Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Facultatea de Chimie
Conductor tiinific,
Profesor Dr. Vasile Magearu
Doctorand,
Elena Rodica Ionescu
Bucureti, 2007
CUPRINS
INTRODUCERE................................................................................................................................4
3. SENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA PROTEAZELOR ....................................................7
3.5. Rezultate i discuii...............................................................................................................7
3.5.1. Caracterizarea electrochimic a electrodului modificat cu poly(pirol-alchilamonium)Gox...........................................................................................................................................7
3.5.3. Performanele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei.......................8
4. DETECTAREA AMPEROMETRIC A CADN-ULUI DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST FOLOSIND
ELECTROZI MODIFICAI CU FILMUL DE POLIPIROL..........................................................................10
4.1. Introducere..........................................................................................................................10
4.2.1. Oligonucleodele WNV.................................................................................................10
4.4. Prepararea sensorului ADN...............................................................................................10
4.5. Rezultate i discuii..............................................................................................................11
4.5.1. Elababorarea electrochimic i caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS)..................11
4.5.3. Curba de calibrare amperomtric pentru determinarea concentraiilor de cADN WNV.
................................................................................................................................................12
4.6. Concluzii.............................................................................................................................12
5. SENSOR ELECTROENZIMATIC POLIPIROL-INTERCALATOR PENTRU DETECTAREA CADN DERIVAT
DIN VIRUSUL NILE WEST................................................................................................................12
5.1. Introducere..........................................................................................................................12
5. 4. Rezultate i discuii...........................................................................................................13
5.5. Concluzii.............................................................................................................................14
6. IMUNOSENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IGG FOLOSIND
UN COPOLIMER FOTOACTIV.............................................................................................................15
6.1. Introducere..........................................................................................................................15
6.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un film polimeric..................................................15
6.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul de copolimeric..............................................15
6.4. Rezultate i discuii.............................................................................................................16
6.4.3. Construcia imunosensorului i detecia anticorpilor WNV.........................................16
6.5. Concluzii.............................................................................................................................17
7. IMUNOSENSORUL AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IGG FOLOSIND
INCAPSULAREA PHAGILOR INTR-UN FILM DE POLIPIROL(ALCHIL-AMONIUM).................................17
7.1 Introducere...........................................................................................................................17
7.4. Prepararea imonosensorului-WNV avnd la baz phagi incapsulai ntr-un film de
polipirol......................................................................................................................................18
7.5. Rezultate i discuii.............................................................................................................18
7.5.1. Elaborarea electrozilor modificai cu polimer si phagi................................................18
7.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-phagi WNV.......................................................20
7.5.3. Performanele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV.........................20
7.6. Concluzii.............................................................................................................................21
8. CONSTRUIREA IMUNOSENSORILOR AMPEROMETRICI PENTRU DETERMINAREA ANTICORPILOR
ANTI-HOLER BAZAI PE ELECTROGENERAREA FILMELOR PERMEABILE DE POLIPIROL-BIOTINILAT
........................................................................................................................................................21
8.1. Introducere..........................................................................................................................21
8.5. Prepararea imunosensorului...............................................................................................22
8.7. Rezultate i discuii.............................................................................................................22
8.7.1. Caracterizarea electrochimic a filmului de copolimer format din poli(pirol-biotin) i
poli(pirol-lactobionamid)......................................................................................................22
8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT.......................................24
8.8 Concluzii..............................................................................................................................25
9. COMPARAREA A TREI CONFIGURAII DE IMUNOSENSORI ENZIMATICI PENTRU DETECTAREA
ANTICORPULUI ANTI-TOXINA HOLEREI...........................................................................................25
9.1. Introducere..........................................................................................................................25
9.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici.......................................................................25
9.5. Tranducerea amperometric a imunoreaciei.....................................................................26
9.6. Rezultate i discuii.............................................................................................................27
9.6.1. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP.............28
9.6.2. Performanele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, i PPO-B..........................28
9.6.3. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B i PPO-B ca markeri
enzimatici n construcia de imunosensori.............................................................................29
9.7. Concluzii.............................................................................................................................29
10. MBUNATATIRI ADUSE N REINEREA ENZIMELOR DE FILMUL DE POLI(PIROL-ALGINAT) N
ELABORAREA BIOSENSORILOR........................................................................................................30
10.1. Introducere........................................................................................................................30
10.4. Rezultate i discuii...........................................................................................................30
10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat i polipirol-alginat pentru testele electrochimice 30
10.4.2. Studii de permeabilitate..............................................................................................31
10.4.4. Biosensori amperometrici bazai pe filmele de alginat i polipirol-alginat................32
10.5. Concluzii...........................................................................................................................33
11. BIOSENSORI AMPEROMETRICI BAZAI PE GELURI DE ALGINAT I POLIPIROL-ALGINAT
CONINND CELULE ALGALE DE CHLORELLA VULGARIS...............................................................33
11.1. Introducere........................................................................................................................33
11.5. Prepararea biosensorului algal.........................................................................................33
11.7. Rezultate i discuii............................................................................................................34
11.7.1. Compararea electrochimic a stabilitii gelurilor de alginat i poli-pirol alginat ce
conin celule algale.................................................................................................................34
11.7.3. Performanele analitice ale biosensorilor celule algale-alginat i celule algalepilipirol-alginat.......................................................................................................................35
11.7. Concluzii............................................................................................................................36
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA.......................................................................................................37
* Numerotarea tabelelor, figurilor si cea a indicatiilor bibliografice este cea din teza de doctorat
INTRODUCERE
Bacteriile, virusurile i alte micro-organisme sunt larg rspandite n natur i mediul nconjurtor.
