SCN/SCN + MN) x 100 %,
unde SCN = numrul de nuclei ai celulelor satelit iar MN = numrul de
mionuclei. Valorile medii ale frecvenei SC pe fiecare grup au fost obinute la
patru animale din grupul experimental respectiv la patru animale din grupul
martor. Numrul de SC i mionuclei pe unitatea de lungime a fibrei a fost
calculat folosind formula lui Catillo de Maruenda i Franzini Armstrong
(1978).
Aceast formul este N=A/(Ln + N) unde N = numrul de celule pe
unitatea de lungime a fibrei , A = numrul mediu de nuclei pe profil de fibr, Ln
= diametrul mediu al nucleilor iar M = grosimea seciunii esutului. Aria de
suprafa a sarcolemei pe unitatea de lungime a fibrei a fost calculat folosind
3

formula: S = EU, unde S = suprafaa arei sarcolemale pe unitatea de lungime a

fibrei, E = axa eliptic minim iar U = unitatea de lungime a fibrei (1 mm).
Dup aceasta , aria sarcolemal a fibrei musculare pentru fiecare SC a fost
determinat mprind aria suprafeei msurate la numrul de SC pentru fiecare
animal de experien. Domeniul mionuclear a fost calculat ca dimensiune pentru
fiecare obolan prin mprirea volumului citoplasmei la unitatea de lungime a
fibrei prin calculul numrului de mionuclei din acea unitate de lungime.
Volumul citoplasmei pe unitatea de lungime a fibrei (V) a fost calculat folosind
formula V = (E/2)2 U.
Statistic
Probele au fost mprite n dou grupe (lotul martor i lotul de
experiment, tratat cu nandrolon decanuat). Testul LEVENE pentru egalizarea
parametrilor de variaie a fost aplicat n scopul determinrii omogenitii
varianei. Datele au fost apoi evaluate prin teste independente de tipul testului t
cu nivel de semnificaie 5%. Toate analizele statistice s-au fcut de ctre
specialiti din catedra de statistic a Facultii de Matematic - Informatic din
Universitatea Piteti.
Rezultate
1.Greutatea muscular
Masa muchiului TA a fost semnificativ mai mare (P<0,01) la lotul de
experiment tratat cu steroizi dect la lotul martor care a primit soluie de clorur
de sodiu. Media greutii muchiului TA abaterea standard la grupul martor a
fost de 53,8 1,13 g , n timp ce la grupul de experiment aceast valoare a fost
de 65,5 0,93 .
2.Dimensiunea profilului fibrelor
Axa eliptic minim a muchiului TA a fost semnificativ mai mare (P<
0,01) la grupul de experiment tratat cu nandroloni dect la grupul martor. Axa
eliptic minim abaterea standard la grupul de experiment a fost de 39,28
1,57 microni, n timp ce la grupul martor a fost de 31,59 0,82 microni.
4

3.Numrul de SC pe unitatea de lungime a fibrei

Numrul de SC pe un milimetru de fibr a fost semnificativ mai mare (P<
0,01) la grupul de animale de experien dect la grupul martor. La grupul
martor media SC pe milimetru de segment de fibr abaterea standard a fost de
5,67 0,32, n timp ce la grupul de experiment valoarea sa a fost de 8,38 0,4.
4.Concentraia SC
A fost nregistrat o arie de suprafa a plasmalemei/SC semnificativ mai
sczut (P<0,05) n cazul animalelor de experiment tratate cu nandroloni fa de
lotul martor. Aria de suprafa medie/SC abaterea standard la lotul martor a
fost de 17,6 704,47 microni2. Aceast valoare a sczut la 14,7 568,33 la
grupul de experiment tratat cu nandrolon. Aceste rezultate arat c exist o mai
mare concentraie de SC la grupul experimental fa de grupul martor.
5.Numrul de mionuclei pe unitatea de lungime a fibrei
Numrul de mionuclei pe milimetru de lungime a fibrei musculare a fost
mai mare la grupul de experiment dar nu difer semnificativ fa de valorile
grupului martor (P = 0,062). Numrul de mionuclei n medie pe milimetru de
segment de fibr abaterea standard la grupul martor a fost de 81,39 2,21. La
grupul tratat cu nandroloni aceast medie abaterea standard a fost de 92,8
4,45.
6.Dimensiunea domeniului mionucleilor
Dimensiunea domeniului mionucleilor (volumul de citoplasm aferent
unui mionucleu) a fost msurat pentru fiecare grup n parte. Domeniul
mionucleilor s-a dovedit semnificativ mai mare (P<0,01) la grupul tratat cu
nandroloni fa de grupul de control. Media dimensiunii domeniului
mionucleilor la grupul martor abaterea standard a fost de 10,8 511,53
microni3. Valoarea medie a dimensiunilor domeniului mionucleilor a fost de 14,2
488,16 microni3 la grupul de experiment.
Discuii

Studiul a demonstrat efectele steroizilor anabolici (nandrolon decanuat)

asupra distribuiei SC . El arat c administrarea de steroizi pe o perioad relativ
scurt (4 sptmni) poate crete semnificativ frecvena i concentraia SC n
muchiul TA de obolani. Acest rezultat a fost nsoit de o cretere n
dimensiunea fibrei (hipertrofie). Alt descoperire este observarea apariiei de
fibre gigante la grupul de obolani tratai cu steroizi. Este stabilit c
administrarea steroizilor poate duce la o cretere masiv a masei musculare. La
sportivii tratai timp de 10 sptmni cu substane din grupa AAS combinat cu
un program de exerciii intensive poate duce la o cretere semnificativ a masei
musculare la muchii braelor (biceps i triceps brasial) sau la muchii
membrelor inferioare (muchiul cvadriceps). Dozajul diferit al steroizilor
administrai la persoane voluntare fr asocierea cu exerciii de for a
determinat totui o cretere a masei musculare dependent de doz.
Mecanismele exacte prin care administrarea de steroizi duce la creterea
masei musculare nu sunt complet nelese, din cauz c exist mai multe efecte
fiziologice combinate a acestor substane asupra fibrei musculare striate.
Creterea numrului de mionuclei din interiorul fibrei musculare demonstreaz
legtura ntre modificrile structurale i cele funcionale pe care le determin
administrarea acestor substane la grupurile de experiment folosite. Dimensiunea
domeniilor mionucleilor a fost semnificativ mrit la grupul de experiment fa
de grupul martor. Aceste rezultate subliniaz efectul benefic de hipertrofie i
regenerare al acestor substane pe fibra muscular striat.
Pe msur ce dimensiunea i numrul mionucleilor crete i capacitatea
funcional a muchiului n totalitate este crescut.
n concluzie experimentul de fa arat c administrarea steroizilor este
benefic n dezvoltarea i regenerarea muchiului striat. Steroizii anabolizani au
rol n recrutarea i proliferarea celulelor precursoare musculare ducnd la o
recuperare morfologic i funcional mai rapid la persoanele tratate cu astfel
de substane.
6

