Sunteți pe pagina 1din 38

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

Facultatea de Chimie

BIOSENSORIINSTRUMENTE ANALITICE UTILIZATE N


LABORATORUL MEDICAL

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific,
Profesor Dr. Vasile Magearu

Doctorand,
Elena Rodica Ionescu

Bucureti, 2007

CUPRINS

INTRODUCERE................................................................................................................................4
3. SENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA PROTEAZELOR ....................................................7
3.5. Rezultate i discuii...............................................................................................................7
3.5.1. Caracterizarea electrochimic a electrodului modificat cu poly(pirol-alchilamonium)Gox...........................................................................................................................................7
3.5.3. Performanele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei.......................8
4. DETECTAREA AMPEROMETRIC A CADN-ULUI DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST FOLOSIND
ELECTROZI MODIFICAI CU FILMUL DE POLIPIROL..........................................................................10
4.1. Introducere..........................................................................................................................10
4.2.1. Oligonucleodele WNV.................................................................................................10
4.4. Prepararea sensorului ADN...............................................................................................10
4.5. Rezultate i discuii..............................................................................................................11
4.5.1. Elababorarea electrochimic i caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS)..................11
4.5.3. Curba de calibrare amperomtric pentru determinarea concentraiilor de cADN WNV.
................................................................................................................................................12
4.6. Concluzii.............................................................................................................................12
5. SENSOR ELECTROENZIMATIC POLIPIROL-INTERCALATOR PENTRU DETECTAREA CADN DERIVAT
DIN VIRUSUL NILE WEST................................................................................................................12
5.1. Introducere..........................................................................................................................12
5. 4. Rezultate i discuii...........................................................................................................13
5.5. Concluzii.............................................................................................................................14
6. IMUNOSENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IGG FOLOSIND
UN COPOLIMER FOTOACTIV.............................................................................................................15
6.1. Introducere..........................................................................................................................15
6.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un film polimeric..................................................15
6.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul de copolimeric..............................................15
6.4. Rezultate i discuii.............................................................................................................16
6.4.3. Construcia imunosensorului i detecia anticorpilor WNV.........................................16
6.5. Concluzii.............................................................................................................................17
7. IMUNOSENSORUL AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IGG FOLOSIND
INCAPSULAREA PHAGILOR INTR-UN FILM DE POLIPIROL(ALCHIL-AMONIUM).................................17
7.1 Introducere...........................................................................................................................17
7.4. Prepararea imonosensorului-WNV avnd la baz phagi incapsulai ntr-un film de
polipirol......................................................................................................................................18
7.5. Rezultate i discuii.............................................................................................................18
7.5.1. Elaborarea electrozilor modificai cu polimer si phagi................................................18
7.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-phagi WNV.......................................................20
7.5.3. Performanele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV.........................20
7.6. Concluzii.............................................................................................................................21
8. CONSTRUIREA IMUNOSENSORILOR AMPEROMETRICI PENTRU DETERMINAREA ANTICORPILOR
ANTI-HOLER BAZAI PE ELECTROGENERAREA FILMELOR PERMEABILE DE POLIPIROL-BIOTINILAT
........................................................................................................................................................21
8.1. Introducere..........................................................................................................................21
8.5. Prepararea imunosensorului...............................................................................................22
8.7. Rezultate i discuii.............................................................................................................22
8.7.1. Caracterizarea electrochimic a filmului de copolimer format din poli(pirol-biotin) i
poli(pirol-lactobionamid)......................................................................................................22
8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT.......................................24

8.8 Concluzii..............................................................................................................................25
9. COMPARAREA A TREI CONFIGURAII DE IMUNOSENSORI ENZIMATICI PENTRU DETECTAREA
ANTICORPULUI ANTI-TOXINA HOLEREI...........................................................................................25
9.1. Introducere..........................................................................................................................25
9.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici.......................................................................25
9.5. Tranducerea amperometric a imunoreaciei.....................................................................26
9.6. Rezultate i discuii.............................................................................................................27
9.6.1. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP.............28
9.6.2. Performanele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, i PPO-B..........................28
9.6.3. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B i PPO-B ca markeri
enzimatici n construcia de imunosensori.............................................................................29
9.7. Concluzii.............................................................................................................................29
10. MBUNATATIRI ADUSE N REINEREA ENZIMELOR DE FILMUL DE POLI(PIROL-ALGINAT) N
ELABORAREA BIOSENSORILOR........................................................................................................30
10.1. Introducere........................................................................................................................30
10.4. Rezultate i discuii...........................................................................................................30
10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat i polipirol-alginat pentru testele electrochimice 30
10.4.2. Studii de permeabilitate..............................................................................................31
10.4.4. Biosensori amperometrici bazai pe filmele de alginat i polipirol-alginat................32
10.5. Concluzii...........................................................................................................................33
11. BIOSENSORI AMPEROMETRICI BAZAI PE GELURI DE ALGINAT I POLIPIROL-ALGINAT
CONINND CELULE ALGALE DE CHLORELLA VULGARIS...............................................................33
11.1. Introducere........................................................................................................................33
11.5. Prepararea biosensorului algal.........................................................................................33
11.7. Rezultate i discuii............................................................................................................34
11.7.1. Compararea electrochimic a stabilitii gelurilor de alginat i poli-pirol alginat ce
conin celule algale.................................................................................................................34
11.7.3. Performanele analitice ale biosensorilor celule algale-alginat i celule algalepilipirol-alginat.......................................................................................................................35
11.7. Concluzii............................................................................................................................36
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA.......................................................................................................37

* Numerotarea tabelelor, figurilor si cea a indicatiilor bibliografice este cea din teza de doctorat

INTRODUCERE

Bacteriile, virusurile i alte micro-organisme sunt larg rspandite n natur i mediul nconjurtor.
Bacteriile patogene se gsesc n pmnt, n ape, n tractul intestinal al animalelor sau n apele contaminate
cu deeuri fecale. O persoan poart n medie mai mult de 150 de tipuri de bacterii care pot exista att n
interiorul ct i la exteriorul corpului uman. Majoritatea microorganismelor desfoar activiti eseniale
n natur, fiind n numr mare benefice dezvoltrii plantelor i animalelor.
Depistarea rapid i specific a micro-organismelor (bacterii, virusuri) este astfel esenial n
diagnosticarea, tratarea i prevenirea eficient a unei infecii umane. n acest direcie, metodele de
laborator convenionale dei sunt eficiente necesit cteva ore pn la obinerea rezultatelor i un personal
calificat n microbiologie.
n mod curent

pentru identificarea microoganismelor sunt folosite testele imunologice ca

imunofluorescena, aglutinarea pe plac i testele enzimatice ELISA ce au la baza monitorizarea reaciiei


anticorp-antigen [65]. Aceste teste prezint o sensibilitate i o specificitate moderat, necesitnd cteva ore
de prepare i cel puin 10 6 microorganisme pentru identificare. Dac acest numr de microoganisme nu este
prezent n proba de analizat, trebuie mai nti ca microoganismele s fie cultivate ntr-un mediu de agar sau
ntru-un mediu bogat n nutrieni pentru cel puin 2 sau 3 zile pentru a atinge nivelul necesar dozajului
imunologic.
Alte technici relativ rapide (cteva ore)

folosite n laboratorul medical pentru identi-ficarea

microorganismelor, sunt technicile bazate pe utilizarea probelor de acizi nucleici (ADN sau ARN), care
recunosc specific probele complemantare de acizi nucleici, precum i technica de amplificare n lan a
acizilor nucleici PCR- bazat pe o amplificare rapid a ADN-ului sau ARN-ului microbial pentru
identificare. Dei PCR-ul este foarte specific, metoda prezint mai multe dezavantaje: prezena unui person
calificat, un mediu de lucru foarte curat, necesitatea izolrii si caracterizrii genelor unice ale
microoganismului analizat, iar uneori etape suplimentare de lucru pentru eliminarea substanelor inhibitorii.
Marea parte a inconvenienelor ntmpinate n realizarea metodelor clasice de identificare a
microorganimelor sunt eliminate prin introducerea biosensorilor. Astfel, n ultimii ani, se observ un
interes deosebit acordat dezvoltarii technologiei biosensorilor ce este bazat pe cerina din ce in ce mai
ridicat n detectarea rapid i specific ntr-un timp scurt a unui numr sporit de analii, vitali sntii
omului. Prin introducerea biosensorilor n diagnosticarea patogenilor microbieni i a toxinelor biologice se
mbuntete considerabil sensibilitatea i selectivitatea testelor biochimice. Ca urmare, biosensorii
intervin n diagnosticarea clinic (de exemplu determinarea glucozei din snge), n controlul alimentaiei
publice, n bioprocesele de control, i n testarea calitii mediului.
Lucrarea de doctorat prezint construirea reuit a mai multor tipuri de biosensori bazai pe
utilizarea de filme variate de polipirol ce faciliteaz capturarea biomoleculelor i permit dozarea specific
i reproducil a enzimelor, viruilor i bacteriilor cu ajutorul metodelor electrochimice (amperometrie,

voltametrie). Ca i construcie, lucrarea este structurat n dou pri principale care se refer la date din
literatur -PARTEA TEORETIC- primele dou capitole i contribuii originale PARTEA
EXPERIMENTAL prezentate pe parcursul a 9 capitole.
n primul capitol sunt tratate aspecte generale legate de structura virusurilor, bacteriilor i
bacteriophagilor cu descrierea n particular a virusului Nile West i a bacteriei Vibrio cholera ce sunt
studiai (identificai electrochimic) n teza de doctorat precum i metodele fizico-chimice i enzimatice de
identificare a acestora curent folosite n laboratoarele de analize medicale.
n capitolulul 2 se prezint aspectele generale privind construirea biosensorilor (imuno-sensori i
sensori ADN) bazai pe utilizarea de electrozi modificai cu diferite filme polimerice bazate pe derivai ai
pirolului. De asemenea se trateaz succint biochimia general a anticorpilor, acizilor nucleici i a
markerilor enzimatici ce ajut la ntelegerea principiului de funcionare al biosensorilor fabricai n lucrarea
de doctorat.
n capitolul 3 se descrie construirea unui biosensor amperometric folosit n determinarea de
concentraii sczute de proteaze (tripsin). La nceput este prezentat principiul de construcie al sensorului
enzimatic, urmat de discutarea evoluiei amperometrice n timp, ca urmare a aciunii tripsinei asupra unui
strat uscat de gelatin. Biosensorul are la baz digestia unui strat uscat de gelatin depozitat la suprafaa
unui electrod de platin.
n capitolul 4 este prezentat elaborarea unui biosensor amperometric folosit n determinarea
fragmetelor scurte prezintetizate de ADN din virusul Nile West. Biosensorul este bazat pe cuplarea
covalent a unei probe-ADN-aminate de un film de polipirol electrogenerat la suprafaa unui electrod de
platin. Prin cuplarea ulterioar cu ADN-ul target se realizeaz procesul de hibridizare monitorizat prin
intermediul unei probe-ADN biotinilate via interaciei cu avidin.
Capitol 5 descrie un concept original de sensor-ADN, bazat pe identificarea unui ADN derivat din
virusul Nile West prin intermediul unui compus intercalant grefat covalent de un film de polipirol ce
permite ulterior integrarea sa specific n duplexul ADN dup cum arat experienele de voltametrie ciclic
i amperometrie.
n capitolul 6 se descrie construirea unui imunosensor amperometric pentru determinarea
anticorpilor IgG specifici pentru virusul Nile West prin intermediul bacteriophagilor(antigene) - ce poart
un epitop specific pentru virus- fotoimobilizati ntr-un film copolimeric constituit din uniti de pirolbenzofenon i pirol-rutenium. Prezena phagilor grefai precum i influena unui raport optim ntre cei doi
monomeri utilizai este confirmat prin studii de voltametrie ciclic.
n capitolul 7 se prezint fabricarea unui immunosensor amperometric pentru determinarea
anticorpilor IgG specifici virusul Nile West prin intermediul bacteriphagilor incapsulai ntr-un film de
polipirol amfifilic. Optimizarea sistemului de dozare amperometric (cantitatea de phagi depozitat, modul
de electro-polimerizare) este realizat prin voltametria ciclic.
n capitolul 8 se descrie modul de fabricare i de funcionare a unui imunosensor amperometric
original pentru detectarea anticorpilor de holer avnd la baz utilizarea unui copolimer de polipirol-biotin
i polipirol-lactobionamid pentru imobilizarea antigenelor holerei biotinalate prin intermediul interaciei

