Structura Ig:

REACIILE IMUNOLOGICE
REACIILE AG-AC

REACIILE ANTIGEN-ANTICORP (REACIILE

SEROLOGICE)
Reacia Ag-Ac este determinat de interaciunea
specific dintre epitopii Antigenului i paratopii
Anticorpilor.

Reaciile Ac-Ac (reaciile serologice) au

dou direcii de aplicare practic:

I.

Seroidentificare: identificarea unui Ag

necunoscut (tulpini microbiene izolate
din diferite prelevate) cu ajutorul Ac
specifici cunoscui.
Serodiagnostic: identificarea unui Ac
necunoscut prin Ag omolog cunoscut
(coninut n diagnosticuri).

II.

INTERACIUNEA ANTIGEN-ANTICORP
I.
Faza specific: are loc interaciunea
dintre Ag i Ac specific corespunztor.
Este un fenomen rapid, invizibil, comun
pentru toate reaciile Ag-Ac. Decurge la
temperatura de 37 C, n prezena unui
electrolit (sol. fiziologic).
II.
Faza nespecific, vizibil a uniunii Ag-Ac,
se manifest prin precipitare, aglutinare,
liz, etc - fenomene determinate de
anumite condiii (valena Ac, dimensiunile
Ag, etc).

REACIA DE AGLUTINARE

 Reactii

de aglutinare activa (directa)

Aspect calitativ
Reactia poate fi efectuat pe lama de
sticl sau n tuburi.
Reactia pe lama

Reactia in tuburi
Reactia pozitiva se manifesta prin formarea
unui sediment cu aspect de umbrela
inversata la fundul tuburilor (peste 20-24
ore) i clarificarea lichidului. Aprecierea
intensitaii reaciei se efectueaza dupa
sistema de 4 plusuri (++++).
Celulele neaglutinate se sedimenteaza la
fundul tuburilor sub forma de buton sau inel
(reactie negativa). Lectura se face cu ochiul
liber sau folosind aglutinoscopul.

 Aspect

cantitativ
Metoda dilutiilor succesive
Iniial se efectueaz diluii succesive ale
serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) n care se
introduc ulterior cantiti egale de Ag.
Termostat 2 ore, apoi la t camerei 18-20
ore.
Aprecierea: cea mai mare diluie a serului
n care se manifest aglutinare de cel puin
3 + (+++) se numeste titrul anticorpilor
aglutinani (titrul serului aglutinant).

 Reaciile

de aglutinare pasiv
(indirect)
Aglutinarea pasiv const n fixarea unui
Ag solubil (sau al unui Ac) pe un suport
corpuscular inert, care nu intervine n
reacia Ag-Ac. n calitate de suport inert
pot servi hematiile, particule de latex,
cristale de colesterol. Suspensia de
particule sensibilizate cu Ag sau Ac este
pus n contact cu serul imun (respectiv cu
Ag), ca i n cazul aglutinrii directe.

Avantajele reaciilor indirecte: facilitatea

lecturii i sensibilitatea nalt.

Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiv) RHAI / RHAP

reacia de latex-aglutinare Ac sau Ag

sunt fixai pe particule de latex. Reacia se
efectueaz pe lama de sticl.

 Reacia

de Co-aglutinare.
La baza acestei reacii se afl
proprietatea unei bacterii Staphylococcus
aureus (tulpina Cowan) ce are n
componena peretelui celular proteina A - s
fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc.
Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu
ajutorul carora pot fi identificare Ag
respective
necunoscute.
Reacia
se
efectueaz pe lam.

 REACIA COOMBS

Sunt posibile 2 tehnici, n funcie de

prelevat:
1. direct
2. indirect

Tehnica Coombs direct. La un nou-nscut se

caut prezena Ac materni anti-Rh fixai pe hematii,
dac mama este Rh-. La aceste hematii suspecte
se adaug un ser anti-Ig uman.

Tehnica Coombs indirect. La o femeie

gravid Rh- Ac anti-Rh sunt prezeni n ser.

