Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Bogdan Laura-Teodora
n 1776 omul de tiin italian Lazzaro Spallanzani a ncercat pentru prima dat
crioconservarea spermei n zapad i a observat c spermatozoizi erau mobili dup decongelare.
La sfiritul secolului IX i nceputul secolului XX, oamenii de tiina elucideaza cteva aspecte
legate de adaptarea a materiei vii, n special plante i fungi.
O contribuie remarcabila a avut-o Father Luyet, care este considerat fondatorul
criobiologiei. n 1938 Luyet i Hodapp au realizat vitrificarea spermei de broasca si stocarea n
azot lichid. n 1985 au raportat vitrificarea cu succes a unor embrioni de oarece. Din 1990
vitrificarea a fost aplicat i pentru ovocite i esut ovarian.
Crioconservarea este un proces n cazul n care celule sau esuturi ntregi sunt
conservate prin rcire, sub-zero temperaturi sczute, cum ar fi (de obicei) 77 K sau -196 C
(punctul de fierbere de azot lichid). La aceste temperaturi sczute, orice activitate biologic,
inclusiv reacii biochimice care ar conduce la moartea celulelor, este efectiv oprit. Cu toate
acestea, atunci cand solutiile crioprotector nu sunt utilizate, celulele fiind conservate sunt de
multe ori avariate din cauza congelarii n timpul abordarea la temperaturi sczute sau nclzirea
la temperatura camerei.
Temperatura
Deozitarea produselor criogenate la temperaturi foarte sczute presupune a oferi o durat
nedeterminat, dac nu chiar n apropierea de infinit, longevitatea la celule, dei real "termenul
de valabilitate", este destul de dificil de dovedit. n experimentele cu uscate, semine,
cercettorii au constatat c nu a existat variabilitate ,deteriorare evident n cazul n care
probele au fost inute diferit "ngheate" la temperaturi ultra-chiar i cele rece. Temperaturi sub
punctul de tranziie de sticl (Tg) de ap (n jur de minus 136 C), par a fi acceptate ca limite n
care activitatea biologic foarte substanial ncetinete, i minus 196 C (fazei lichide de azot
lichid) este temperatura preferat pentru depozitare a exemplarelor importante. n timp ce
frigidere, congelatoare profund i extra congelatoare rece adncime, toate similare cu cele
interne, sunt utilizate pentru multe elemente, n general, ultra rece de azot lichid la -196 C este
necesar pentru conservarea cu succes a structurilor mai complexe biologice pentru a opri
aproape toate activitiile biologice.
Riscuri
Fenomene care pot cauza deteriorarea celulelor n timpul crioconservari au loc n
principal n timpul etapei de congelare, i includ: soluie de efecte, formarea extracelulara de
ghea, deshidratare i formarea intracelular de ghea. Multe dintre aceste efecte pot fi reduse
prin cryoprotectants.
Atunci cnd au ajuns n faza de congelate, materialul este relativ conservat n condiii de
siguran fata de viitoarele daune(distrugeri). Cu toate acestea, estimri bazate pe acumularea de
radiaii induse de deteriorarea ADN-ului n timpul depozitrii criogenice au sugerat o perioad
maxim de depozitare de 1000 de ani .
Efecte si soluii
Deoarece cristalele de ghea cresc dizolvarea substanelor n ap de congelare- sunt
excluse,pt ca le determin s devin concentrate n ap rmasa lichid. Concentraii ridicate din
unele substane dizolvate poate fi foarte duntoare.
O celula sau un esut care va fi supus procesului de crioconservare, trebuie sa
ndeplineasc cteva condiii: sa fie o celula sau esut sntos, s nu fie contaminat cu
microorganisme si s fie ntr-un stadiu care s-i permit folosirea dup decongelare ( cu potenial
de diviziune).
Formarea extracelular de ghea
Atunci cnd esuturile sunt rcite lent, apa migreaz din celule i forme de ghea n
spaiul extracelular. Prea mult ghea extracelulara poate provoca leziuni mecanice membranei
celulelor din cauza de zdrobire.
Deshidratarea
Migraia de ap care cauzeaz formarea extracelulara de ghea poate provoca, de
asemenea, deshidratarea celulelor. Asociate pe celul pot provoca daune n mod direct.
Formarea intracelular de ghea
n timp ce unele organisme i esuturi pot tolera ceva ghea extracelulara, orice ghea
semnificativ intracelulara este aproape ntotdeauna fatala n celule.
Prevenirea riscurilor
Vitez controlat-i congelare lent sunt bine stabilite tehnici de pionier la nceputul anilor
1970, care a permis embrionului uman prima natere congelata (Zoe Leyland) n 1984. De
atunci, mainile care congeleaza probe biologice utiliznd paii programabili, sau ratele
controlate, au fost utilizat n ntreaga lume pentru a oamenilor, animalelor i biologiei celulare"nghearea joasa" o prob pentru o mai bun pstrare, pentru decongelare n cele din urm,
nainte de a fi congelate, sau crioconservate, n azot lichid. Aceste maini sunt utilizate pentru
nghearea ovocitului, a pielii, a produselor din snge, embrionilor, spermei , celulelor stem i
conservarea general de esut n spitale,in practicile de uz veterinar iin laboratoarele de
cercetare din ntreaga lume. Ca un exemplu, estimrile au pus numrul de nateri vii de la lent
ngheate ", la aproximativ 300.000 de la 400.000 sau 20 de embrioni congelai '% din cele
aproximativ 3 milioane nateri din fertilizarea in vitro.