cu unitile de avidin i n combinaie cu un marker enzimatic ca peroxidaza. Capitolul prezint de


asemenea studii de estimare a permeabilitii filmului copolimeric biotinilat care este direct corelat cu
posibilitatea de detecie a imunoreaciei prin amperometrie.
n capitolul 9 se compar performanele analitice obinute pentru trei configuraii de imunosensori
amperometrici ce utilizeaz gluco-oxidaza, tirozinaza i peroxidaza drept markeri enzimatici pentru
detectarea amperometric a anticopilor de holera. n prima parte a studiului se prezint modul de prepare i
principiul de funcionare al celor trei imunosensori iar n partea a doua se prezint n detaliu performanele
fiecrui biosensor, unde sistemul ce utilizeaz peroxidaza se remrca ca fiind cel mai sensibil.
n capitolul 10 este prezentat sinteza unui nou derivat de pirol, monomerul de pirol-alginat care n
urma procesului de electropolimerizarea a condus la formarea unui matrix polipirol-gel, ce prezint un grad
ridicat de reinere a enzimelor, cu sporirea stabilitii la efectul distructiv al anionilor de fosfat ceea ce nu
este posibil cu gelul de alginat standard. Prezena lanurilor electropolimerizate a fost clar ilustrat prin
scderea permeabilitii comparativ cu gelul natural de alginat n prezena speciei permeante hidrochinona. n partea a doua a studiului au fost analizate performanele analitice ale filmelor de alginat
modificat i nemodificat cu grupri pirolice coninnd molecule de gluco-oxidaza pentru determinarea
glucozei.
n capitolul final (11) sunt raportate fabricarea reuit i performanele analitice ale biosensorilor
bazai pe incapsularea celulelor algale de Chlorella vulgaris n gelul de alginat natural i ntr-un matrix nou
sintetizat de pirol-alginat. Cele dou configuraii de biosensori sunt comparate n ceea ce privete curentul
amperometric obinut n prezena substratului de p-nitrofenil fosfat pentru dozarea activitii fosfatazei
alcaline algale. Stabilitatea superioar a gelului de polipirol-alginat este evideniat n comparaie cu cea
caracteristic alginatului natural ceea ce recomand gelul de polipirol-alginat ca un suport netoxic i
eficient pentru construirea de biosensori.
2. Aspecte generale n construirea biosensorilor
Biosensorii sunt instrumente analitice ce integreaz o component biologic (receptorul biochimic)
de o suprafa solid (transducer) ce faciliteaz intercaiile biospecifice reversibile cu analitul i
convertete semnalul biologic ntr-un semnal electric msurabil. Componenta biologic este reprezentat
fie de enzime, receptori, celule, esuturi, organele, peptide, anticorpi, acizi nucleici etc., asigurnd
recunoaterea molecular (Figura 2.1). Biosensorii ce utilizeaz anticorpii sau fragmente de anticorpi drept
material biologic sunt cunoscui sub numele de imunosensori. Comparativ cu metodele analitice
convenionale, biosensorii sunt caracterizai drept structuri intergrate pentru diveri componeni.
Biosensorii combin nalta specificitate analitic cu procesarea electronic modern fcnd posibil
obinerea unei sensibilitii remarcabile.

Figura 2.1. Schema general a unui biosensor.


De asemenea, biosensorii ADN bazai pe recunoaterea acizilor nucleici, cunosc o dezvoltare
rapid datorit simplicitii i costurilor reduse necesare pentru testarea bolilor infecioase i genetice. Spre
deosebire de enzime sau anticorpi, straturile de recunoatere a acidului nucleic pot fii sintetizate i
regenerate pentru mai multe utilizri.
Biosensorii sunt utilizai intensiv ca intrumente de diagnosticare clinic [48], predominant n aa
numitul point-of care testing. Astzi, biosensorul cu cel mai ridicat succes comercial in vitro este
biosensorul de glucoz sub form de dispozitiv portabile ce au posibilitatea de schimbare a cartrig-ului de
reactivi.
REZULTATE ORIGINALE
3. SENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA PROTEAZELOR

n acest capitol se prezent o metod original de cuantificare a tripsinei n domeniul picomolar, bazat pe
elaborarea unui biosensor ce are la baz detecia amperometric a curentului nregistrat de un electrod de
platin modificat cu molecule de gluco-oxidaza incapsulate intr-un film de poli(pirol-alchilamonium)
(Figura 3.1.) i ulterior acoperit cu un strat de gelatin ce este supus digestiei proteolitice.

Figura 3.1. Structura monomerului de pirol-alchilamonium.

3.5. Rezultate i discuii


3.5.1. Caracterizarea electrochimic a electrodului modificat cu poly(pirol-alchilamonium)-Gox.
Deoarece Gox catalizeaz oxidarea aerobic a glucozei cu producerea concomitent a H 2O2, au fost
investigate performaele analitice ale electrodului enzimatic pentru determinarea glucozei. Detecia
amperometric a glucozei a fost realizat n soluie de tampon fosfat salin (0.1 M PBS, pH = 7) prin

poteniostarea electrozilor modificai la 0.6 V pentru a facilita oxidarea enzimatic a H 2O2 generat la
suprafaa electrodului de platin. Curba de calibrare obinut a fost liniar cu variaiile concentraiei de
glucoz, iar nivelul de saturaie n glucoza - platoul- se atinge la concentraia de 22 mM. Sensibilitatea
biosensorului (definit ca partea liniar iniiala din curba de calibrare) i densitatea maxim a curentului la
saturaie au fost de 23 mA x M -1 x cm-2, respectiv de 102 mA x cm -2. Pentru a cuantifica efectul gelatinei
asupra performaelor analitice ale biosensorului, a fost investigat rspunsul amperometric al sensorului la
injecia a 2 mM glucoz. Aceat concentraie de glucoz a fost aleas ca fcnd parte din reginea linear a
curbei de calibrare, iar rspunsul biosensorului a fost direct proporional cu concentraia substratului [54].
Cum s-a presupus, formarea stratului de gelatin creaz mpiedicri sterice puternice ngreunnd
difuzia glucozei ctre stratul de polimer-Gox i drept urmare se obin un curent diminuat de 5% din
valoarea sa iniial (Figura 3.3b), cazul unui electrod nemodificat cu gelatin (Figura 3.3a). Astfel, dozarea
activitii proteolitice a fost efectuat prin intermediul creterii curentului amperometric datorit degradarii
stratului de gelatin n urma digestiei proteolitice.

Figura 3.3. Evoluia rspunsului biosensorului la injecia glucozei (2mM) ca urmare a degradrii stratului
gelatinic de ctre tripsin (300 g/ml) pe o perioad determinat de timp. (a) nainte modificrii cu
gelatin; (b) dup gelatinare; i la diferite intervale de timp de la imersarea electrodului gelatinat n
soluii de tripsin: (c) 40 s; (d) 60 s; (e) 80 s; (f) 230 s; (g) 5 min; (h) 10 min; (j) 30 min. Biosensorul a fost
poteniostat la 0.6 V n soluia 0.1M PBS (pH 7) supus agiiei magnetice.
3.5.3. Performanele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei
Pentru ilustrarea sensibilitii crescute a biosensorilor de gelatin-Gox pentru digestia proteolitic
(triptic), s-a examinat efectul diferitelor concentraii de tripsin (0,001 pn la 300 g/ml) preparate n 0.1
M PBS asupra sensibilitii biosensorului. Figura 3.4. prezint creterea dramatic a curentului
amperometric n momentul injectrii a 2 mM glucoz pentru concentraii cuprinse ntre 0.1 pn la 300
g/ml. Se observ modificri de curent minore pentru concentraii cuprinse ntre 1 i 100 ng, ceea ce
sugereaz c prezenta metod nu poate fii utilizat pentru determinarea de concentraii de tripsin mai
sczute de 1ng/ml tripsin.

Figure 3.4. Creterea intensitii curentului amperometric pentru sensorii de gelatina-Gox n prezena
glucozei (2mM) pentru diferite concentraii de tripsin dup 1 minut de digestie enzimatic. Creterea este
raportat sub forma de raport a curentului obinut de biosensor i cel obinut iniial n absena gelatinei.
Dozarea tripsinei a fost investigat prin incubarea electrozilor gelatinai 10 minute n soluia de
tripsin. Pentru fiecare concentraie de tripsin au fost preparai trei biosensori individuali gelatin-Gox iar
curentul amperometric medie a fost nregistrat. S-a observat o cretere liniar a curentului cu logaritmul
concentraiilor de tripsin n domeniul de 1 pn la 250 ng/ml (Figura 3.6).

Figura 3.6. Curba de calibrare a tripsinei ilustreaz creterea curentului biosensorilor de gelatina-Gox n
momentul injectrii a 2 mM glucoza pentru diferite concentraii de tripsin i dup un timp de degradare a
gelatinei de 10 minute. Condiiile experimentale au fost identice cu cele din Figura 3.4.
Limita de detecie de 1 ng/ml sau 42 pM este remarcabil, fiind mult mai superioar comparativ cu
ali biosensori 25 nM i 40 ng/ml [117,118]. n plus, aceti biosensori prezint un timp de rspuns de 20 i
60 minute, n timp ce electrozii de gelatin-Gox rspund rapid, dup 1 minut pentru 300 g/ml tripsin sau
n 10 minute pentru 1 ng/ml tripsin.
3. 6. Concluzii
n acest capitol se prezint o metod amperometric original i cu potenial de aplicabilitate n
domeniul medical ca urmare a posibilitii de dozare rapide (10 minute) a unor concentraii foarte sczute
de tripsin de pn la 1ng/ml. Acest metod folosete n prima etap suprimarea rspunsului biosensorului
de ctre un strat uscat de gelatin ce acoper un electrod de platin modificat cu un film de polipirol-alchil
amonium coninnd molecule de gluco-oxidaza incapsulate n reeaua polimeric, iar n etapa secundar se
monitorizeaz evoluia curentului amperometric catalitic aprut n prezena glucozei dup o digestie

triptic progresiv a stratului de gelatin. Digestia proteolitic a stratului de gelatin este foarte rapid n
prezena unei concentraii de 300 g/ml tripsina, conducnd la o cretere continuu a curentului anodic
timp de un minut de tratament cu tripsin. Dup acest timp, se observ un efect toxic al tripsinei asupra
moleculelor de gluco-oxidaza ce induce o scderea progresiv a curentului. Acest efect de toxicitate este
datorat tripsinei ce atac situsurilor de arginin i lizin prezente n Gox. Ca urmare, timpul de dozaj foarte
rapid al tripsinei (1 min), precum i simplicitatea cons-truirii biosensorului enzimatic face ca acest tip de
dozare enzimatic s vin n ajutorul monitorizrii strii de sntate a pacienilor suspeci de dereglri n
nivelul tripsinei.
4. DETECTAREA AMPEROMETRIC A CADN-ULUI DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST FOLOSIND
ELECTROZI MODIFICAI CU FILMUL DE POLIPIROL