EXPERIMENT 3
Tehnica zdrobirii muchiului i a orientrii pieselor de biopsie se face pe
seciuni transversale cu marker de sudur (x). Seciuni transversale la trei regiuni
separate au fost luate n discuie: regiunea superficial (S), regiunea
intermediar (I) i regiunea profund (P). Acestea au fost determinate pe linia
median a zonei de regenerare. Fiecare regiune reprezint un cmp microscopic
mrit de 400 de ori.
Leziunile observate au fost mai frecvente n zona esutului conjunctiv
liber, caracterizate printr-o mpachetare dens a miotubilor fa de alte zone
analizate. Miotubii la grupul martor au fost mai mici (10 30 gm n diametru),
fa de grupul experimental la care dimensiunile au fost ntre 20 60 gm n
diametru). n aria superficial i profund frecvena mionucleilor a fost
asemntoare la cele dou grupuri, iar cantitatea de esut conjunctiv a fost
similar. n schimb s-a nregistrat o proporie crescut n zona superficial fa
de zonele profund i median. Aceasta permite concluzia c miotubii se
aglomereaz pe unitatea de suprafa n regiunea superficial la lotul de
experiment comparativ cu lotul martor.
Analiza cantitativ morfometric ia n considerare densitatea miotubilor
pe unitatea de volum n cele trei zone: superficial, intermediar i profund la
nivelul zonei lezionale. Reproductibilitatea leziunilor a fost confirmat prin
tehnica de morfometrie. Analiza statistic s-a fcut prin testul student care ia n
considerare parametrii de variabilitate analizai prin testul t. Cele dou loturi au
fost comparate i s-a nregistrat o diferen semnificativ (P< 0,05) la lotul
experimental n ceea ce privete densitatea mionucleilor pe unitatea de volum,
comparativ cu lotul martor. Datele nregistrate au fost mai semnificative n
regiunea superficial fa de regiunile intermediar i profund a ariei de
seciune luat n studiu. Densitile medii ale miotubilor abaterea standard au
fost luate n calcul la 10 animale pentru fiecare grup (experimental respectiv
martor).
7

Datele sunt cuprinse n tabelul de mai jos:

Interpretare
Diferenele semnificative n densitatea miotubilor la lotul de experiment a
fost mai mare n zona superficial fa de zona intermediar i profund (P<
0,01)

n timp ce n zonele intermediar i profund diferena nu a fost

semnificativ diferit. Studiul de fa arat c zonele de regenerare sunt situate

cu preponderen n poriunea superficial fa de cea intermediar i profund
la ambele grupe (de experiment respectiv martor).
Testul ANOVA biunivoc a indicat diferene semnificative ntre cele dou
loturi martor i de experiment n care s-a nregistrat o preponderen a frecvenei
mionucleilor la lotul de experiment fa de cel martor (P<0,05).
Discuii
Se consider c metoda de analiz morfometric luat n studiu a furnizat
date suficiente pentru investigarea diferenelor n regenerarea muchiului striat.
Astfel, s-a demonstrat o mai bun capacitate regenerativ n cazul administrrii
factorilor de cretere fa de lotul martor. Analiza cantitativ morfometric a
subliniat cantitatea suplimentar de fibre musculare, celule satelit i mionuclei
pe unitatea de volum n cazul lotului de experiment fa de lotul martor.
Diferenele statistice ntre cele dou grupuri au fost nalt semnificative, indicnd
c administrarea factorilor de cretere accelereaz vindecarea, recrutarea i
proliferarea celulelor satelit i previne fibroza muscular. Analiza seciunilor
transversale s-a dovedit mai revelatoare fa de cele longitudinale deoarece
favorizeaz o mai bun numrare a miotubilor i o analiz cantitativ mai
detaliat. Reperul minim de diametru luat n considerare este de 10 gm. La acest
nivel se pot distinge precursorii miogenici de alte celule mionucleare prin
analiza caracteristicilor lor morfologice. n cazul celulelor mai mici de 10 gm n
diametru a fost dificil clasificarea acestora cu ajutorul microscopului optic.

n particular o cretere a numrului de celule satelit s-a nregistrat prin

recoltarea de probe la 10 zile dup lezarea muchiului fa de alte intervale mai
lungi. Urmnd analiza n cele trei zone distincte de leziune, cea mai important
regenerare a fost observat n cazul regiunii superficiale. Din zona intermediar
au pornit mugurii de regenerare ctre suprafaa muchiului, demonstrnd
similariti cu zonele aflate la suprafaa muchiului n cazul lezrii acestuia la
oameni. Aa cum era de ateptat , densitatea miotubilor a fost mai mare la grupa
tratat cu factori de regenerare fa de lotul martor. Se pare c regenerarea
muscular n zonele intermediar i superficial apare independent de aportul
vascular i nu este influenat de reparaia prin esut fibros , ci numai pe baza
potenialului miogenic al celulelor satelit. Diferenele cantitative ntre cele dou
grupe : martor i experimental poate fi pus doar pe seama aciunii factorilor de
cretere, din moment ce am exclus ali factori de eroare legai de motenirea
genetic, ceea ce a dat o mare acuratee rezultatelor tehnicii propuse.
Analiza statistic a exclus rezultatele care puteau introduce erori de
interpretare. Clasificarea eficienei regenerrii musculare s-a fcut n funcie de
doza i durata administrrii factorilor de cretere. Potenialul regenerativ este
acelai la cele dou loturi din punct de vedere genetic dar este stimulat sub
influena factorilor de cretere.
EXPERIMENTUL 4
Metodele
Treizeci i cinci de animale din raza Sprague Done de sex feminin,
cntrind 200 gr au fost mprite n mod aleatoriu n trei grupe. S-a ales
muchiul tibial anterior ca fiind un muchi flexor plantar al piciorului, astfel
nct acesta nu suport n mod direct greutatea corpului animalului. Muchii
tibiali anterior (TA) de la obolanii primului grup au fost injectai cu soluie ser
fiziologic steril n concentraie de 0,9% pe durata a trei sptmni (n=5)
respectiv 2 sptmni (n=5). La al doilea grup administrarea a constat din
somatomedin I (IGF I) n doz de 0,9 micrograme pe zi timp de trei
9

sptmni (n=10). La al treilea grup s-a administrat IGF I 1,9 micrograme pe

zi timp de dou sptmni (n=5).
La alte dou grupe suplimentare, cinci obolani din fiecare au fost alei
pentru a li se administra local injectabil hormoni de cretere (GH) n doz de 1,9
micrograme pe zi respectiv factori de cretere fibroblastic recombinant 2 (FGF
2) timp de dou sptmni.
Tehnica administrrii injectabile
Dou doze de IGF I au fost selectate pentru a avea un efect ateptat de
inducere a creterii i regenerrii muchiului striat la obolan. Fiecare injecie de
IGF I a fost bine dozat i calculat la nivelul de 0,9 micrograme pe zi , ceea
ce

reprezint

echivalentul

unei

doze

sistemice

de

aproximativ

2,5

micrograme/kg i pe zi n funcie de greutatea animalului respectiv.