Bacteriile patogene se gsesc n pmnt, n ape, n tractul intestinal al animalelor sau n apele contaminate
cu deeuri fecale. O persoan poart n medie mai mult de 150 de tipuri de bacterii care pot exista att n
interiorul ct i la exteriorul corpului uman. Majoritatea microorganismelor desfoar activiti eseniale
n natur, fiind n numr mare benefice dezvoltrii plantelor i animalelor.
Depistarea rapid i specific a micro-organismelor (bacterii, virusuri) este astfel esenial n
diagnosticarea, tratarea i prevenirea eficient a unei infecii umane. n acest direcie, metodele de
laborator convenionale dei sunt eficiente necesit cteva ore pn la obinerea rezultatelor i un personal
calificat n microbiologie.
n mod curent
microorganismelor, sunt technicile bazate pe utilizarea probelor de acizi nucleici (ADN sau ARN), care
recunosc specific probele complemantare de acizi nucleici, precum i technica de amplificare n lan a
acizilor nucleici PCR- bazat pe o amplificare rapid a ADN-ului sau ARN-ului microbial pentru
identificare. Dei PCR-ul este foarte specific, metoda prezint mai multe dezavantaje: prezena unui person
calificat, un mediu de lucru foarte curat, necesitatea izolrii si caracterizrii genelor unice ale
microoganismului analizat, iar uneori etape suplimentare de lucru pentru eliminarea substanelor inhibitorii.
Marea parte a inconvenienelor ntmpinate n realizarea metodelor clasice de identificare a
microorganimelor sunt eliminate prin introducerea biosensorilor. Astfel, n ultimii ani, se observ un
interes deosebit acordat dezvoltarii technologiei biosensorilor ce este bazat pe cerina din ce in ce mai
ridicat n detectarea rapid i specific ntr-un timp scurt a unui numr sporit de analii, vitali sntii
omului. Prin introducerea biosensorilor n diagnosticarea patogenilor microbieni i a toxinelor biologice se
mbuntete considerabil sensibilitatea i selectivitatea testelor biochimice. Ca urmare, biosensorii
intervin n diagnosticarea clinic (de exemplu determinarea glucozei din snge), n controlul alimentaiei
publice, n bioprocesele de control, i n testarea calitii mediului.
Lucrarea de doctorat prezint construirea reuit a mai multor tipuri de biosensori bazai pe
utilizarea de filme variate de polipirol ce faciliteaz capturarea biomoleculelor i permit dozarea specific
i reproducil a enzimelor, viruilor i bacteriilor cu ajutorul metodelor electrochimice (amperometrie,
voltametrie). Ca i construcie, lucrarea este structurat n dou pri principale care se refer la date din
literatur -PARTEA TEORETIC- primele dou capitole i contribuii originale PARTEA
EXPERIMENTAL prezentate pe parcursul a 9 capitole.
n primul capitol sunt tratate aspecte generale legate de structura virusurilor, bacteriilor i
bacteriophagilor cu descrierea n particular a virusului Nile West i a bacteriei Vibrio cholera ce sunt
studiai (identificai electrochimic) n teza de doctorat precum i metodele fizico-chimice i enzimatice de
identificare a acestora curent folosite n laboratoarele de analize medicale.
n capitolulul 2 se prezint aspectele generale privind construirea biosensorilor (imuno-sensori i
sensori ADN) bazai pe utilizarea de electrozi modificai cu diferite filme polimerice bazate pe derivai ai
pirolului. De asemenea se trateaz succint biochimia general a anticorpilor, acizilor nucleici i a
markerilor enzimatici ce ajut la ntelegerea principiului de funcionare al biosensorilor fabricai n lucrarea
de doctorat.