Reacia de inhibiie a hemaglutinrii

Reacia de inhibiie a hemadsorbiei

 REACTIILE

DE PRECIPITARE

Imunoprecipitarea se manifesta doar

atunci cand Ag solubil este amestecat cu
Ac corespunzator. Ea poate fi observat
sau n mediu lichid, sau solid, fiind sau
calitativ, sau cantitativ. Acestea sunt
reactii specifice dar putin sensibile, ce
necesita cantitati importante de anticorpi.

Condiiile de formare a reelei de precipitare:

Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)
Precipitarea maxima corespunde cu zona de
echivalen, unde Ac si Ag sunt in raport optimal
de concentraie, ce permite precipitarea tuturor
moleculelor de Ac cu Ag corespunzator. n exces
de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz.
Utilizare: n medicina legala (determinarea
apartenenei de specie a diferitor proteine:
snge, sperm, etc), n igiena alimentar
(depistarea
falsificrii
alimentelor),
n
diagnosticul maladiilor infectioase, etc.

PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID

Reactia de precipitare inelara
Avantajul metodei rapiditatea
i simplicitatea.
Utilizarea practica: identificarea
petelor de sange, depistarea falsificarilor
produselor alimentare, depistarea
antigenului polizaharidic al agentului
antraxului n omogenat de organe (reacia
Ascoli).

 PRECIPITAREA N

GEL)

MEDIU SOLID (N

n aceste reacii Ag i Ac difuzeaz

unul spre altul prin geloz i n zona de
concentraie optim a acestor dou
reactive se produce precipitarea sub
form de linii albe-cenuii. Dac exist
mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii
de precipitare distincte.

Imunodifuzie dubl
(tehnicile Ouchterlony i Elek)
Se acoper cu geloz o plac de sticl sau se toarn geloza
n cutia Petri.
n tehnica Ouchterlony Ag i Ac difuzeaz din godeurile
situate la o distan de 15 mm unul de altul.
n tehnica Elek cele 2 reactive difuzeaz din benzile de
hrtie plasate pe suprafaa gelozei.
Moleculele difuzeaz n gel n funcie de greutatea lor i
formeaz linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce
corespund n zona lor de echivalen. Dac dou Ag sunt
identice, liniile lor se unesc, dac sunt diferite se
intersecteaz. Utilizarea determinarea toxinelor
(toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

 REACII

DE CITOLIZ IMUN (cu participarea

complementului)

Reacia de bacterioliz (RBL)

- Ag suspensie de bacterii vii (vibrioni,
leptospire...)
- Ac serul imun sau serul bolnavului
- Complement

 RBL in

vitro
- Se efectueaz diluia succesiv a serului
- Se adaog suspensie microbian vie
- Se adaog complement
(martor: Ag+ser fiziologic+C)
- Incubare 2 h la 37C
- Rensmnare pe cutii cu geloz cte 0,1 ml din
fiecare diluie (24h 37 C)
- Lectura se compar nr coloniilor crescute din
martor i probele studiate
- Titrul cea mai mare diluie a serului n care au fost
lizate cel puin 50% din celule

 RBL in

vivo
- Amestecul dintre Ag i Ac se inoculeaz intraperitoneal la animale de laborator (ex.: oareci
albi)
- Peste fiecare 10 min, timp de o or, se extrage
lichidul peritoneal, se pregtete un preparat nativ
i se examineaz pe fond negru sau cu contrast de
faz.
- Rezultat pozitiv numrul bacteriilor scade treptat
pn la dispariie.
Utilizarea RBL diagnosticul holerei (RVL),
leptospirozelor (RALL)

 REACIA DE

FIXARE A COMPLEMENTULUI

(RFC)
Este o reacie complex, constituit din 2 sisteme
Ag-Ac i cu participarea C.
n RFC particip Ig capabile s fixeze C IgM i
IgG.
RFC se utilizeaz n diagnosticul virozelor,
infeciilor bacteriene, etc
Toate componentele RFC sunt utilizate n acelai
volum fiind titrate n prealabil pentru aprecierea
dozelor de lucru.
Reacia este nsoit de martori ai tuturor
componenilor

 Reacia

se efectueaz n 2 etape utiliznd

2 sisteme.
I etap Sistemul de baz este constituit
din Ag1 (diagnosticuri sau Ag
necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau
serul imun) i complement n doza de
lucru. Amestecul este incubat 1h la 37 C
sau meninut 16-18 ore la 4 C. Dac Ac
se combin cu Ag omolog va avea loc i
fixarea C (efect invizibil).