Administrarea de substan clorur de sodiu s-a realizat printr-un cateter
ataat la o pomp miniosmotic model Alzet 2002 timp de 14 zile sau model
2004 timp de 21 de zile. Pompele miniosmotice au fost umplute n condiii
aseptice, conform cu instruciunile de la productor. Toate soluiile au fost n
prealabil sterilizate nainte de a fi umplute n pomp. S-au folosit catetere de 12
cm cu tuburi flexibile implantabile. Aceste tuburi au fost folosite pentru a
furniza eliminarea excesului de dozaj n interiorul fasciei musculare. Tuburile
prezint din loc n loc fenestraii realizate cu ajutorul unei sonde din metal.
Pentru implantarea cateterelor, obolanii au fost anesteziai n prealabil cu
ketamin n doz de 2 miligrame/kg iar inciziile au fost fcute la nivelul
tegumentului de acoperire al muchiului tibial anterior la distan de 4 cm fa
de inseria acestuia.
S-au realizat dou mici tieturi la nivelul straturilor superficiale,
ndeprtnd fascia de nveli a muchilor cu ajutorul unor foarfeci chirurgicale.
Una dintre seciuni s-a fcut ctre captul proximal al muchiului, n timp ce
cealalt s-a fcut la captul distal n apropierea tendonului. Poriunea flexibil a

10

cateterului a fost inserat sub fascia de nveli i fixat cu ajutorul unui plasture,
astfel nct s nu poat fi mobilizat.
Cealalt poriune a cateterului a fost ataat pompei de infuzie. Cateterul a
fost apoi umplut cu soluiile de IGF I, respectiv ser fiziologic prin apsare pe
pompele respective de la captul liber, astfel s-a pompat o cantitate suficient i
echivalent din cele dou soluii n acelai interval de timp.
n funcie de specificaiile scrise pe pompa osmotic , volumul de lichid
care a fost administrat zilnic a fost ntre 10,8 0,48 mililitri la grupele de 2
sptmni i 5,3 0,24 mililitri la grupele de 3 sptmni. Aceast cantitate a
umplut ntre 0,6 i 1,3 % din spaiul extracelular al muchiului TA n funcie de
dimensiunea acestuia.
Pentru a fi sigur de validarea efectului administrrii IGF I s-au ales 6
obolani din fiecare grup de experiment care au fost sacrificai la 5 zile dup
administrarea factorului de cretere.
Recoltarea de esut
Ambii muchi TA care au fost injectai au fost ndeprtai chirurgical i
secionai pe jumtate de-a lungul axului longitudinal al muchiului, separndu-i
n 2 pri (superficial respectiv profund), seciunile fiind apoi ngheate cu
ajutorul azotului lichid. Probele au fost stocate la temperatura de 80 C pentru
analiza ulterioar.
obolanii din lotul martori ca i din cei experimentali au fost apoi
sacrificai la 14 zile de la implant cu ajutorul unei soluii de pentobarbital sodiu
(120 miligrame/kg). Muchii tibiali anteriori de la ambele membre contralaterale
au fost ndeprtai, cntrii i apoi ngheai cu ajutorul azotului lichid. i aceti
muchi au fost stocai la 80 C pentru analiza ulterioar.
Analiza statistic
S-a luat n calcul valoarea medie a masei musculare la care s-a adugat
abaterea standard. Diferenele ntre cele dou grupe au fost determinate folosind
testul statistic ANOVA i testul Student folosind chituri de analiz statistic n
11

cadrul catedrei de statistic din Facultatea de Matematic Informatic a

Universitii din Piteti.
Rezultate
Datele culese au artat o cretere substanial a masei musculare i a
numrului de fibre pe unitatea de volum la lotul experimental fa de lotul
martor, la care s-a administrat soluie de ser fiziologic. Nivelul de IGF I
acumulat n muchi a fost de 3,629 ng/gram de muchi, datorit acumulrii
sporite n zona lezional. Aceste valori reprezint un rspuns fiziologic la
capacitatea regenerativ a muchiului striat datorat recrutrii i nmulirii
celulelor satelit. La animale la care s-a administrat ser fiziologic regenerarea s-a
fcut n proporie de 30% pe baza esutului muscular i 60% pe baza esutului
fibros.
S-au nregistrat i creteri ale masei musculare totale la grupul tratat cu
factori de cretere n cantitate de cca.9 miligrame pe zi la fiecare din animalele
de experien.
n plus de regenerare s-a nregistrat o hipertrofie muscular la locul
administrrii de IGF I n cazul administrrii timp de 3 sptmni a 1,9
micrograme pe zi, mai mult fa de lotul la care s-a administrat aceeai cantitate
timp de 2 sptmni.
Discuii
Conform cu datele din literatura de specialitate peptida IGF I este
crescut la muchii care sufer proces de regenerare, ct i la cei care sunt supra
solicitai prin exerciii de ngreunare. Concentraia acestei peptide este mai mare
la animalele care sufer leziuni musculare. Rezultatele experimentului
demonstreaz c lotul care a primit IGF I sub form injectabil a suferit o
regenerare crescut a masei musculare fa de lotul la care s-a administrat soluie
salin. Factorii de cretere administrai nu au efect asupra masei musculare n
general, dar au efect local accentuat. Doza efectiv cea mai propice pentru
studiu a fost de cca.7,9 micrograme / kg pe zi i s-a obinut n urma administrrii
12