4.1. Introducere
n acest capitol prezent o noua strategie de fabricare a sensorilor-ADN bazat pe grefarea chimic
a oligonucleotidelor pornind de la simpla elaborare a filmului de poli(pirol) N-substituit de ctre grupele de
hidroxi-sucinimid (NHS). Secvena cADN a fost sintetizat dintr-o secvena ARN a virusului Nile West
(WNV) (de provenien din Israel) [86]. Detectarea ampero-metric a fragmentelor scurte de cADN WNV
a fost investigat dup producerea procesului de hibridizare, prin intermediul unui marker enzimatic glucooxidaza.
4.2.1. Oligonucleodele WNV
Oligonucleotidele WNV au fost obinute de la Integrated DNA Technologies (IA).
Probe-WNV-DNA (WNVP-21 mer): Amino + 12/5'-CTTTGGTGGAGAGATCGCTGA-3' (-)
Target-WNV-DNA (WNVT-36 mer):
5'-GCTATTTGGCTACCGTCAGCATCTCTCCACCAAAG-3' (+)

WNV-DNA-biotin (WNVB15 mer):


5'-CGGTAGCCAAATAGC/Biotin/-3'(-)

Non-complementary target WNV-DNA (NCT-37 mer):


5'-AGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTG-3' (+)

4.4. Prepararea sensorului ADN


Etapele urmate n elababorarea sensorului cADN WNV sunt ilustrate n Figura 4.2:

Figura 4.2. Fabricarea sensorului cADN WNV. 1. Filmul de poli(pirol-NHS); 2. Cuplarea probei ADN
aminate; 3. Hibridizarea cADN WNV - int; 4. Hibridizarea cu lanul oligonucleotic biotinilat; 5.
Cuplarea gluco-oxidazei cu avidin
i detectarea semnalului.
4.5. Rezultate i discuii
4.5.1. Elababorarea electrochimic i caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS).
Comportamentul electrochimic al monomerului de pirol-NHS (2 mM) a fost investigat n CH 3CN
+ 0.1 M LiClO4. Prin scanarea oxidativ, monomerul prezint un pic ireversibil la 1.08 V (fa Ag/10 mM
Ag+ electrod de referin) ceea ce corespunde oxidrii gruprii pirol n radicali cationici (Figura 4.3A).
Electropolimerizarea monomerului de pirol-NHS a fost realizat prin repetarea ciclrii potenialului pe
intervalul 0 0.95V. Aparena i continuua cresere a picului reversil la 0.48V indic clar formarea filmului
polimeric la suprafaa electrodului (Figura 4.3B). Electrodul modificat a fost transferat n soluia de
CH3CN + 0.1 M LiClO4 fr monomer de pirol-NHS. Dup cum s-a presupus, voltamograma ciclic a
acestui electrod prezint un pic de potenial de oxidare la E1/2 = 0.58 V reflectnd bine cunoscuta
electroactivitate a scheletului polipirolic (Figura 4.3C).

Figura 4.3. Voltamograme ciclice ale filmului de pirol-NHS (2 mM) la suprafaa electrodului de
platin (diametru 5 mm) (A) nainte i (B) n timpul electropolimerizrii prin repetarea potentalului de
scanare n CH3CN + 0.1 M LiClO4, (C) dup tranferul n CH3CN + 0.1 M LiClO4.; viteza de scanare a fost
de 0.1 V s-1.
4.5.3. Curba de calibrare amperomtric pentru determinarea concentraiilor de cADN WNV.
n prezena oxigenului, Gox catalizeaz oxidarea glucozei cu producerea concomitent a H 2O2 ,
care poate fii detectat i cuantificat prin intermediul oxidrii sale electrochimice.
Figura 4.5. prezint rspuns de curent amperometric al sensorului ADN pentru dou concentraii de
glucoz (20 mM i 140 mM) n funcie de concentraia de WNVT, indicnd o limit de detecie extrem de
sensibil i anume de 1 fg ml. -1 Ambele curbe de calibrare cresc cu creterea concentraiei de WNVT
obinndu-se un pseusoplatou peste 500 ng ml. -1

Figura 4.5. Rspunsul de curent amperometric al sensorului cADN la injectarea glucozei (a) 140 mM, (b)
20 mM n funcie de concentraia de WNVT. Potenialul aplicat: 0.6 V n soluia agitat de 0.1 M PBS (pH
= 7).
4.6. Concluzii
n acest capitol este prezentat electrogenerare filmului de polipirol-NHS n combinaie cu procesul
de supraoxidare electrochimic n vederea obinerii unui polimer permeabil pentru grefarea de
oligonucleotide reagentless. Acest legatur chimic a probei cADN WNV de filmul polimeric conduce la
fabricarea unui sensor cADN eficient prin utilizarea unui marker enzimatic ce identific duplexul ADN
format la suprafaa electrodului de platin. Se obine o limit de detecie extrem de sensibil (1 fg ml -1) de
cADN WNV ce este asociat cu o stabilitatea ridicat a rspunsului amperometric.
5. SENSOR ELECTROENZIMATIC POLIPIROL-INTERCALATOR PENTRU DETECTAREA CADN DERIVAT DIN
VIRUSUL NILE WEST
5.1. Introducere
Lund n considerare procesul de intercalare, n acest capitol se propune un concept original de
identificare a secvenei ADN derivate din

virusul

Nile West

bazat pe adugarea oligonucleotidie

complementare ntr-o soluie apoas de ssDNA i urmat de identificare (fishing) electrochimic a


duplexului format la suprafaa sensorului. Electrodul este n prealabil modificat cu un intercalator planar
sintetic, un derivat redox acridinic (RAD) [145] grefat chimic la suprafaa electrodului via unui film
electrogenerat de polipirol N-substituit de gruparea N-hidroxidsuccinimida (Figura 5.1). RAD-ul grefat va
fii ulterior folosit n procesul de intercalare n dsADN la suprafaa electrodului.

Figura 5.1. Structura chimic a derivatului redox de acridona (RAD) (a) i a celui de pirol N-substituit de
grupul N-hydroxysuccinimida 1 (b).
Elaborarea unui sensor genomic WNV a fost astfel selectat ca model pentru investigarea
conceptului de WNV-sensor. Pentru aceasta, determinarea procesului de hibridizare dintre dou

oligonucleotide derivate dintr-un fragment provenind din partea proteic a WNV regiunea codat 11451180 a fost realizat prin capturarea (fishing) duplexului ADN. Ulterior, carac-teristicele analitice ale
sensorului WNV cDNA au fost investigate prin msuratori amperometrice ce folosesc unui marker
enzimatic [87].
5. 4. Rezultate i discuii
Scopul electrozilor modificai a fost acela de a detecta duplexul-ADN dup marcarea cu molecule
de Gox, prin oxidare electrochimic la suprafaa electrodului de platin cu producerea de H 2O2 de ctre
Gox. Oricum, caracterul hidrofobic a filmului poli1 ngreuneaz transformarea H2O2 n ap, influennd
astfel detectarea amperometric. Pentru creterea permebilitii, filmul polimeric [150] a fost superoxidat
prin ciclarea potenialului ntre 0.0V i 1.3V (Figura 5.2B).
Immobilizarea covalent a RAD a fost efectuat la temperatura camerei, prin depositarea unei
soluii apoase de RAD pe electrodul polipirolic modificat (20 l, 140 g/ml) i lsat la incubaie peste
noapte n condiii de mediu umid.
Voltamograma ciclic a electrodului RAD-modificat efectuat n tamponul fosfat deaerat prezint
n regiunea negativ un pic reversibil la 0.35 V, regiune n care filmul poli1 nu este electroactiv (Figura
5.2C). Acest semnal redox este n bun acordan cu valoarea potenialului (- 0.25 V) obtinut pentru
reducerea a RAD-ului n soluie. n plus, intensitate de curent a picului reversibil variaz liniar cu viteza de
scanare, confirmnd astfel grefarea chimic a RAD.
Acoperirea aparent a electrodului cu RAD ( = 2.25 x 10 -9 mol x cm-2) a fost estimat prin
integrarea sarcinii caracteristic picului. Lund n considerare c din punct de vedere teoretic, acoperirea
maxim a suprafeei electrodului cu un strat compact de RAD corespunde la 2.37 x 10 -10 mol x cm-2, se
confirm clar c moleculele de intercalator au fost grefate att la interfaa polimer-solute ct i n interiorul
structurii polipirolice.

Figura 5.2. Voltamogramele ciclice pentru electrodul modificat cu poly(pirol) (diametrul de 5mm): (A)
electroactivitatea polipirolului (B) supraoxidarea polipirolulu (a) primul scan, (b) patru scanari n
CH3CN + 0.1M LiClO4 ; viteza de scanare 0.1 Vs -1 ; (C) dup imobilizarea chimic a RAD n tampon PBS
deaerat, viteza de scanare 20 (a), 50 (b), and 100 (c) mVs -1. (D) Voltamograme ciclice ale electrodului
poly-1-RAD (a) nainte i (b) dup incubarea cu WNV dsDNA (10 ng/mL) n soluie tampon PBS; viteza de
scanare 0.1 Vs-1.
Rspunsul curentului obinut de electrozii modificai (poli1-RAD-dsDNA) la injecia glucozei (20
mM) a fost investigat n tamponul PBS (Figura 5.3). Curentul maxim a fost obinut ntr-un timp foarte scurt
(30-40 secunde). Intensitatea curentului obinut a fost proporional cu concentraia ADNului-int, iar limita
de detecie a fost de 1 mg/ml (90 fM).

Figura 5.3. Rspunsul curentului amprometric pentru sensorii de poli 1 RAD dsADN n funcie de
concentraia de ADN analizat (target). Insertul reprezint curentul otinut de sensorul ADN la injecia
glucozei (20mM) pentru 1 ng/mL de ADN-target. E = 0.6 V/Ag/AgCl.
5.5. Concluzii
n acest capitol s-a prezentat realizarea unui nou tip de sensor genomic amperometric foarte
sensibil pentru detectarea unui singur lan oligonucleotidic (ssADN) derivat dintr-o secven din virusul
virusul virusul Nile West (WNV). Sensorul este bazat pe folosirea unui intercalator-ADN (un derivat redox
acridinic) grefat chimic la suprafaa unui electrod de platin modificat cu un film electropolimerizat de
polipirol N-substituit de ctre gruprile N-hidroxisuccinimida (pyrrole-NHS). Intercalatorul grefat de
electrod se inser n duplexul-ADN format ntre ssADN WNV (analitul) i oligonucleotida
complementar (ssADN) ce este marcat cu uniti biotinice ceea ce, ulterior permite ancorarea unui
marker enzimatic ca gluco-oxidaza prin intermediul intercaiei de afinitate dintre avidin i biotin. Dozajul
amperometric simplu a permis obinerea unei limite de detecie foarte sensibil n domeniul de 1pg/ml
ssADN-WNV.
6. IMUNOSENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS Ig
IgG FOLOSIND UN
COPOLIMER FOTOACTIV

6.1. Introducere
Cu scopul de fabricare a unui imunosensor portabil i necostisitor pentru dozarea anticorpilor WNV
acest capitol prezint elaborarea unui transducer amperometric bazat pe imunoreacia cu phagii-WNV
displayed-epitope imobilizai la suprafaa electrodului de platin (bacteriophagii sunt virusuri ce infecteaz
bacteriile).