II etap la sistemul de baz se adaog sistemul

indicator (hemolitic), constituit din hematii de
berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2).
Peste 1h incubare la 37 C reacia este
terminat.
Evaluarea rezultatelor dac complementul a fost
fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se
observ (rezultat pozitiv). Dac Ag1 nu
corespunde cu Ac1, complementul rmne
disponibil pentru fixare pe sistemul indicator
Ag2-Ac2, provocnd hemoliza (rezultat negativ)

Complement Fixation

No Ag

Ag
Ag
Ag

Patients
serum

 Tehnici

serologice cu utilizarea Ac

marcai
n unele cazuri este imposibil de a
detecta o reacie Ag-Ac: unii Ac nu
precipiteaz, alii nici nu precipiteaz, nici nu
aglutineaz, exist complexe Ag-Ac care nu
fixeaz C. n aceste cazuri pot fi utilizai Ac
marcai pentru a vizualiza Ag respectiv.
Conjugarea Ac cu marcani nu afecteaz
proprietile lor imunologice.
Aceste reacii se monteaz pe suport
solid (lam, plci din plastic)

 Marcanii
-

utilizai uzual:
Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care
emit respectiv o lumin rou-oranj sau verdegalben la tratarea lor cu raze UV ( Reacia
de Imuno-Fluorescen)
Enzime (fosfataza alcalin, peroxidaza),
capabile s modifice culoarea unui substrat
(Reacia Imuno-enzimatic)
Radio-izotopi (125J sau 3H), care emit
respectiv raze gamma i beta (Analiza
Radio-Imun)

Reacia de imunofluorescen (RIF, reacia

COONS)

 Reacia

Imuno-Enzimatic (RIE, ELISA -Enzyme

Linked Immunosorbent Assays).
RIE direct (metoda sandwich). Utilizat doar n
sero-identificarea Ag. n godeurile din placa de
polistiren n care sunt fixai Ac cunoscui se toarn
soluia de Ag necunoscut. Se incubeaz 1h. Dup o
splare minuioas a godeurilor se adaog Ac marcai
cu enzime, care se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag
polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iari
godeurile. Prezena complexului Ac-Ag-Ac-marcat se
depisteaz cu ajutorul substratului cromogen
(substan iniial incolor, dar care se coloreaz sub
aciunea
enzimei,
ex.
apa
oxigenata
si
orthofenilendiamina).

RIE indirect. Utilizat n serodiagnostic. Ag

cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul
testat) se ntroduce n godeu, dup 1h se spal
totul i se adaog ligandul marcat cu enzim
(anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim). Acest
ligand se fixeaz pe Ac testai. Se adaog apoi
substratul cromogen. Cantitatea de Ac se
msoar dup densitatea optic a lichidului din
godeuri.

Tehnica imunoblot (western blot) permite

identificarea Ag dintr-un amestec.
I etap electroforeza n gel a probei de Ag
II etap transferul electric al Ag pe membrana
de nitroceluloz
III etap pe membran sunt aplicai succesiv
Ac dirijai contra Ag, apoi conjugatul marcat cu
enzim, care permite depistarea Ac fixai. Dup
o splare se adaog substratul cromogen.
Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone colorate
distincte. Utilizare: depistarea Ac anti-HIV,
caracterizarea Ac monoclonali...

 Analiza

radioimun (ARI)
Principiul este identic cu cel al RIE
Ag se fixeaz la fundul godeurilor din
placa de plastic. Se adaog Ac testai
care se vor combina cu Ag omolog. Dup
splarea godeurilor, se adaug un ligand
radiomarcat (anti-Ig). Dup eliminarea
excesului de izotopi prin splare, se
msoar
radio-activitatea:
ea
este
proporional cu concentraia Ac dozai.

 Reacia

de neutralizare (RN): formarea

complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea
efectului biologic al Ag (neutralizarea
toxinelor, enzimelor, virusurilor).

Reacia

de imobilizare
Unii anticorpi anti-bacterieni pot
provoca imobilizarea bacteriilor mobile
(vibrioni, spirochete)