Letala este nghearea intracelulara, care poate fi evitat dac rcirea este destul de lenta
pentru a permite suficient apei de a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidului
extracelular. Aceast rat difer ntre celulele de diferite dimensiuni i o permeabilitate a apei: o
rat tipic de rcire n jur de 1 C / minut este adecvat pentru multe dintre celulele mamiferelor
dup tratamentul cu crioprotectori, cum ar fi glicerolul sau sulphoxidul de dimetil, dar rata nu
este un optim universal.
Mai multe studii independente au furnizat dovezi c embrionii congelai stocati ,utiliznd
tehnici de congelare lent-ar putea, n anumite moduri s fie "mai buna" dect n stare proaspt
a fertilizarii in vitro.Studiile au fost prezentate Societatii Americane de Medicina Reproductiva la
conferinta din San Francisco, SUA, 2008. Studiile indic faptul c folosind embrioni congelai,
mai degrab dect embrioni proaspei a redus riscul de ft mort i natere prematur dei
motivele exacte sunt nc explorate.
Crioconservarea gameilor, esutului ovarian sau testicular au aplicabilitate n pacienii
oncologici naintea nceperii chimio sau radioterapiei.
n reproducerea uman asistat se folosesc n mod curent dou metode de congelare.
1. Congelarea lenta ( Slow freezing) dupa cum i spune i numele congelarea se face
lent, scaderea punctului de nghe fcndu-se progresiv, volumul intracelular al apei ramnnd n
echilibru cu cel extracelular, deshidratarea celulei facndu-se sub 0C ( n timpul congelrii), la
sfritul congelrii celula fiind deschidratat sau ramnd un volum foarte mic de apa.
Concentraia crioprotectanilor n congelarea lent este mai mica, iar timpul de expunere
al celulei la crioprotectant este mai mare. Stocarea ovocitelor i a embrionilor se face n paiete
care dupa ncarcare snt sigilate i introduse n azot lichid.
2. Vitrificarea ( congelarea rapida) reprezint o metode de congelare rapid prin
introducerea directa n azot lichid. Concentraia crioprotectaniilor pentru vitrificare este mai
mare dect n congelarea lenta, iar timpul de expunere este mai mic. Diferena dintre congelarea
lent i vitrificare const n faptul c expunerea celulelor sau esutului la o concentraie mai mare
de crioprotectani i introducerea directa n azot lichid previne formarea cristalelor de gheata i
astfel o supravieuire mai buna dup decongelare. Celula este deshidrat nainte de introducerea
n azot, iar rata de nghe este 20.000C/ minut fa de congelarea lent n care punctul de nghe
scade cu 1C/minut. Rata de nghe depinde de dispozitivul folosit pentru vitrificare. n practic
sint folosite dou sisteme de vitrificare nchis i deschis. Avantajele vitrificarii comparativ cu
congelarea lent provin din faptul c nu necesit dotari speciale, timpul alocat congelrii este
mult redus de la 2 ore la 5-15 minute n funcie de materialul congelat i mediul folosit, rata de
supravieuire dupa decongelare este superioara fa de congelarea clasic .
Vitrificarea
Cercettorii care au dezvoltat o nou tehnic, vitrificarea, din anul 2000 ca cerere pentru
a oferi beneficiile de crioconservare, fr deteriorri cauzate de formarea cristalelor de ghea. n
crioconservarea clinica, vitrificarea necesit de obicei adugarea de crioprotectori nainte de
rcire. Crioprotectorii acioneaza ca antigel: la cele mai mici temperaturi de congelare. Ei, de
asemenea, crec viscozitatea. n loc de cristalizare, soluia siroposa se transform ntr-o ghea
amorfa, se vitrifica. Vitrificarea de ap este promovat prin rcirea rapid, i poate fi realizata
fr crioprotectori de ctre o cdere extrem de rapid a temperaturii (megakelvins pe secund).
Rata de care este necesar pentru a atinge starea sticlos n ap pur a fost considerat a fi
imposibil pn n anul 2005.
Cele dou condiii de obicei necesare pentru a permite vitrificarea sunt o cretere a
vscozitatii i-o depresiune de temperatura de congelare. Multe substane dizolvate fac ambele,
dar molecule mai mari, n general, au efect mai mari, n special pe viscozitate. Rcirea rapid, de
asemenea, promoveaz vitrificarea.
n stabilirea metodelor de crioconservare, substantele dizolvate trebuie s ptrund
membrana celulelor, n scopul de a realiza viscozitatea a crescut i deprim temperatura de
congelare din interiorul celulei. Zaharurile nu ptrund cu uurin prin membrana. Aceste
BIBLIOGRAFIE