In acest capitol se raporteaz elaborarea reauit a unui film copolimeric n scopul utilizrii sale n
construcia de imunosensori, copolimerul avnd la baz doi monomeri pirolici: un monomer fotoactivabil
pirol-benzofenona (monomerul 1) i un monomer cationic tris(bipiridin-pirol)rutenium complex (monomer
2) (Figura 6.1).

Figura 6. 1. Structura monomerilor 1 i 2.


Imobilizarea phagilor de WNV-diplayed epitope de filmele copolimerice fotoactivabile se realizeaz
prin iradierea copolimerului ce favorizeaz formarea de legturi covalente multiple ntre grupele de
benzofenon polimerizate i phagi. Electrozii modificai cu phagi au fost testai amperometric pentru
imunodozarea de anticorpi-WNV.
6.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un film polimeric
Electropolimerizarea monomerilor sau a amestecului de monomeri (2mM) a fost efectuat ntr-o
soluie organic de CH3CN + 0.1 M TBAP prin controlarea potenialui de electroliz la + 0.85 V f de
electrodulde referin de Ag/Ag+. Procesul de electropolimerizare a fost oprit cnd densitatea de sarcin
anodic a fost de 2.5 mC cm-2. Electrozii modificai au fost apoi transferai ntr-o soluie de CH 3CN + 0.1
M TBAP fr monomer iar apoi tranferai ntr-o soluie de CH 3CN coninnd 0.1M LiClO4.
6.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul de copolimeric
O soluie apoas de 20 l a fost depozitat pe electrodul modificat cu filme copolimerice i last
s se evapore. Electrozii rezultai au fost iradiai la = 355 nm pentru 5 minute. Iradierea electrozilor
modificai cu phagi adsorbii a fost realizat cu o fibr optic folosind o lamp de mercur (presiunea medie
de 500 W) n conexiune cu lampa de o putere de 68910 Arc (ambele provenite de la Oriel Instruments).
Filtrele au fost folosite pentru selectarea lungimii de und de 335 nm i s blocheze razele IR, prevenind
astfel supranclzirea fiberei optice i a suprafeei electrodului.
6.4. Rezultate i discuii
6.4.3. Construcia imunosensorului i detecia anticorpilor WNV
Dup adsopia phagilor de filmele de poli(1-2) a urmat legarea lor covalent de suport prin
intermediul activrii luminii la = 355 nm ceea ce iniiaz polimerizarea grupelor de benzofenon. Pentru

a investiga efectul produs de aceast reacie fotochimic, electrozii modificai au fost incubai cu diferite
concentraii de anticorpi-WNV (de la 10 la 10 6). Apoi, electrozii au fost incubai cu cel de-al doilea
anticorp marcat cu peroxidaza din hrean. Recunoaterea anticorpilor-WNV legai de phagi este realizat
prin intermediul unui marcr enzimatic ca peroxidaza. Ulterior, toi imunosensorii-WNV au fost imersai n
soluia de tampon fosfat salin 0.1 M (20 ml, pH 7.2) coninnd 2 mM hidrochinon i poteniostai la 0V.
Dup injectarea peroxidului de hidrogen (2 mM), semnalul amperometric corespunznd reducerii chinonei
produse enzimatic a fost nregistrat n fucie de diluia de anticorpii-WNV (Figura 6.5).

Figura 6.5. Principiul funcionrii imunono-sensorului-WNV amperometric.


Se observ obinerea unui semnal amperometric stabil ntr-un timp foarte scurt de 30 secunde
ilustrnd astfel buna permeabilitate a filmului copolimeric. Valorile curentului maxim obinute pentru
diferite diluii a anticorpii-WNV au fost folosite pentru realizarea curbei de calibrare (Figura 6.6).

Figura 6.6. Curba de calibrare pentru anticorpii-WNV obtinut de filmele de poli(1-2) n raport de 1:1
prin intermediul imunodozarii electroenzimatice. Potenialul aplicat a fost de 0V in PBS 0.1M (20 ml pH =
7.2)
Fiecare punct din curba de calibrare reprezint media de rspuns n curent nregistrat de trei
imunosensori diferii. Se observ o scdere a semnalului amperometric pentru titrul anticorpilor din
intervalul 1:10 la 1:106 constituind astfel o limit de detecie foarte sensibil.

6.5. Concluzii
n acest capitol este prezent electrogenerarea filmelor de polipirol compuse din grupri de
benzofenon i grupri de tris(bpiridin-pirol) rutenium (II) pentru o imobilizare fotochimic inovatoare a
entitailor biologice, n particular a phagilor virusului Nile West ce-i prezerv proprietile de recunoatere
molecular n prezena anticorpilor specifici. Pentru dozarea reaciilor imunologice s-a utilizat dozajul
amperometric ceea ce permite obinerea unei limite de detecie n intervalul de 1:10 6 ce reprezint titrul
anticorpilor IgG-WNV. Acesta reflect eficiena legrii covalente fotochimice dintre phagii i filmul
polipirolic, fr a afecta ulterior imunoreaciille, precum i o permeabilitate bun a filmului copolimeric
datorat complexului de rutenium ce permite transducerea amperometric a imunoreaciei.
7. IMUNOSENSORUL AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS Ig
IgG FOLOSIND
INCAPSULAREA PHAGILOR INTR-UN FILM DE POLIPIROL(ALCHIL-AMONIUM)

7.1 Introducere
n acest capitol este raportat construcia imunosensorilor amperometrici pentru identificarea rapid
a anticorpilor IgG-WNV folosind filme de poli(pirol-alchilamonium) pentru reinerea phagilor-WNV la
suprafaa electrodului de crbune. Ca urmare au fost investigate proprietile electrochimice ale electrozilor
modificai cu polimer-phagi WNV, iar performanele analitice amperometrice ale imunosensorului cu
configuraie optimizat au fost determinate. Moleculele de phagi au fost modificate cu o secvena de 15
aminoacizi provenii din anvelopa proteic avirusul virusul Nile West virusului (WNV) ce au fost folosii
drept antigeni n loc de virusul propriu-zis (phagi identici cu cei din capitolul 6). Avantajul major al
phagilor const n faptul c sunt inofensivi pentru oameni iar preparea lor nu necesit etape complicate de
execuie.
7.4. Prepararea imonosensorului-WNV avnd la baz phagi incapsulai ntr-un film de polipirol
Dup imobilizarea phagilor de electrod, a fost realizat saturarea eventualelor siturilor nonspecifice de adsopie a proteinelor cu albumina seric bovin (BSA) sporind astfel sensibilitatea testului de
dozare. Soluia blocant a fost preparat zilnic din soluie de tampon fosfat salin (0.1 M PBS, pH = 7.2)
coninnd 5 % (w/v) BSA. Din aceast soluie s-au depozitat 20 l pe electrodul modificat cu filmul
polimeric de poli(pirol-alchilamonium) coninnd particule phagi i incubat pentru 1 ora la temperatura
camerei. Apoi, imunosensorii au fost cltii cu PBS (pH = 7.2) pentru 5 minute i incubai cu 20 l soluie
de anti-IgG WNV de concentraii diferite (de la 10 la 10 7). Anticorpii-WNV au fost diluai cu o soluie de 1
% (w/v) BSA/PBST (PBS coninnd 0.05 % (v/v) Tween-20, PBST) i pstrai la 4C. Electrozii rezultai
au fost clatii pentru 20 de minute cu soluia de PBST. Ulterior electrozii au fost incubai cu 20 l de
solute de anticorpii-IgG marcai cu HRP (10 2) pentru 20 de minute urmnd cltirea lor pentru 20 de minute
cu PBST nainte de efectuarea msurtorilor amperometrice (Figura 7.1).

Figura 7.1. Reprezentarea schematic a principiului de funcionare a imunosensorului amperometric


pentru detecia anticorpilor-WNV prin intermediul anticorpului-secundar marcat cu HRP ce catalizeaz
formarea speciilor electroactive de chinon (Q) n prezena substratelor: hidrochinon (HQ) si a H 2O2.
7.5. Rezultate i discuii
7.5.1. Elaborarea electrozilor modificai cu polimer si phagi
Comportamentul electrochimic al filmelor adsorbite de pirol-alchil amonium cu i fr phagi a fost
investigat prin voltametria ciclic la suprafaa electrodului de crbune n mediul apos coninnd 0.1M
LiClO4 drept electrolit suport. Prin scanri repetitive ale electrodului n intervalul de potenial 0 0.9 V se
observ apariia quasi-reversibil a sistemului de picuri n jurul a 0.5 V (Figura 7.2). Aceast evoluie
indic formarea filmului de polipirol la suprafaa electrodului de crbune.

Figura 7.2. Voltamogramele ciclice ale filmelor adsorbite de monomer de pirol-alchil amonium (120 nmol)
n timpul procesului de polimerizare i a polimerului obinut. (A) monomerul singur; (B) monomerul
amestecat cu 10 l monomerul amestecat cu 20 l phagi; (D) monomerul amestecat cu 30 l phagi.
Electropolimerizarea a fost efectuat timp de 10 minute prin ciclarea potenialului ntre 0 i 0.9V /Ag/AgCl
ntr-o soluie apoas coinnd 0.1M LiClO4, cu o vitez de scanare de 0.1V s-1.
Prezena phagilor imobilizai, densitatea lor i acesibilitatea pentru imunoreacia cu anticorpiiWNV este direct reflectat de intensitatea curentului obinut la reducerea chinonei. Valorile de curent
maxim (Imax) corespunznd a trei cantitai diferite de phagi (10, 20 si 30 l) imobilizate prin CPE sau RPS
sunt schematizate in Tabelul 7.2.
Tabelul 7. 2. Influena diferitelor cantitti de phagi T7-Ep 15x2 incapsulai n filme polimerice de
poli(pirol_alchilamonium) generate fie prin CPE, fie prin RPS asupra rspunsului de curent amperometric
cnd s-a folosit anticorpi-WNV n stare de saturare (1/10 dilutie)a
phagi T7-Ep15x2 (l)
10
20
30
Imax (CPE) (nA)

240

140

70

Imax (RPS) (nA)

40

15

10

a) dup marcarea cu anticorpul secundar-HRP n prezena H 2O2 (0.1mM) i a 2 mM hidrochinon , iar


electrozii sunt poteniostai la 0 V.

7.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-phagi WNV


Figura 7.3. ilustreaz voltamograma RDE obinut pentru filmul polimer-phagi. Permeabilitatatea
(Pm) este estimat folosind ecuaiile descrise anterior de Gough i Leypoldt [136-138] (Figura 7.3). Valorile
de permeabilitate ale filmului de poli(pirol-alchil amonium) i cele ale polimerului coninnd phagi T7-Ep
15x2 (10 l) sunt similare, 4.2 i respectiv 2.5 x 10 -2 cm s-1. In plus, aceste valori de permeabilitate sunt
similare cu cele raportate pentru acelai tip de polimer (polipirol-alchil amonium) cu i fr incapsularea
glucoz-oxidazei (3 si respectiv 5 x 10 -2) [167]. Aceste rezultate ilustreaz cum fenomenul de incapsulare a
phagilor ntr-un film de polipirol pentru o cantitate mic de phagi (10 l) nu afecteaz permeabilitatea
filmului i prin urmare structura sa.