timp de 3 sptmni. Ea a contribuit la o regenerare bazat n proporie de 90%

pe esut muscular i numai 10% pe esut fibros.
Aceste observaii vin n sprijinul teoriei c celulele satelite particip la
procesul de regenerare i hipertrofie muscular, reprezentnd precursori ai
fibrelor musculare adulte.
Datele prezentate n studiu sunt deschise unei mari varieti de
interpretare. De exemplu, este posibil ca activarea celulelor satelit s fie
stimulat de ctre procesul lezional prin el nsui. n aceast variant IGF I
poate exercita iniial efecte anabolice, iar numai ulterior s stimuleze producerea
i recrutarea de celule satelit prin intermediul unor factori cum ar fi de exemplu
FGF-2. n plus IGF I are o aciune de reducere a producerii de esut fibros,
astfel nct regenerarea s se fac ct mai aproape de structura iniial.
EXPERIMENTUL 5
obolani n vrst de 2- 5 luni au fost anesteziai prin injecie
intraperitoneal a 87 miligrame/kg de ketamin i 13 miligrame/kg xylazin,
dup care s-a realizat o incizie de 3 mm la nivelul muchiului tibial anterior.
Aceast lezare s-a fcut cu ajutorul unei foarfece chirurgicale, iar la diferite
momente dup leziune animalele au fost eutanasiate folosind inhalare de CO 2 ,
pentru ca apoi s li se ndeprteze muchii TA folosind metode de disecie
standardizat.
Analiz histologic
Muchii izolai au fost inclui n OCT i apoi ngheai n azot lichid.
Pentru analiza histologic 10 seciuni transversale n grosime de 12 14 microni
au fost colectate de-a lungul ntregii lungimi a muchiului la intervale de 400
500 microni i colorate cu hematoxilin eozin (HE). Toate analizele i
fotografiile au fost realizate cu un microscop Nokia Eclipse cu camer video
incorporat i cu program de analiz a imaginii LUCIA NET instalat pe un PC
PENTIUM 4 , inter inside.

13

n experimentele de analiz a regenerrii musculare s-au folosit metode

standardizate de morfometrie. Acestea constau n analiza seciunilor ce conin
cea mai mare arie de leziune muscular selectat pentru a fi msurat. Poriunea
medie a acestei zone lezionale, definit ca fiind regiunea cea mai interesat, i
cea mai puin regenerat a fost vizualizat la obiectivul cu mrire x 10 , iar
imaginea a fost capturat pe ecranul computerului. Aria de seciune transversal
(CSA) i numrul total al nucleilor centrali ai fibrelor de regenerare au fost
numrate pe o suprafa reprezentnd un cmp microscopic de 0,5 0,3
milimetri2 la momente diferite dup leziunea muscular. Aceast metod de
analiz este reproductibil i poate fi folosit n studii inter-observatori (n=4)
folosind aceleai metode de analiz.
De exemplu , ntr-una din examinri rezultatele au fost identice n 96,2%
din cazuri. Din cauz c au fost folosite mai multe eantioane pentru
determinarea timpilor de regenerare medii, diferenele mici nregistrate nu
afecteaz rezultatele finale. Nu au existat diferene nici ntre dimensiunea ariei
lezate i nici ntre procentul de celule regenerate la loturile de experiment.
Pentru analiza miofibrelor CSA la muchii care nu au fost secionai, s-au
folosit markeri anatomici la nivelul acelorai regiuni pe diferite eantioane
folosite pentru comparaie. Fiecare seciune a luat n calcul ntre 100 i 250 de
miofibre corespunztoare unui cmp microscopic de 0,3 mm2. Pentru analiza
statistic s-a folosit testul Student care ia n considerare parametrul t n analiza
semnificaiei diferenelor ntre valorile nregistrate.
Rezultate
Studiul i-a propus determinarea modului prin care se regenereaz
muchiul n cazul leziunilor chirurgicale sub aciunea factorilor de cretere.
Pentru aceasta am comparat regenerarea n muchii la care s-a administrat
factori de cretere fa de cei la care s-a administrat soluie de ser fiziologic.
Rezultatele ateptate au fost acelea c procesul de regenerare este mai accelerat
i mai eficient la animalele crora li s-a administrat factori de cretere. Tabelul
14

de mai jos ofer datele statistice comparative ntre loturile martor i cel de
experiment la care s-a adugat parametrul de variabilitate numit abatere
standard.
Regenerarea muchilor tratai cu factori de cretere este accelerat
comparativ cu lotul martor n special n perioada de dup 10 zile de la
secionarea chirurgical. La microscop exist o mai mare cantitate de fibre de
diametru mic rezultate prin transformarea celulelor satelit n fibre musculare
adulte. Cantitatea de esut fibros este mai mare cu 30% n cazul lotului martor
tratat cu soluie de ser fiziologic.
S-au nregistrat i modele diferite de regenerare a fibrelor musculare.
Astfel, media nucleilor miofibrelor a rmas constant la lotul tratat cu factori
de cretere n timp ce la lotul tratat cu soluie ser fiziologic aceast medie era
diferit n funcie de regiunea aflat mai aproape sau mai departe de locul
leziunii. Rata de cretere i regenerare reprezentat de numrul de fibre
musculare nou formate n unitatea de timp a fost constant la lotul experimental
tratat cu factori de cretere spre deosebire de lotul martor la care aceast rat a
prezentat variaii de la un interval de timp la altul. Densitatea miofibrelor
regenerate a fost mai mare cu cca.30% n cazul lotului experimental i n plus
cantitatea de esut fibros a fost mult mai mic luate mpreun la lotul de
experiment fa de lotul martor. Modificrile nregistrate se datoreaz capacitii
regenerative accentuate a fibrei musculare n condiiile administrrii factorilor
de cretere.
EXPERIMENTUL 6
Introducere
Expansiunea i proliferarea celulelor stem sunt importante pentru
transplantul i regenerarea esuturilor. Exist mai multe categorii de celule
precursoare ale fibrei musculare prezente n muchiul striat adult , aceste celule
reprezentnd doar un mic procent din totalitatea celulelor care compun structura
muchiului. n acest experiment vom examina potenialul anumitor factori de
15