Figura 7.3. (A) 10 l phagi T7 -Ep 15x2 in prezena a 2 mM soluie de hidrochinon dizolvat in 0.1 M
PBS (pH = 7.2). Voltamogramele electrodului turnant de carbon (diametru de 5 mm) modificat cu filmul
de poli(pirol-amonium): (a) 3000, (b) 2500, (c) 2000, (d) 1500, (e) 1000, si (f) 500 rpm/min. Viteza de
scanare a fost de 0.020 V s -1. (B) Graficul Koutecky-Levich pentru (a) un electrod nemodificat, (b) pentru
un electrod modificat cu un film polimeric i (c) pentru un electrod modificat cu un film polimeric
coninnd 10l phagi T7lEp15x2 phage. Soluia test a fost 2 mM hidrochinon n soluia de 0.1 M PBS
(pH = 7.2).
7.5.3. Performanele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV
Pentru a investiga capabilitile analitice ale electrozilor modificai cu polipirol-phagi pentru
dozarea amperometric a anticorpilor-WNV, electrozii cu phagi au fost incubai cu diferite diluii de
anticorpi-WNV n intervalul de 10 pn la 10 7. Aceste rspunsuri de curent au fost proporionale cu
concentraia anticorpilor, iar limita de detecie a fost de10 7 (Figura 7.4).

Figura 7.4. Rspunsul de curent amperometric nregistrat pentru imunosensorii-WNV n prezena


sistemului hidrochinona/H2O2 n funcie de diluiile de anticorpi-WNV (1:10 pn la 1:10 7). Potenialul
aplicat este de 0V fa de SCE.
Dozarea amperometric este mult mai sensibil dect alte technici ca testul colorimetric ELISA,
testul chemiluminescent ELISA sau imunotestul bazat pe fibre optice [168] ce conduc la limite de detecie a
titrului de anticorpi de 1:105, 1:5x105, i respectiv de 1:106.
De menionat este rapiditatea rspunsului de curent a diferiilor imunosensori care este stabil dup
numai 5 la 20 secunde ceea ce ilustreaz o bun permeabilitate a filmului de polimer-phagi.
7.6. Concluzii
n acest capitol a fost demonstrat eficiena funcionalizrii filmelor de polipirol cu phagi-WNV cu
pstrarea proprietilor de recunoatere molecular a anticorpilor specifici. Configuraia imunosensorului
este bazat pe grefarea fotochimic a phagilor-WNV de un film electrogenerat la un potenial de 0.850 V ce
permite detectarea de anticorpi-WNV cu o sensibilitate extrem a titrului de detecie (1:10 7). De asemenea,
a fost posibil regenerarea stratului sensibil de polimer-phagi folosind condiii acide cu scopul fabricrii de
noi WNV-imunosensori.
8. CONSTRUIREA IMUNOSENSORILOR AMPEROMETRICI PENTRU DETERMINAREA ANTICORPILOR ANTIHOLER BAZAI PE ELECTROGENERAREA FILMELOR PERMEABILE DE POLIPIROL-BIOTINILAT

8.1. Introducere
Lund n considerare problema permeabilitii sczute a filmelor de polimer biotinilate, n acest
capitol se prezint un nou protocol de construire de imunosensori amperometrici bazai pe electrogenerarea
unui film original de copolimer biotinilat ce prezint o foarte bun permeabilitate, ceea ce permite
tranducerea sa amperometric [79]. Filmul copolimeric prezint grupe de biotin -ce permite ancorarea
anticorpului sau antigenului prin intermediul interaciilor de afinitate cu avidina- i grupe de
lactobionamid ce imbunatesc caracterul hidrofilic al filmului organic electrogenerat i astfel
permeabilitatea sa.
Transducerea implic recunoaterea anticorpilor capturai de ctre cel de-al doilea anticorp
(anticorp secundar)

marcat cu enzima peroxidaz (Figura 8.1). Performanele imunosensorului sunt

investigate prin detecia amperometric a oxidarii enzimatice a hidrochinonei n prezena peroxidului de


hidrogen.

Figura 8.1. Fabricarea imunosensorului-HRP amperometric bazat pe sistemul electrochimic


hidrochinona(HQ)/peroxid de hidrogen (H2O2).
8.5. Prepararea imunosensorului
Etapele urmate n elaborarea imunosensorului la suprafaa electrodului de crbune vitros au fost:
mai nti, 20 l soluie blocant a fost depozitat la suprafaa electrodului modificat cu filmul copolimeric
biotinilat pentru a preveni acrosarea nespecific a avidinei de acest film electrogenerat. Dup etapa de
blocare a electrodului a urmat construirea specific a imunosensorului prin depozitarea a 20 l de avidina
(1 mg/ml) dizolvat n 1 % (w/v) BSA/PBST i incubarea timp de 20 minute cu filmele biotinilate. Dup
clatirea cu PBS, electrozii rezultai au fost incubai pentru alte 20 de minute cu 15 l toxina B a colereibiotinilat [0.3 mg/ml dizolvat n 1% (w/v) BSA/PBST]. Apoi electrozii au fost cltii cu PBS i incubai
cu 20 l anticorpul anti-toxina colerei subunitatea B dezvoltat n iepure la o concentraie ce variaz n
intervalul de 0.05 pn la 500 g/ml. Timpul de incubaie a fost de 20 de minute, dup care a urmat cltirea
electrodului cu soluia de PBS. n final electrozii au fost incubai pentru alte 20 minute cu 20 l soluie de
anticorp secundar IgG-anti-holera- marcat cu HRP n concentraie de 0.5 mg/ml ce a fost dizolvat n soluia
1% (w/v) BSA/PBST. Toi electrozii modificai (imunosensorii) au fost splai cu soluia tampon PBS
nainte de msurtorile amperometrice.
8.7. Rezultate i discuii
8.7.1. Caracterizarea electrochimic a filmului de copolimer format din poli(pirol-biotin) i
poli(pirol-lactobionamid)
Dei electropolimerizarea monomerului de pirol-biotin furnizeaz un film compact i activ cu
uniti de biotin, caracterul su oragnic

impiedic umflarea polimerului n mediul apos i astfel

ngreuneaz difuzia speciilor electroactive ca chinona la suprafaa electrodului [188]. Pentru a mbuntai

detectarea amperometric a chinonei au fost introduse prin electrocopolimerizare grupe hidrofilice de pirollactobionamid n scheletul polimeric de poli-pirol-biotin) pentru a contrabalansarea caracterului su
hidrofobic (Figura 8.2).

Figura 8.2. Structura monomerilor de pirol-lactobionamid (A) i de pirol-biotin (B).


Figura 8.3. prezint voltamograme ciclice ale speciei permeante electroactive -hidrochinon- la suprafaa
electrodului modificat fie cu filmul de polipirol biotinilat, fie cu filmul copolimeric-biotinilat, filme
formate cu aceeai sarcin de electropolimerizare, 1 mC. Prin compararea cu picul de oxidare a
hidrochinonei nregistrat la suprafaa electrodului de carbon nemodificat se observ a scdere uoar a
intensitii picului de curent (-14%) ce este asociat cu creterea separrii picului anodic i catodic pentru
copolimer, n timp ce pentru filmul de pirol biotinilat se remarc o quasidispariie picului anodic. Acesta
indic clar c homopolimerul impiedic drastic ptrunderea hidrochinonei, n timp ce copolimerul apare
mult mai permeabil.
Procesul de transfer de mas n filmele polimerice electrodepozitate la suprafaa electrodului a fost
investigat prin voltametria de electrod disc rotitor (RDE) [136-138].

Figura 8.3. Voltamogramele ciclice n prezena 1 mM hidrochinon i 0.1 M LiClO 4 n PBS (pH = 7)
pentru (a) un electrod de crbune nemodificat (diametru de 5 mm), (b) un electrod modificat cu poli(pirolbiotin) i poli(pirol-lactobionamid) , (c) un electrod modificat cu polipirol biotin. Viteza de scanare a
fost de 100 mV s-1.
Figura 8.4A prezint voltamogramele de disc-rotitor caractristice filmului copolimeric n soluta
apoas de hidrochinon (1 mM).
Experienele de voltametrie RDE au fost reprezentate sub forma de grafic Koutechy-Levich unde
densitatea de curent limit este reprezentat n funcie de ptratul rdcinii vitezei de rotaie (Figura 8.4B).
Din grafic, se observ un comportament liniar al copolimerului cu aceeai pant ca i electrodul
nemodificat prezentnd o intersecie pozitiv ce permite extragerea raportului D mK/ ca fiind de 2.38 x 10-2
cm s-1.
8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT
Pentru a determina sensibilitatea de dozare a anticorpului-CT, imunosensorii au fost testai cu
diferite concentraii de analit n domeniul de 0.01 -500 g/ml. Prin imersarea imunosensorilor-HRP n
soluia de tampon coninnd 2 mM hidrochinon, curentul de baz s-a stabilizat dup 4 minute iar semnalul
de curent a fost nregistrat dup injectarea peroxidului de hidrogen n celula electrochimic. Curba de
calibrare pentru detectarea amperometric a anticorpului CT a fost obinut dup fiecare concentraie de
anticorp-CT prin nregistrarea a rspunsului de curent caracteristic electrodului modificat (Figura 8.5).

Figura 8.5. Curba de calibrare a imunosensorului-HRP cu anticorpii-CT in intervalul de 0.05 -500 g/ml
folosind sistemul hidrochinona/H2O2.

8.8 Concluzii
n acest capitol se prezint o nou strategie de imobilizare a materialului imunologic de un electrod
modificat cu un film copolimerict pentru dozarea anticorpilor specifici holerei. Studiul efectuat prezint
pentru prima dat

coelectropolimerizarea monomerilor de pirol-biotin i pirol-lactobionamid ca o

variant de film polimeric eficient pentru ancorarea biomoleculelor n stare lor biologic activ. Datorit
caracterului hidrofilic ridicat, monomerul de pirol-lactobionamid sporete considerabil permeabilitatea
copolimerului pentru speciile electroactive. Acesta a permis detectarea amperometric rapid i foarte
sensibil a anticorpului de holer n combinaie cu un indicator enzimatic (peroxidaza).
9. COMPARAREA A TREI CONFIGURAII DE IMUNOSENSORI ENZIMATICI PENTRU DETECTAREA
ANTICORPULUI ANTI-TOXINA HOLEREI

9.1. Introducere
n acest capitol au fost fabricati imunosensori amperometrici pentru detectarea anti-toxinei holerice
bazai pe imobilizarea materialului imunogenic (subunitatea B a toxinei holerei biotinilat) la suprafaa
electrodului biotinilat, folosind interaciile de afinitate avidin-biotin [78]. Analitul - anticorpul anti-toxina
holerei- a fost detectat folosind alternativ trei markeri enzimatici: anticorpul IgG din iepure marcat cu
peroxidaza (HRP), gluco-oxidaza biotinilata (Gox-B) sau polifenol oxidaza biotinilata (PPO-B) n
combinaie cu avidina legata de anticorpii IgG din iepure care a fost pentru prima data folosit pentru
tranducerea unei imunoreacii. Pentru a asigura accesibilitatea speciilor active la suprafaa electrodului i
imobilizarea calitativ a probei, au fost elaborate puni de avidina-biotina cu un film copolimeric biotinilat
ce a fost obinut prin electropoli-merizarea monomerului de pirol-biotina (pentru interactii de afinitate) si
monomerului de pirol-lactobionamida (pentru mbuntirea permeabili-tii). Prin metoda de
electropolimerizare se asigur formarea unui film controlabil ca grosime, reproductibil, activ cu uniti de
biotin, fr defecte, cu stabilitate chimic i de stocare n timp [172, 175, 176, 188, 198].
9.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici
Electropolimerizarea copolimerului bioti-nilat a fost realizat prin controlarea potenialului de
electroliz la 0.85V n electrolitul de acetonitril coninnd amestecul de monomer de pirol-lactobionamid
(4 mM) i de monomer de pirol-biotin (4 mM). Lund n considerare natura reaciei electroenzimatice
folosite pentru detectarea anticorpului anti-holer, electrozii de platin au fost utilizai pentru sistemul
enzimatic bazat pe Gox-B, n timp ce electrozii de crbune au fost folosii pentru HRP i PPO-B (Figura
9.1).

Figura 9.1. Schema electrozilor modificai cu subunitatea B a toxinei holerei, biotinilate.


9.5. Tranducerea amperometric a imunoreaciei
Imunosensorii au fost incubai timp de 20 de minute cu anticorpul anti-toxina holerei (anti-CT, 20
l) secretat n iepure n domuniul de concentraii de 0.05 pa la 500 g/ml. Apoi, au fost investigate
diferitele transducii electroenzimatice.
Pentru imunosensorul-HRP, anticorpul secundaIgG marcat cu peroxidaza din hrean (20 l) la o
concentraie de 0.5 mg/ml i dizolavat n diluantul de anticorp a fost depozitat pe suprafaa electrodului
timp de 20 de minute. Apoi electrozii au fost cltii insensiv cu PBS. Trei mediatori redox diferii au fost
folosii pentru testarea rspunsului amperometric a imunosensorilor-HRP: hidrochinona, ferocenul
dicarboxilic, ferocianid (2mM) n prezena a 2M H2O2 (Figura 9.2).
Imunosensensorii-HRP au fost poteniostai la -0.1, -0.01 i -0.1V fa de SCE pentru detectarea
unui din cei trei compui enzimatici produi amperometric: fericianuda, ferocenium, i respectiv chinona.

Figura 9.2. Imunosensori amperometrici folosind copolimerul [poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida)]


pentru modificarea electrozilor de platin sau crbune cu cei trei markeri enzimatici (Gox-B,PPO-B, HRP)
pentru detectarea antitoxinei holera. (A) HRP-imunosensor; (B) Gox-B imunosensor; (C) PPO-B
imunosensor; Medred/Medox = ferocianura/fericianuda; hidrochinona/chinona; ferocen/ferocenium; Gox glucos-oxidaza biotinilat, PPO-polifenol oxidaza biotinilat; HRP-anticorpul IgG anti-iepure marcat cu
HRP.

9.6. Rezultate i discuii


Pentru a imobiliza CT la suprafaa electrodului prin interacti de afinitate via punilor de avidinbiotin, s-a folosit un nou film copolimeric biotinilat [poli(pirol-biotina), poli(pirol-lactobionamida)] ca un
strat iniial de ancorare. Acest film copolimeric a fost elaborat pentru mbuntirea sensibilitii
transduciei reaciilor enzimatice bazate pe detectarea amperometric a produilor enzimatici prezeni la
suprafaa electrodului. Catecolul a fost utilizat ca prob electrochimic pentru a ilustra diferena n
permeabilitate dintre copolimerul biotinilat i filmul de poli(pirol-biotina). Figura 9.3. prezint o serie de
voltamograme ciclice nregistrate la 100 mV s-1 pentru electrodul nemodificat, electrodul modificat cu
poli(pirol-biotina) i electrodul modificat cu copolimer.

Figura 9.3. Voltamogramele ciclice ale electrozilor de platin (diametru de 5 mm): (a) electrod
nemodificat, (b) electrod modificat cu copolimerul poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida), (c) electrod
modificat cu polipirolul biotinilat n prezena a 1 mM catecol n soluia apoas de 0.1 M LiClO 4 (pH 7).
Filmele polimerice au fost electrodepozitate prin controlarea potenialului de electroliz la 0.8 V (sarcina
de electropolimerizare a fost de 1 mC). Viteza de scanare a fost de 100 mV s -1.
9.6.1. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP
Configuraia enzimatic cea mai simpl a constat n folosirea anticorpului secundar conjugat cu o
enzim, n cazul de fa HRP. Datori spectrului larg de substrate enzimatice, trei sisteme electroactive
(ferocianura/H2O2, acidul dicarboxilic/H2O2 i hidrochinona/H2O2) au fost alese pentru investigaia
amperometric. Timpul de rspuns pentru toi imunosensorii-HRP a fost extrem de rapid, variind ntre 5 la
30 de secunde. Acesta ilustreaz o permeabilitate bun a filmului copolimeric. Figura 9.4. prezint curbele
de calibrare ale imunosensorilor-HRP pentru detectarea amperometric a anti-CT prin intermediul celor trei
substrate-HRP.

Figura 9.4. Curbele de calibrare pentru anti-CT n cazul imunosensorilor-HRP folosind diferite sisteme de
mediatori redox /H2O2 ;( ) hydrochinona, () ferocianid, () ferocen.
9.6.2. Performanele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, i PPO-B
Sensibilitatea imunosensorului a fost determinat ca panta obinut din partea liniar a curbei de
calibrare. n Tabelul 9.1. sunt prezentate valorile limitei de detecie, sensibilitii i a curentului maxim
(Imax) obinute n condiii de saturare a anti-CT pentru cele trei sisteme de detecie enzimatic.
Sistemul hidrochinona/H2O2 conduce la obinerea celor mai bune performane analitice: cea mai
sczut limit de detecie (50 ng/ml) i cea mai ridicat sensibilitate (1.5 Ag -1ml cm-2). De asemenea, au
fost nregistrate valori ridicate ale Imax pentru formarea teoretic a unui monostrat de anti-CT i astfel a
monostratului de HRP.
Cele mai bune perfomane analitice obinute cu substratul hidrichinon pot fii atribuite
dimensiunilor reduse ale cestui mediator redox comparativ cu ferocianura i ferocenul, conducnd astfel la
o mai bun permeabilitate n filmul copolimeric.
Valorile de detecie de 50 ng/mL anti-CT sunt similare cu cele obinute cu imunosensorii bazai pe
fibre optice folosind anticorpul secundar marcat cu HRP (160 ng/ml) [180, 181, 199, 200].
9.6.3. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B i PPO-B ca markeri enzimatici
n construcia de imunosensori
Cu scopul mbuntirii limitei de detecie, anticorpul secundar marcat cu HRP a fost nlocuit cu
anticorpul-biotinilat. Markerii enzimatici, Gox-B i PPO-B au fost ataai de anticorpul secundar prin
puntea de avidin-biotin.
Figura 9.5A prezint curba de calibrare a imunosensorilor Gox-B n funcie de concentraiile de
anti-CT.
n ceea ce privete PPO-B, polifenol oxidaza biotinilat este folosit pentru prima dat ca marker
enzimatic n fabricarea unui imunosensor. Acest enzim catalizeaz n prezena oxigenului oxidarea
fenolului i o-difenolilor n o-chinona. Ca urmare, detecia amperometric a anti-CT a fost efectuat n
prezena a 10 mM catecol (principalul substrat al PPO) prin poteniostatarea imunosensorilor PPO-B la
-0.2V fa de SCE pentru a reduce o-chinona generat. Figura 6B prezint urba de calibrare pentru
imunosensorii PPO-B n funtie de concentraiile de anti-CT.

Figura 9.5. Curba de calibrare pentru anti-CT folosind (A) imunosensorii Gox-B n prezeta glucozei,
Eapplicat= 0.6V, (B) imunosensorii PPO-B n prezea catecolului; Eaplicat= -0.2V.

9.7. Concluzii
n acest capitol este demonstrat posibilitatea fabricrii de imunosensori pentru dozarea
anticorpilor specifici pentru holera prin intermediul simplei imobilizri a materialului imunologic (toxina
holerei) la suprafaa electrodului modificat cu un nou film de pirol copolimeric ce poart grupri de biotin
si lactobionamid. Interacia antigen-anticorp este dozat amperometric. Datorit permeabilitii bune a
filmului copolimeric, a fost posibil utilizarea a trei sisteme de transducere electroenzimatic (HRP, Gox-B,
PPO-B) pentru detectarea anticorpului de anti-toxina holerei, ce au fost ulterior studiate i comparate n
ceea ce privete performanele analitice obinute pentru fiecare marker. Astfel, imunosensorii ce folosesc
HRP prezint cea mai sensibil limit de detecie (50 ng/ml).
10. MBUNATATIRI ADUSE N REINEREA ENZIMELOR DE FILMUL DE POLI(PIROL-ALGINAT) N
ELABORAREA BIOSENSORILOR

10.1. Introducere
De-a lungul timpului s-au folosit diferii polimeri naturali i sintetici pentru incapsularea
biomoleculelor, celulelor i microorganismelor pentru scopuri variate. Dintre acestea, alginatul este unul
dintre polimerii naturali cel mai promitor folosit la imobilizarea de celule [203, 204] i enzime [205].
Capitolul de fa ilustreaz superioritatea oferit de un matrix nou sintetizat de pirol-alginat [216]
comparativ cu cel bazat pe alginatul natural n elaborarea biosensorilor. De fapt, idea a fost de a
demonstrata ca dup electropolimerizarea conjugatului de pirol-alginat (Figura 10.1), n condiiile n care
alginatul natural este ndeprtat, alginatul modificat este reinut de suporturi (electrozi) datorit
polimerizrii grupelor pirolice grefate. De asemenea, s-a efectuat o evaluare a cantitii de gluco-oxidaza
pierdut din matrixul de polipirol-alginat ca a fost comparat cu cea din matrixul de alginat natural.
Capitolul descrie performanele analitice ale biosensorilor amperometrici bazai pe matrixul de glucooxidaza-polipirol-alginat i cel de gluco-oxidaza-alginatul natural [228]

Figura 10.1. Reprezentarea schematic a sintezei compusului pirol-alginat.

10.4. Rezultate i discuii


10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat i polipirol-alginat pentru testele electrochimice
Pentru funcionalizarea electrodului de crbune, s-au depozitat pe suprafaa sa 3 l soluie apoas
de alginat sau pirol-alginat (2%, w/v) i lsat s reacioneze timp de 5 minute cu o picatur de 0.1 M CaCl 2
[217]. Prezena acestor geluri conduce la o scdere marcant a intensitii picului reversibil comparativ cu
cel obinut pentru un electrod nemodificat (Figura 10.2).
Ambele geluri au fost oxidate prin controlarea potenialului de electroliz n soluia apoas
coninnd 0.1 M LiClO4 timp de 10 minute la 0.93 V fa de electrodul saturat Ag-AgCl-KCl (Ag/AgCl).
Polimerizarea presupus a pirol-alginatului a fost eficient, deoarece se observ o scdere accentuat (70%) a intensitii picului de oxidare a derivatului de ferocen comparativ cu valoarea sa iniial (34 A)
obinut naintea procesului de electropolimerizare. Acest cretere n rezistena difuzional reflect
formarea lanurilor polimerizate n structura de gel. Din contr, voltamograma ciclic caracteristic oxidrii
aliginatului natural prezint o cretere a intensitii curentului de la 32 la 42A.

Figura 10. 2. Voltamogramele ciclice n prezena ferocenului dicarboxilic n tamponul 0.1M Tris-HCl
(pH = 7) pentru (A) (a) un electrod nemodificat de crbune vitros (diametrul de 5 mm), (b) un electrod
modificat cu pirol-alginat (3 l), (c) un electrod modificat cu polipirol-alginat (3 l) otinut prin

controlarea poteialului de electroliz la 0.93V, (d) identic cu (c) dup imersarea n soluie de etanol (10
min) i 0.1M tampon fosfat (pH 7) pentru alte 10 minute.(B)(e) un electrod modificat cu 3 l alginat, (f) un
electrod modificat cu 3 l alginat dup electroliza la potenial fix de 0.93 V, (g) un electrod modificat
identic cu (e) dup imersarea n soluie de etanol (10 minute) i n soluie de 0.1M tampon fosfat (pH 7, 10
minute). Timpul de gelificare a fost de 5 minute n prezena agentului de gelificare 0.1 M CaCl 2. Viteza de
scanare a fost de 0.1V s-1.
10.4.2. Studii de permeabilitate
Pentru a dovedi prezena lanurilor de polipirol n gelul de alginat, a fost determinat
permeabilitatea filmelor de alginat i polipirol-alginat cu ajutorul experienelor de electrod-disc rotitor
(RDE) la diferite turaii i n prezena 1 mM hidrochinona dizolvat n 0.1 M Tris-HCl (pH = 7) i a
ecuaiilor Gough i Leypoldt descrise n capitolul 4 (Figura 10.4).
Diferena mare de permeabilitate estimat pentru filmul de alginat i polipirol-alginat (3.65 x 10 -1 i
respectiv 2.7 x 10-2 cm s-1) reflect clar mpiedicrile sterice datorate lanurilor de polipirol generate in situ.