cretere n stimularea i activarea celulelor satelit care regenereaz dup un

model matematic unic de cretere exponenial. Cinetica creterii populaionale
este influenat n prezena suplimentrii mediului celular cu factori de cretere
din categorie somatomedinelor (IGF I i IGF II). Timpul de diviziune i
fracia mitotic a celulelor active au fost analizate pe baza unor parametrii cheie
ai regenerrii musculare care st la baza mecanismului de expansiune a
populaiilor de celule stem. Experimentul a fost realizat pe celule izolate din
muchiul striat proaspt rezultate prin recrutarea celulelor aflate n faza de
repaus a ciclului celular n prezena factorilor de cretere.
Material i metod
S-a folosit un mediu de cultur pe care au fost cultivate celule derivate de
la obolani din rasa Sprague Donan n vrst de 3 sptmni din muchiul
tibial anterior secionai cu ajutorul unei foarfece chirurgicale.
Au fost identificate i numrate celulele satelit (SC) din proba de esut
recoltat, acestea au fost trecute apoi pe un mediu de cultur Dubecco modificat
eagle care conine 5% ser de cal, 5 %ser fetal, 1,25 % extract de embrion de
gin i 1% antibiotic (penicilin plus streptomicin 10.000 uniti penicilin i
10 micrograme la mililitru streptomicin) la 37 de grade i 5 % dioxid de
carbon.
Factorii de cretere folosii au fost IGF I recombinant 100
miligrame/mililitru adugat zilnic la mediul de cultur.
Rezultate nregistrate
Numrul de celule satelit la un anumit timp depinde de doi parametrii:
unu reprezentat de fracia mitotic i doi de administrarea factorilor de cretere.
Modelul de cretere celular este cel reprezentat mai jos descris de Sherley i
colaboratorii dup urmtoarele ecuaii:
Conform acestui model, procentul de celule mitotic active (fracia de
diviziune) este notat cu , i este determinat folosind att durata ciclului celular
ct i datele referitoare la creterea populaional, obinute din experiment.
16

Creterea coloniilor a fost observat la o densitate de 450 de celule pe

unitatea de centimetru ptrat pe mediul de cultur descris mai sus. Factorii de
cretere au fost adugai la intervale de 60 de ore n mediul de cultur. Aderarea
celulelor la mediul de cultur a durat ntre 6-12 ore. Folosind analiza de imagine
microscopic s-a obinut o variaie a populaiilor celulare care reprezint
creterea coloniilor de celule satelit. Pentru asigurarea unei temperaturi
constante s-a folosit un incubator care s asigure o temperatur constant de 37
de grade. Pentru compararea dimensiunilor s-au analizat grupe formate din patru
pn la 6 celule stem. Poziiile coordonate ale cmpului microscopic au fost
asigurate de programul de analiz de imaginii pentru fiecare populaie celular
luat n studiu.
Durata ciclului celular a fost analizat pentru 100 de celule prin
intermediul observaiilor directe. Fiecare ciclu celular a fost cuprins ntre dou
diviziuni celulare succesive.
Fracia mitotic a fost determinat prin intermediul datelor legate de
creterea populaiilor n funcie de modelul de ecuaii descris mai sus.
Aproximativ ase curbe de cretere au fost nregistrate la celulele tratate cu
factori de cretere i au fost analizate statistic pentru determinarea parametrului
.
Testele de semnificaie statistic sunt : testul Student modificat i testul t.
Ciclul celular a fost analizat statistic lund n considerarea semnificaia testelor
dac parametrii nregistrai erau situai la un nivel P< 0,05.
Rezultate
Figura 1 furnizeaz reprezentarea schematic a sistemului de cultur de
celule i modul de obinere a datelor prin folosirea acestui sistem. S-a luat n
calcul o sum de 575 de imagini la fiecare 10 minute. Datele prezentate
proliferarea celular nregistrat sub form de informaie video.
Creterea celular a fost semnificativ mai mare n prezena factorilor de
cretere la 72 i 96 de ore de la administrarea acestora. Comparativ , dac n
17

mediul de cultur s-a administrat doar soluie de ser fiziologic , creterea a fost
cu 25 pn la 40% mai redus.
Durata ciclului celular
Media duratei ciclului celular la lotul martor a fost de 15,8 3,8 ore iar
pentru populaia tratat cu factori de cretere a fost de 8,5 4 ore.
Fracia mitotic
A fost evaluat prin examinarea parametrului , care arat proliferarea i
cinetica creterii celulare n cazul celor dou populaii , dintre care evideniaz
celulele mitotic active redate n fracie procentual. Numrul total de celule N la
interval de 12 ore este semnificativ mai mare n cazul lotului tratat cu factori de
cretere (P< 0,05) fa de lotul tratat cu ser fiziologic (lotul martor). Populaia
mitotic activ a fost de 86% la lotul de experiment fa de numai 42% la lotul
martor.
Pe baza acestor rezultate putem concluziona c exist un mecanism de
rspuns difereniat la stimularea cu factori de cretere a celulelor satelit, ceea ce
duce la o activare a procesului de regenerare i la o scurtare a timpului de
refacere a muchiului lezat. Metodele folosite pot fi aplicate i la subiecii umani
sub forma administrrii locale de factori de cretere injectabili din categoria
somatomedinelor care s exercite un rol activ n regenerarea i vindecarea
muchilor striai.
EXPERIMENTUL 7
Leziunile musculare sunt foarte frecvente. Factorii de cretere sunt
stimulatori ale proliferrii i fuziunii mioblatilor pe medii de cultur. De aceea,
am administrat aceti factori de cretere la obolani la care am realizat
secionarea muchiului gastrocnemian. Regenerarea muscular a fost evaluat la
o sptmn prin analiz microscopic a pieselor histologice pe baza
morfometriei comparate. Refacerea muchiului a fost determinat prin creterea

18

capacitii contractive msurate la o lun dup lezarea muchiului. S-a constatat

c factorii de cretere poteneaz regenerarea muchiului n comparaie cu
muchii care s-au regenerat natural. La o lun muchii tratai cu IGF I au
dovedit o mbuntire a vindecrii i o semnificativ cretere a tonusului i
forei musculare. Rezultatele noastre sugereaz c administrarea de IGF I
accelereaz vindecarea muchiului i pot avea un efect considerabil n
tratamentul leziunilor musculare.
Traumatismele musculare sunt frecvente, cu o inciden de 10 55 % n
cazul sportivilor. Ele se clasific n afeciuni de ruptur muscular sau distrugere
a continuitii esutului conjunctiv, fiind afectate

n aceeai msur fibrele

musculare.
Exist trei faze ale procesului de vindecare a muchiului lezat. Faza de
distrugere este caracterizat prin formarea unui hematom, necroza esutului
muscular, degenerarea urmat de rspuns inflamator. Faza de reparaie include
fagocitarea esutului afectat , regenerarea muchiului striat, producerea de esut
conjunctiv de reparaie i cretere capilar. La finalul fazei de remodelare,
muchii regenerai se maturizeaz i se contract cu organizarea esutului
cicatriceal. Exist adesea o recuperare incomplet a capacitii funcionale la
muchii traumatizai.
Regenerarea miofibrelor ncepe cu activarea celulelor precursoare
miogenice numite celule satelit, localizate ntre lamina bazal i membrana
plasmatic a fiecrei fibre musculare n parte. Celulele satelit prolifereaz i se
difereniaz n miotubi multinucleai i n final n fibre musculare adulte. Muli
din aceti mioblati sunt capabili s fuzioneze cu fibrele musculare necrozate
deja existente i pot preveni ca muchiul s se degenereze complet. n acelai
timp fibroblatii invadeaz spaiul de ruptur dintre fibre i ncep s produc
matrice extracelulare pentru refacerea tramei de esut conjunctiv. Rolul
fiziologic al acestei populaii este de a transmite o legtur de-a lungul
defectului de ruptur astfel nct membrul lezat s fie folosit nainte ca procesul
19