Figura 3. Voltamogramele RDE ale electrodului de platin n form de disc (diametru = 5 mm) modificat
cu polipirol-alginat n prezena soluie de hidrochina (1 mM) in tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH=7): (a)
2000; (b) 1500; (c) 1000; (d) 500; (e) 100 rpm/min. Viteza de scanare: 20 mV 1.

Figura 10.4. Graficul Koutecky-Levich pentru un electrod nemodificat (a), modificat cu alginat (b) i
modificat cu polipirol-alginat (c). Soluia test a fost 1 mM hidrochinon n tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH
= 7).
10.4.4. Biosensori amperometrici bazai pe filmele de alginat i polipirol-alginat
Pentru evideierea aplicabilitii noului matrix sintetizat (pirol-alginatul) au fost elaborai

biosensori amperometrici pentru dozarea glucozei. Prin compararea performanelor analitice ale
biosensorilor n ceea ce privete valorile de curent maxim (I max) i de sensibilitate se obin valori superioare
ale Imax = 1.11 A, i sensibilitii = 122 AM -1 pentru filmul de polipirol-alginat, fa de un I max = 0.62 A,
i o sensibilitate = 34 AM-1 obinute pentru filmul de alginat (Figura 10.5).

Figura 10.5. Curbele de calibrare pentru dozarea glucozei nregistrate de electrozii de platin modificai
cu alginat-Gox (3 l) (), polipirol-alginat-Gox (3 l) () i 15 l (), ce au fost poteniostai la 0.6 V n
tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH = 7).
Aceste rezultate confirm faptul c procesul de polimerizare induce o cretere a gradului de retenie
a moleculelor de Gox, contribuind la mbuntirea performanelor biosensorului.
10.5. Concluzii
Rezultatele descrise n acest capitol demonstreaz pentru prima dat abilitatea polimerizrii
electrochimice a unui film de pirol-alginat polimer pre-depozitat pe suprafaa unui electrod sub form de
gel. De asemenea este demonstrat prin studii de permeabilitate i de distrugere organic a celor tipuri de
polimeri (alginat i polipirol alginat) cum unitile de pirol contribuie substanial la mbuntirea
proprietilor mecanice i chimice ale gelului de alginat. Astfel, matrixul de polipirol-alginat electrogenerat
constituie un suport atractiv pentru imobilizarea enzimelor active i n fabricarea potenial a biosensorilor
pentru diagnosticul medical.

11. BIOSENSORI AMPEROMETRICI BAZAI PE GELURI DE ALGINAT I POLIPIROL-ALGINAT CONINND


CELULE ALGALE DE CHLORELLA VULGARIS

11.1. Introducere
Cum a fost menionat in capitolul 10, alginatul face parte din familia de polizaharide liniare ce
conine cantiti variate de reziduuri de acid -D-manuronic i reziduuri de acid -L-guluronic. Aceste
reziduuri pot varia mult ca procent formnd aranjamente compacte de-a lungul lanului polizaharidic.
Cationii divaleni sunt legai de prile de acid guluronic ntr-o manier cooperativ sporit, iar mrimea
unitilor cooperative este mai mare de 20 de monomeri [222].
Alga verde eucariot Chlorella vulgaris este frecvent utilizat pentru studii de imobilizare i
ndeprtarea nutrienilor [223, 224] Celule de C. vulagaris sunt foarte abundente n natura i sunt de
importan major pentru ecosistemul acvatic, fiind considerate bioindicatori naturali ale bioactivitii
reziduurilor industriale. Analiza microscopic a acestor celule, evideniaz o form sferic, de 5-10 mm n

diametru. n domeniul biosensorilor, celulele de C. vulgaris au fost deja utilizate n construirea de


biosensori optici i electrochimici [225, 226].
n acest capitol se descriu avantajele aduse n construirea biosensorilor amperometrici de ctre
noua molecul sintetizat de pirol-alginat (capitolul 10) n comparaie cu cea a alginatului natural pentru
imobilizarea de celule algale de C. Vulgaris [82]].
11.5. Prepararea biosensorului algal
La temperatura camerei (25C) au fost amestecate viguros 5 ml de suspensie celule algale cu 10 ml
alginat (2%, w/v) sau pirol-alginat (2%, w/v). Cele dou amestecuri apoase diferite au fost depozitate pe
suprafaa electrodului de platin (20 l) i acoperii cu o pictur de clorur de calciu (0.1 M) pentru 5
minute. Electrodul modificat cu pirol-alginat a fost ulterior electropolimerizat la temperatura camerei prin
controlarea potenialului de oxidare la 0.94V pentru 10 minute ntr-o soluie apoas coninnd 0.1 M
LiClO4.
11.7. Rezultate i discuii
11.7.1. Compararea electrochimic a stabilitii gelurilor de alginat i poli-pirol alginat ce conin
celule algale
Permeabilitatea ferocenului dicarboxilic (2 mM) dizolvat n tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH 9)
coninnd 1 mM MgCl2 a fost investigat pentru cele dou tipuri de geluri, ilustrnd astfel oxidarea unui
electron la suprafaa electrodului. Figura 11.1A,B prezint voltamogramele ciclice obinute pentru
electrodul nemodificat i modificat cu poli(pirol-alginat-celule algale) la temperatura de 30C.
Prezena gelului de APPyA conduce la o scdere marcant n intensitatea reversibilitii picului de ferocen,
unde valoarea curentului anodic scade de la 130 la 58 A. Dup incubarea acestui electrod modificat n
tamponul agitat magnetic (300 rpm) la 30C pentru 50 de minute, se observ o cretere a curentului anodic
pn la 68 A (Figura 11.1C). Acest cretere minor de curent demonstreaz stabilitatea bun a gelului de

Figura 11.1. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) pentru (A) un electrod de platin
nemodificat la 30C; B) un electrod de Pt modificat cu un gel de poli(pirol-alginat) coniind celule algale
- etapa inial; C) acelai electrod (B) folosit dup 50 de minute ntr-o soluie dimamic tampon.
Potenialul de scanare a fost ntre 0 i 0.7 V fa de Ag/AgCl n 0.1M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM
MgCl2 la 30C. Viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.
APPyA la suprafaa electrodului de platin la 30C.

Cum s-a presupus, depozitul de alginat-celule algale (AA) induce iniial aceleai impiedicri sterice
ca APPyA n ceea ce privete accesul speciei redox, efect ilustrat prin valoare de curent anodic de 60 A
(Figura 11.2A). Din contr, se observ o cretere a curentului anodic pn la 120 A dup imersarea n
soluia de tampon termostat la 30C, indicnd astfel pierderea aproape total a depozitului de alginat n
soluie (Figura 11.2B). Deoarece stabilitatea gelului de alginat a fost influenat de temperatura de 50C, sau efectuat experiene similare cu gelul de AA la temperaturi sczute de 10C i 15C. Din rezultatele
obinute se observ o cretere a curentului anodic de la 60 A la 100 A i respectiv 105 A (Figura 11.2C,
D). Dei creterea temperaturii sporete instabilitatea gelului de AA, la temperaturi sczute de asemenea
AA este instabil la suprafaa electrodului de platin.

Figura 11.2. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) n soluia tampon 0.1 M Tris-HCl
(pH 9) + 1 mM MgCl2 pentru un A) electrod de platin (Pt) modificat cu gel de alginat coninnd celule
algale (faza iniial); B) acelai electrod modificat dup 50 de minute de agitare ntr-o soluie tampon
termostat la 30C. C) acelai AA electrod dup 50 de minute ntr-o soluie dinamic, termostat la 10C;
D) acelai AA electrod dup 50 de minute ntr-o soluie termostat la 15C. Potenialul de scanare a fost
cuprins ntre 0 si 0.7 V fa de Ag/AgCl; viteza de scanare a fost de 0.1 V s -1.

11.7.3. Performanele analitice ale biosensorilor celule algale-alginat i celule algale-pilipirol-alginat


Performanele analitice ale celor dou tipuri de biosensori-algali pentru determinarea pNPP au fost
comparate n condiii de pH optim de 9 i la o temperatur optim de 20C. Sensibilitatea i rspunsul
biosensorului celule algale-polipirol alginat au fost de 2 mAM -1 cm2 i de 15s, iar pentru biosensorul celule
algale-alginat au fost de 4 mAM -1 cm2 i de 5s. Aceste rezultate evideniaz o sensibilitate i un rspunsul
rapid al biosensorului celule algale-alginat mult superioare n comparaie cu cele ale biosensorul celule
algale-polipirol alginat ca urmare a unei poroziti mai bune a gelului nemodificat de alginat ce faciliteaz
creterea proprietilor de difuzie fa de reeaua de polipirol-alginat.
Cum a fost descris n experimentele de voltametrie ciclic, reeaua de polipirol afecteaz profund
accesul speciilor electroactive la suprafaa electrodului.

Stabilitatea operaional a celor dou tipuri de biosensori algali a fost studiat prin nregistrarea
continu a rspunsului de curent maxim (Imax) obinut n prezenta a 1mM pNPP dispersat n soluia agitat
magnetic de 0.1 M Tris-HCl (pH 9, 20C) n funcie de timp. Rspunsul biosensorului a fost stabil pentru
20 i 120 minute pentru gelul de AA i respectiv APPyA
Stabilitatea de stocare a biosensorilor-AA i APPyA la 4C a fost investigat n soluie de tampon
0.1 M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM MgCl 2. Pentru acesta au fost nregistrate rspunsurile de curent
caracteristice biosensorilor n prezena concentraiilor cresctoare de pNPP. Mai mult, se observ cum
sensibilitatea biosensorului bazat pe gelul de APPyA scade la 65% din valoarea iniial a curentului dup
10 zile, n timp ce a fost total distrus sensibilitatea bio-sensorului-AA.
11.7. Concluzii
n acest capitol este prezentat elaborarea reuit a biosensorilor amperometrici cu celule algale de
Chlorella vulgaris incapsulate fie ntr-un gel natural de alginat, fie ntr-un gel sintetic de alginat ce conine
grupri de pirol grefate.
Studiul comparativ al celor dou geluri de alginat ilustreaz prin intermediul activitii fosfatazei
alcaline a celulelor algale incapsulate, rolul benefic jucat de polimerizarea electrochimic a reelei de
polipirol n interiorul gelului de alginat. Acest reea sporete stabilitatea mecanic a gelului n prezena
temperaturilor ridicate (30C) i a convectiei.
CONCLUZII FINALE
Lucrarea de doctorat a avut drept obiective construcia i caracterizarea unor biosensori cu
aplicabilitate n laboratorul medical, n particular a imunosensorilor amperometrici pentru dozarea
enzimelor proteolitice (exemplu: tripsina) ce sunt importante n metabolismul uman, a imunosensorilor
amperometrici pentru dozarea anticorpilor specifici pentru microorganismul Vibrio cholera, a biosensorilor
amperometrici pentru identificarea virusului Nile West, si a biosensorilor ce folosesc un nou matrix
sintetizat -pirol-alginatul- pentru o imobilizare eficient a enzimelor i celulelor (exemplu: celule algale de
Chorella vulgaris), ntruct biosensorii sunt instrumente analitice rapide i ieftine n comparaie cu
metodele convenionale utilizate n monitorizarea sntii oamenilor.
Toi biosensorii fabricai n aceast tez au la baz utilizarea derivailor de pirol [pirol-alchil
amoniu, pirol-biotin, pirol-benzofenona, pirol-hidroxisuccinimida, pirol-alginat, pirol-tris(bipyridin)
ruteniu (II)] care n urma procesului de electropolimerizare asigur formarea reelelor polimerice ce permit
ulterior imobilizarea speciilor biologice (enzime, anticorpi, antigeni, oligonucleotide) n starea lor biologic
activ. Ca urmare, dozarea tripsinei s-a realizat rapid i simplu cu ajutorul unui biosensor amperometric
avnd la baz digestia graduat a unui strat uscat de gelatin (strat format la suprafaa unui electrod de
platin modificat cu filme de polipirol alchil-ammoniu ce conine molecule enzimatice de gluco-oxidaza) n
funcie de concentraia utilizat de tripsin. O limit de detecie foarte sensibil a fost obinut pentru
dozarea tripsinei cu o concentraie de 1 pg/ml unde timpul de rspuns al biosensorului a fost de 10 minute.
n continuare au fost construii biosensori ce sunt capabili de a detecta specific anticorpii