de reparaie s fie complet. n cazul leziunilor musculare extensive, proliferarea

fibroblatilor poate duce rapid la o formare excesiv de esut cicatricial dens,
ceea ce mpiedic regenerarea muchiului i determin recuperarea incomplet.
Acest efect a fost observat n multe tipuri de leziuni cum ar fi alungiri, contuzii,
lacerri musculare.
Factorii de cretere sunt pectide mici care se leag de membranele
receptorilor pentru a influena variatele etape ale creterii i dezvoltrii celulare
prin intermediul unor ci de semnalizare celular. S-a mai artat c factorii de
cretere sunt capabili de a stimula producerea de proteine de ctre celulele
musculare striate. n timpul regenerrii musculare se presupune c exist o
eliberare de substane trofice de ctre muchiul lezat, ceea ce activeaz celulele
satelite i determin creterea i dezvoltarea fibrelor musculare. Muli factori de
cretere au fost dovedii c intervin n rspunsul la leziunea muscular datorit
capacitii lor de a recruta i accelera sinteza celulelor satelit.
n studiile anterioare s-a demonstrat c factori de cretere de tipul IGF I
sunt stimulatori poteniali ai fuziunii mioblatilor n mediile de cultur. Scopul
experimentului este de a demonstra efectul acestor factori de cretere pe animal
n cadrul regenerrii dup traumatismul muscular i evaluarea influenei lor
asupra vindecrii muchiului.
Materiale i metode
S-au folosit obolani din rasa Sprague Donan de sex feminin de la
aceeai mam crescui n biobaza Facultii de Biologie din Universitatea Piteti.
S-au secionat ambii muchi gastrocnemieni de la 6 obolani la 60 % din
distana de la inseria osoas pe jumtate din grosimea lor i apoi au fost suturate
cu ace de sutur folosind un fir de sutur PDS 7,0. Avantajele acestui model sunt
reproductivitatea sa i capacitatea de a asigura o aplicare precis a injeciilor la
sediul de incizie. Severitatea leziunii a fost demonstrat prin apariia unui
hematon i a unei zone de inflamaie datorate rspunsului la factorul traumatic.

20

Doi obolani au primit o injecie cu IGF I n membrul posterior drept n

zilele 1, 3 i 5 dup secionare. Firul de sutur a servit ca zon de delimitare
pentru injectarea factorului de cretere direct n leziune. Eliberarea factorului de
cretere la sediul leziunii este important deoarece timpul de njumtire
biologic ct i ndeprtarea prin curentul de snge duce la dispariia rapid a
acestei substane din zona lezat. Membrul posterior stng a fost injectat cu
acelai volum de soluie de ser fiziologic i a reprezentat lotul martor. Dozele de
factor de cretere injectate au fost determinate n funcie de experimentele
anterioare (experimentul 2 i 3). Dozele eficiente au fost de o sut de ori mai
mari dect n cazul culturilor de celule. Din cauza dimensiunilor mici ale
animalelor de laborator s-a ales cantitatea de nanograme pe mililitru care este de
o sut de ori mai mare dect cantitatea folosit pe medii de cultur.
Pe durata procesului de regenerare muscular IGF I este prezent n
spaiul extracelular la 8 ore dup administrare, nregistrnd un vrf la 24 de ore,
cu o descretere lent a nivelului de concentraie ntr-o perioad de o sptmn.
De aceea, pentru a acoperi perioada de expresie a factorilor de cretere,
injeciile au fost administrate la 1, 3 i 5 zile dup traumatism.
Animalele au fost sacrificate prin inhalare de CO

urmat de dizlocare

cervical la 7 zile dup leziune. Muchii gastrocnemieni au fost izolai i

ngheai n 2 metilbutan sub aciunea azotului lichid. Nivelul de regenerare
muscular la diferite intervale dup leziune a fost evaluat prin tehnici histologice
de morfometrie. Examinarea cantitativ:
La o sptmn dup injecie, numrul de miofibrre regenerate la
membrul injectat i la membrul de control a fost numrat prin seciuni colorate
cu hematoxilin eozin i examinate video microscopic. Fiecare prob a fost
numerotat , iar numrarea celulelor s-a realizat cu ajutorul unui sistem LUCIANET de analiz morfometric. Celulele satelite prezint nuclei situai central i
reprezint fibre musculare aflate n regenerare. Nu s-au luat n considerare
nucleii care nu prezentau citoplasm nconjurtoare. S-a msurat diametrul a
21

200 de fibre musculare de regenerare pe 10 cmpuri microscopice luate la

ntmplare cu ajutorul unei vize micrometrice. Numrul i diametrul mediu al
fibrelor regenerate a fost calculat i comparat cu cel al membrului de control la
care nu s-a administrat factori de cretere.
Evaluarea factorilor de cretere n muchiul care se vindec la o lun s-a
fcut astfel: ambii muchi gastrocnemieni de la 36 de obolani au fost secionai
i reparai dup metoda de mai sus. S-a administrat IGF I la sediul de leziune
la 12 obolani n zilele 1, 3 i 5 dup traumatism cu acelai volum de soluie de
ser fiziologic administrat n membrul contralateral. La o lun dup leziune 3
animale au fost sacrificate , crora li se administrase factori de cretere, iar
muchi lor au fost preparai pentru examen histologic dup metoda de mai sus.
Vindecarea muscular a fost observat pe seciuni colorate cu hematoxilin i
eozin.
Proprietile contractile
Evaluarea fiziologic a proprietilor contractile s-a fcut pe celelalte 9
animale rmase dup sacrificarea grupelor anterioare. Asupra lor s-a aplicat o
tensiune extern din 20 mN. S-au obinut contracii izometrice msurate cu
ajutorul unor dinamometre. Datele obinute au fost stocate pe computer folosind
un program de achiziii de date. Amplitudinea stimulrii i a contraciilor
consecutive s-a msurat dup 20 de minute de echilibrare n cmp electric prin
intermediul a 2 electrozi poziionai la captul iniial i cel final al organului
muscular. Durata stimulrii pentru fiecare muchi a fost de 0,25 ms la un voltaj
maxim de 50 V. n primul rnd stimularea de 1 Hz a fost aplicat la punctul de
maxim ncordare pentru obinerea unor contracii tetanice. Stimularea a durat
0,5 secunde i a determinat o scurtare a muchiului pe o treime din lungimea sa.
Msurtorile obinute au fost apoi raportate pe unitatea de greutate a muchiului
i exprimate n mN/g.
Analiza statistic

22

Pentru studiul regenerrii diametrele fibrelor au fost comparate la

muchiul experimental i cel contralateral folosind parametrii testului Student i
a testului t. Analiza statistic a fost fcut pe numrul de fibre de regenerare i
pe numrul de nuclei ai acestora. n ceea ce privete evaluarea capacitii
fiziologice contractile , aceasta s-a fcut pe informaiile obinute n partea a doua
a experimentului i datele au fost comparate cu cele din literatura de specialitate.
Rezultate
I.Evaluarea regenerrii musculare
Muchii crora li s-au administrat factori de cretere au prezentat
numeroase fibre de regenerare la locul de leziune. Acestea au fost prezente
uniform pe toat suprafaa regiunii traumatizate att n zona superficial ct i n
cea intermediar i profund a muchiului. La muchiul de control s-a obinut o
anumit regenerare predominant localizat n regiunea profund a zonei
traumatizate. n regiunea superficial a membrelor de control s-a nregistrat un
infiltrat inflamator cu celule mononucleare de mari dimensiuni comparativ cu
fibrele de regenerare.
Analiza histologic cantitativ a luat n calcul numrul i diametrul
fibrelor musculare de regenerare. Toate celulele cu nuclei centrali prezente n
zona lezat au fost numrate i li s-a msurat diametrul celular. A existat o
cretere a numrului de fibre de regenerare n muchii la care s-a administrat
factori de cretere de 3,5 ori mai mare fa de lotul de control. Diametrul mediu
al fibrelor musculare regenerate a fost de 31,3 micrometri pentru lotul de control
i de 37,4 la lotul tratat cu IGF I.
Evaluarea efectului factorilor de cretere pe muchiul n vindecare la o
lun s-a fcut comparativ la membrul netratat n care erau prezente numeroase
celule cu nuclei centrali dar i o cantitate mare de esut inflamator i conjunctiv.
Superficial, exista un strat de acoperire de esut cicatricial fibroblastic care
mpiedica regenerarea fibrelor

musculare. n schimb, la muchiul tratat cu

factor de cretere fibrele musculare regenerate au fost localizate uniform att n

23

zona profund ct i n cea superficial a muchiului. Diametrul lor a fost

asemntor cu al miofibrelor normale nconjurtoare i muli dintre nucleii lor se
localizaser deja periferic. Dezvoltarea esutului fibroblastic a fost redus la
muchii tratai. Aceste date sugereaz c vindecarea muchiului a fost accelerat
sub influena factorilor de cretere comparativ cu lotul de control. n zona
superficial, miofibrele de regenerare au diametrul mai mic iar esutul
fibroblastic este mai frecvent. Aceti muchi au acelai aspect histologic ca i
lotul de control.
Proprietile contractile
La o lun dup traumatism, capacitatea contractil a fost mai crescut la
muchii tratai cu IGF I. Pentru a reduce variaiile statistice ntre animalele
comparate, datele au fost normalizate innd seama de parametrii variaiei ntre
cele dou loturi. Fora de contracie a fost crescut la 76 Mn/g la lotul tratat cu
IGF- I fa de 45 Mn/g la lotul de control. Fora de contracie tetanic variaz i
n funcie de cantitatea de factori de cretere administrat , astfel nct diferena
poate fi considerat semnificativ statistic.
Discuie
Dezvoltarea folosirii factorilor de cretere permite o recuperare mai rapid
i mai complex semnificativ n comparaie cu loturile de control. Este
necesar injectarea acestor factori de cretere direct la locul leziunii pentru a
obine un efect semnificativ.
IGF I s-a dovedit un stimulator potenial al proliferrii i fuziunii
mioblatilor la animalele de laborator. Aceste date iniiale confirm studiile
anterioare conform crora IGF I stimuleaz proliferarea la bovine i la pui pe
medii de cultur. Mecanismele de stimulare ale proliferrii celulare sunt
reprezentate de trecerea celulelor satelit din faza G0 n faza G1 a ciclului celular.
Este important de recunoscut c regenerarea in vivo este un proces mai
complex dect regenerarea in vitro datorit implicrii factorului circulator i
factorului nervos. Anumite caracterizri preliminarii ale rolului factorilor de
24

cretere n timpul regenerrii sugereaz c efectele lor individuale sunt mai

reduse dect dac aceti factori sunt asociai ntre ei.
Am observat o cretere a numrului i dimensiunilor fibrelor musculare
regenerate (o cretere a indexului de regenerare). De asemenea, pe modelul
nostru miofibrele regenerate sunt localizate n zona superficial a suprafeei
lezate numai n cazul n care aceasta este tratat cu factori de cretere, ceea ce
demonstreaz potenialul lor crescut de vindecare cnd muchiul este tratat cu
aceste substane.
Discrepana ntre rezultatele obinute n culturile celulare fa de cele de la
animale de laborator se datoreaz interveniei vascularizrii i inervrii
suplimentrii de care beneficiaz esutul regenerat la animalul viu.
Factorii de cretere specifici au n plus fa de capacitatea de a mbunti
regenerarea muscular i o capacitate de a vindeca muchiul n ansamblu.
Aceasta se observ dup o lun de tratament la animalele crora li s-a
administrat IGF I , la care a fost accelerat vindecarea i recuperarea
funcional comparativ cu lotul de control, n plus asociindu-se o reducere a
ariilor de fibroz. Injectarea factorilor de cretere reduce formarea de esut
cicatriceal n muchi, mai ales cnd este combinat cu ageni antifibrotici de
tipul decorinei. mbuntirea activitii funcionale a muchilor tratai cu factori
de cretere la o lun dup leziune a fost de 200 % n cazul administrrii de IGF I . Un muchi tratat va putea deci, s genereze o mai mare for muscular mai
devreme dect unul netratat i s realizeze un nivel de performan mai ridicat
ntr-un timp mai scurt.
Rezultatele se dovedesc importante n termenii tratamentului oricrei
variantei de lezare muscular i pot oferi o mai bun calitate a vindecrii
esutului muscular. n ciuda capacitii regenerative crescute, rspunsul
muchiului la traume majore implic n mod tipic producerea masiv de esut
fibrotic dens cicatriceal ntre zona lezat i fibrele musculare normale. Prin
creterea potenialului regenerativ devine posibil prevenirea cicatricelor post
25