caracteristici holerei (anti-CT) cu ajutorul sistemelor electrochimice ce folosesc markeri enzimatici ca


gluco-oxidaza biotinilat (Gox-B), polifenol oxidaza biotinilat (PPO-B) i peroxidaza (HRP). Limitele de
detecie obinute pentru biosensorii Gox-B, PPO-B, i HRP sunt foarte sensibile de 1 g/ml, 0.1 g/ml i
respectiv 50 ng/ml anti CT, iar timpul de rspuns al celor trei imunosensorii a fost foarte rapid mai puin
de 30 de secunde.
n ceea ce privete detecia virusului Nile West, teza de doctorat descrie 4 tipuri de
(imuno)biosensori: (i) imunosensori pentru detecia anticorpilor IgG specifici virusului Nile West, sensori
bazai pe fotoimobilizarea phagilor-WNV ntr-un film copolimeric format din pirol-benzofenona i
tris(bipiridin-pirol)ruteniu; (ii) imunosensori pentru detecia anticorpilor IgG specifici virusului Nile West,
unde phagilor-WNV sunt incapsulai ntr-un film de polipirol-alchil ammoniu; (ii) sensori cADN derivai
din WNV unde oligonucleotida aminat este grefat de un film electrogenerat de polipirol- substituit cu
grupul de N-hidroxisuccinimida; (iv) sensori cADN derivai din WNV bazai pe utilizarea unui intercalator
redox acridic pentru detecia specific a duplexului-ADN WNV. Limite de detecie remarcabile au fost
obinute pentru biosensorii cu configuraia (ii) de 10 -7 anticorpi-WNV i pentru biosensorii cu configuraia
(iv) de 1 pg/ml oligonucleotid specific pentru WNV. De asemenea timpul de rspuns al acestor biosensori
a fost foarte rapid: ntre 5-20 secunde pentru (ii) i mai puin de 40 de secunde pentru (iv).
n ultima parte a lucrrii de doctorat se prezint fabricarea biosensorilor bazai pe utilizarea unui
nou derivat de pirol (pirol-alginat) ce-i poate gsi aplicaii n laborartorul medical datorit caracterului su
netoxic. Ca exemplu pentru confirmarea capabilitilor acestui nou polimer au fost construii biosensori
enzimatici i biosensori pentru dozarea activitii fosfatazei alcaline caracteristic celulelor algale de
Chlorella vulgaris importante n monitorizarea polurii mediului, ce sunt un bun indiciu de estimare a
declanrii eventualelor maladii umane.
Pentru viitor se sper elaborarea de (imuno)biosensori utili n depistarea timpurie a altor virusuri i
bacterii extrem de periculoase pentru om, n testarea coagulrii sngelui, n moni-torizarea unui tratament
medicamentos a citokinelor i markerilor cardici n unitile de reanimare, precum i n testarea fertilitii i
n monotorizri endocrinologice. n acest sens progresele nregistrate n domeniul nanotechnolgiei [231233] vor favoriza dezvoltarea nano-imunosensorilor, n particular n proteomics (studiul proteinelor) i
cellomics (studiul celulelor).
Unanim acceptat, scopul final al (imuno)biosensorilor este miniaturizarea ce va permite integrarea
tuturor etapelor efectuate n laboratorul medical ntr-un singur dispozitiv -sensor lab-on-chip- care n mare
parte poate fii de unic folosin. Ca un avantaj major, cantitatea de prob lichid (snge, urin, etc)
necesar pentru testarea biochimic se va diminua considerabil, mai puin de < 1 l [234] unde cel mai
probabil elementele de baz pentru construirea unui sensor-integrat miniaturizat vor fii pompele, valvulele,
i un circuit pentru control electronic [235].
De asemenea se sper ca imunosensori implatabili s poat fii comercializai la un pre sczut, ceea
ce va facilita introducerea lor n rutina medical ca o alternativ precis pentru depistarea unei eventuale
maladii.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA

21.

Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Gregoire Herzog, Karine Gorky, Boaz Leshem, Sebastien

Herrmann, Robert S. Marks, Amperometric immunosensor for the detection of anti-Nile West virus IgG
using a photoactive copolymer, Enzyme and Microbial Technology, 40(3), 403-408, (2007).

22.

Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Sebastien Herrmann, Robert S. Marks, Amperometric

immunosensor for the detection of anti-Nile West virus IgG, Anal. Chem., acceptat spre publicare.

48.

Rodica E. Ionescu, Anton Ciucu, Aplicatiile biosensorilor in laboratorul medical, Jurnalul

laboratorului clinic, 2, 4-5, (1998).


54. Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Protease amperometric sensor, Anal. Chem.,
78(18), 6327-6331, 2006.

65.

Razvan Stoia, Adriana Dumitrescu, Ioana Mooiu, Rodica E. Ionescu, Dan Coli, Major

parameters of chronic lymphocytic leukemia, Documenta Haematologica, 3(1), 41- 45, (1999).

78.

Rodica E. Ionescu, Chantal Gondran, Serge Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks,

Comparison between the performances of amperometric immuno-sensors for holera antitoxin based on
three enzyme markers, Talanta, 66 (1), 15-20 (2005).

79. Rodica E. Ionescu, Chantal Gondran, Serge Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks, Construction
of amperometric immuno-sensors based on the electro-generation of a permeable biotinylated
polypyrrole, Anal.Chem, 76( 1), 6808-6813, (2004)

82.

Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah, Serge Cosnier, Claude Durrieu, Jean-Marc Chovelon,
Robert S. Marks, Amperometric algal Chlorella vulgaris cell biosensors based on alginate and
polypyrrole-alginate gels, Electroanalysis 18 (11), 1041-1046, 2006.

86. Rodica E. Ionescu, Sebastien Herrmann, Serge Cosnier, Robert S. Marks, A polypyrrole cDNA
electrode for the amperometric detection of Nile West virus, Electrochem. Comm., 8 (11), 1741-1748
(2006).
87. Serge Cosnier, Rodica E. Ionescu, Sebastien Herrmann, Laurent Bouffier, Martine Demeunynck,
Robert S. Marks, Electroenzymatic polypyrrole-intercalator sensor for the detection of Nile West virus
cDNA, Anal. Chem., 78(19), 7054-7057 (2006).
117. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth, C.R. Lowe, Anal. Chem., 67 (1995) 4229.
118. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth, C.R. Lowe, Sens. Actuators, B: Chem., 33 (1996) 55.
136. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, J. Electrochem. Soc., 127 (1980) 1278.
137. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, Anal. Chem., 51 (1979) 439.
138. J.M. Saveant, J. Electroanal. Chem., 302 (1991) 91.
145. L. Bouffier, M. Demeunynck, A. Millet, P.J. Dumy, J. Org. Chem., 69 (2004) 8144.
150. F. Palmisano, C. Malitesta, D. Centonze, P.G. Zambinin,. Anal. Chem., 67 (1995) 2207.
172. S. Cosnier, B. Galland, C. Gondran, A. Le Pellec, Electroanalysis 10 (1998) 808.
175. S. Cosnier, M. Stoytcheva, A. Senillou, H. Perrot, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, Anal.Chem., 71 (1999)
3692.
176. O. Ouerghi, A. Touhami, N. Jaffrezic- Renault, C. Martelet, H. Ben Ouada, S. Cosnier, Bioelectro-

chemistry 56 (2002) 131.


180. R.S. Marks, E. Bassis, A. Bychenko, M.M. Levine, Opt. Eng., 36 (1997) 3258.
181. T. Konry, A. Novoa, S. Cosnier, R.S. Marks, Anal. Chem., 75 (2003) 2633.
188. C. Mousty, J.L. Bergamasco, R. Wessel, H. Perrot, S. Cosnier, Anal.Chem., 73 (2001) 2890.
198. S. Cosnier, A. Le Pellec, R.S. Marks, K. Perie, J.P. Lellouche, Electrochem. Commun., 5 (2003)
973.
199. S. Cosnier, A. Leppelec, B. Guidetti, I. Rico-Lattes, J. Electroanal. Chem., 449 (1998) 165.
200. R.S. Marks, A. Novoa, D. Thomassay, S. Cosnier, Anal. Bioanal. Chem., 374 (2002) 1056.
203. G. Orive, R.M. Hermandez, A.R. Gascon, R. Calafiore, T.M. Chang, P. De Vos, G. Hortelano, D.
Hunkeler, I. Lacik, A.M. Shapiro, J.L. Pedraz, Nature Medicine 9 (2003) 1104.
204. P.S.J. Cheetham, K.W. Blunt, C. Bucke, Biotechnol. Bioeng., 21 (1979) 2155.
205.

N. Munjal, S.K. Sawhney, Enzyme Microb. Technol., 30 (2002) 613.

216. Khalil Abu-Rabeah, Boris Polyak, Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Synthesis
and characterization of a pyrrole-alginate conjugate and its application in a biosensor construction,
Biomacromolecules, 6(6), 3313-3318, (2005).
217. E. Taqieddin, M. Amiji, Biomaterials 25 (2004) 1937.
222. O. Smidsrod, G. Skjak-Braek, TIBTECH 8 (1990) 71.
225. P. Pandard, D. M. Rawson, Environ. Toxicol. Water. Qual., 8 (1993) 323.
226. C. Chouteau, S. Dzyadevych, C. Durrieu, J.-M. Chovelon, Biosens. Bioelectron., 21 (2005) 273
228. Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Improved enzyme
retention from an electropolymerized polypyrrole-alginate matrix in the development of biosensors,
Electrochem. Commun., 7 (12), 1277-1282, (2005).
231. B.M. Cullum, T. Vo-Dinh, Trends Biotechnol., 18 (2000) 388.
232. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi A.Gheber, Nanolithography using protease etching of
protein surfaces, NanoLetters 3(12), 1639-1642 (2003).
233. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi A. Gheber, Manufacturing of nanochannels with
controlled dimensions using protease nanolithography NanoLetters 5(5), 821-827 (2005).
234. M.I. Song, K. Iwata, M. Yamada, K. Yokoyama, T. Takeuchi, E. Tamiya, I. Karube, Anal. Chem., 66
(1994) 778.
235. R.A. Felder, G.J. Kost, MLO Med. Lab. Obs., 30 (1998) 22.