contuzionale i a riscului reducerii potenialului de recdere i reapariie a

leziunilor atunci cnd esutul cicatriceal este n exces.
n concluzie, studiul a demonstrat c injeciile succesive cu IGF I n
muchii traumatizai duc la o mbuntire semnificativ a vindecrii pe animale
de laborator.
EXPERIMENTUL 8
Material i metode
obolani din rasa Sprague Donan n greutate de 250 300 gr i vrsta
10-12 sptmni au fost mprii n mod egal n 5 grupe de experiment i 2
grupe martor. Grupele martor includ animale netratate plus un grup tratat cu
soluie ser fiziologic. S-au luat n studiu animale tinere deoarece acestea prezint
un potenial mai mare de regenerare dect cele vrstnice. S-au luat n experiment
animale anestiziate cu halotan dizolvat n 3 % oxigen ntr-un flux de 2 litri/minut
meninut timp de o jumtate de or. Membrul inferior stng n treimea
superioar a fost brbierit pentru a evidenia muchiul tibial anterior (TA) unde
s-a injectat 0,3 mililitri de soluie de bupivacain prin intermediul unei seringi
cu un ac de 13 mm , introdus la jumtatea distanei ntre capetele muchiului ,
sub un unghi de 45 de grade i avansnd proximal de-a lungul axului
longitudinal al muchiului. Dup injectare acul a fost retras lent pe msur ce
muchiul se expansiona . S-au recoltat probe de la muchiul injectat i cel
contralateral de la animalele din grupul experimental i de control. Dup 10-15
minute animalele i-au redobndit contiena. Ne-am asigurat c nu au suferit
durere n timpul perioadei de recuperare. Dup 25 de zile de la administrarea
injeciei animalele de experien au fost sacrificate i folosite pentru analiza
morfometric i determinarea concentraiei de celule satelit. Afectarea
muscular local a fost realizat prin aplicare de stimul electric. Pentru aceasta
s-a aplicat curent electric de 30 Hz n zilele 1, 5 i 7 n timp ce animalele erau
anesteziate. Dup aplicarea stimulului electric s-a produs marca electric nsoit
de leziuni musculare. La grupele experimentale s-a administrat IGF I n
26

concentraie 0,1% la locul de aplicare al stimulului electric , iar lotul martor s-a
aplicat soluie clorur de sodiu.
Prepararea esutului
Mostrele de esut recoltate au fost incluse n OCT i ngheate la 80 C cu
ajutorul azotului lichid. Seciunile rezultate au fost colorate cu hemotoxilin
eozin i trecute pe lame pentru a fi analizate la microscop.
Analiza distrugerii fibrelor i reparaia acestora
Protocolul folosit a luat n considerare numrarea celulelor satelit pe
unitatea de suprafa i volum comparativ la lotul martor cu lotul de experiment
iar rezultatele au fost analizate statistic cu ajutorul testului ANOVA i a testului
Student cu parametrul t.
Rezultate obinute
Imaginile obinute au fost prelucrate cu ajutorul sistemului de achiziie i
msurare a imaginii LUCIA-NET la un microscop Nikon-Eclipse E60 la care s-a
msurat frecvena regenerrii comparative ntre cele dou loturi.
Extinderea modificrilor morfologice s-a fcut pe durata a 24 de ore ,
msurndu-se cantitatea de esut afectat, volumul de infiltrat inflamator reactiv,
i cantitatea de celule satelit de regenerare.
Discuii
Datele prelucrate au demonstrat c aplicarea injectabil de IGF I a dus
la vindecarea muchiului ntr-un interval de 11 zile cu creterea cantitii de
fibre pe unitatea de volum i foarte puin esut conjunctiv cicatriceal. Aceasta se
datoreaz aciunii IGF I de stimulare a activitii celulelor satelit i de
transformare a acestora n celule musculare adulte. Fa de lotul martor, unde s-a
administrat soluie salin creterile au fost semnificativ mai accentuate (P<0,05).
EXPERIMENT 9
Introducere
Se cunoate c muchiul scheletic la mamifere este capabil de o
regenerare parial dup ce a fost lezat, dar mecanismele celulare implicate sunt
27

nc subiect de dezbatere. Studii histologice care analizeaz stadiile precoce ale

reparaiei dup trauma mecanic vizeaz miogeneza creterii sarcoplasmei i
numrului de nuclei ai fibrelor musculare. Aceste celule multinucleate sunt
intens bazofile i se numesc sarcoblaste. Acest termen este utilizat i de ctre
prezenta lucrare. Dou explicaii ale modalitilor prin care se formeaz miotubii
sunt n dezbatere: prima este ipoteza continu (teoria nmuguririi) care
postuleaz creterea muchiului din capetele viabile secionate ale fibrelor prin
intermediul mugurilor sarcoplasmatici nucleai care fuzioneaz rapid pentru a
forma miotubi. A doua ipotez este teoria discontinu sau embrionar care
sugereaz c n primele stadii ale regenerrii celulele mononucleate (mioblatii)
apar n aria lezat unde prolifereaz i fuzioneaz pentru a forma miotubi
multinucleai. Acetia nu sunt la nceput conectai cu capetele secionate ale
fibrelor originale.
Puine studii sublinia c miotubii s-ar forma prin ambele procese. n
general susintorii teoriei continue au inclus n experimentele lor afectri mai
severe ale fibrelor musculare n timp ce susintorii teoriei discontinue au inclus
leziuni mai superficiale. Este posibil s existe dou feluri de reparaie relativ la
severitatea leziunii. Acest experiment ncearc s stabileasc dac modalitile
de regenerare continu , respectiv discontinu apar n funcie de tipul de leziune
implicat n afectarea fibrelor musculare individuale i a nveliurilor lor
sarcolemale.
Materiale i metode
obolanii aduli din rasa Wistar Arbino cntrind ntre 150-200 g au fost
anesteziai i li s-a pus n eviden sub anestezie muchiul latissimus dorsi de pe
partea stng . La primul grup s-a efectuat o seciune de 5 mm lungime
transversal la captul superior al muchiului cu ajutorul unui bisturiu curb. La al
doilea grup captul superior a fost zdrobit pentru 2 secunde cu ajutorul unui
forceps aplicat asupra zonei fr a fi lezat membrana bazal i straturile
profunde. La o perioad dup operaie, obolanii au fost sacrificai, 3 deodat, cu
28

cloroform. Pentru examenul la microscop ntregul animal a fost fixat n formol,

eantioane din aria lezat fiind ndeprtate dup fixare. Seciune la parafin au
fost colorate fie cu hematoxilin eozin , fie cu albastru de metilen.
Secionarea muchiului
Aria lezat a muchiului secionat n primele dou zile a fost infiltrat
intens cu polimorfo nucleare i macrofage

29

30