n capitolul 3 se descrie construirea unui biosensor amperometric folosit n determinarea de
concentraii sczute de proteaze (tripsin). La nceput este prezentat principiul de construcie al sensorului
enzimatic, urmat de discutarea evoluiei amperometrice n timp, ca urmare a aciunii tripsinei asupra unui
strat uscat de gelatin. Biosensorul are la baz digestia unui strat uscat de gelatin depozitat la suprafaa
unui electrod de platin.
n capitolul 4 este prezentat elaborarea unui biosensor amperometric folosit n determinarea
fragmetelor scurte prezintetizate de ADN din virusul Nile West. Biosensorul este bazat pe cuplarea
covalent a unei probe-ADN-aminate de un film de polipirol electrogenerat la suprafaa unui electrod de
platin. Prin cuplarea ulterioar cu ADN-ul target se realizeaz procesul de hibridizare monitorizat prin
intermediul unei probe-ADN biotinilate via interaciei cu avidin.
Capitol 5 descrie un concept original de sensor-ADN, bazat pe identificarea unui ADN derivat din
virusul Nile West prin intermediul unui compus intercalant grefat covalent de un film de polipirol ce
permite ulterior integrarea sa specific n duplexul ADN dup cum arat experienele de voltametrie ciclic
i amperometrie.
n capitolul 6 se descrie construirea unui imunosensor amperometric pentru determinarea
anticorpilor IgG specifici pentru virusul Nile West prin intermediul bacteriophagilor(antigene) - ce poart
un epitop specific pentru virus- fotoimobilizati ntr-un film copolimeric constituit din uniti de pirolbenzofenon i pirol-rutenium. Prezena phagilor grefai precum i influena unui raport optim ntre cei doi
monomeri utilizai este confirmat prin studii de voltametrie ciclic.
n capitolul 7 se prezint fabricarea unui immunosensor amperometric pentru determinarea
anticorpilor IgG specifici virusul Nile West prin intermediul bacteriphagilor incapsulai ntr-un film de
polipirol amfifilic. Optimizarea sistemului de dozare amperometric (cantitatea de phagi depozitat, modul
de electro-polimerizare) este realizat prin voltametria ciclic.
n capitolul 8 se descrie modul de fabricare i de funcionare a unui imunosensor amperometric
original pentru detectarea anticorpilor de holer avnd la baz utilizarea unui copolimer de polipirol-biotin
i polipirol-lactobionamid pentru imobilizarea antigenelor holerei biotinalate prin intermediul interaciei
n acest capitol se prezent o metod original de cuantificare a tripsinei n domeniul picomolar, bazat pe
elaborarea unui biosensor ce are la baz detecia amperometric a curentului nregistrat de un electrod de
platin modificat cu molecule de gluco-oxidaza incapsulate intr-un film de poli(pirol-alchilamonium)
(Figura 3.1.) i ulterior acoperit cu un strat de gelatin ce este supus digestiei proteolitice.
poteniostarea electrozilor modificai la 0.6 V pentru a facilita oxidarea enzimatic a H 2O2 generat la
suprafaa electrodului de platin. Curba de calibrare obinut a fost liniar cu variaiile concentraiei de
glucoz, iar nivelul de saturaie n glucoza - platoul- se atinge la concentraia de 22 mM. Sensibilitatea
biosensorului (definit ca partea liniar iniiala din curba de calibrare) i densitatea maxim a curentului la
saturaie au fost de 23 mA x M -1 x cm-2, respectiv de 102 mA x cm -2. Pentru a cuantifica efectul gelatinei
asupra performaelor analitice ale biosensorului, a fost investigat rspunsul amperometric al sensorului la
injecia a 2 mM glucoz. Aceat concentraie de glucoz a fost aleas ca fcnd parte din reginea linear a
curbei de calibrare, iar rspunsul biosensorului a fost direct proporional cu concentraia substratului [54].
Cum s-a presupus, formarea stratului de gelatin creaz mpiedicri sterice puternice ngreunnd
difuzia glucozei ctre stratul de polimer-Gox i drept urmare se obin un curent diminuat de 5% din
valoarea sa iniial (Figura 3.3b), cazul unui electrod nemodificat cu gelatin (Figura 3.3a). Astfel, dozarea
activitii proteolitice a fost efectuat prin intermediul creterii curentului amperometric datorit degradarii
stratului de gelatin n urma digestiei proteolitice.
Figura 3.3. Evoluia rspunsului biosensorului la injecia glucozei (2mM) ca urmare a degradrii stratului
gelatinic de ctre tripsin (300 g/ml) pe o perioad determinat de timp. (a) nainte modificrii cu
gelatin; (b) dup gelatinare; i la diferite intervale de timp de la imersarea electrodului gelatinat n
soluii de tripsin: (c) 40 s; (d) 60 s; (e) 80 s; (f) 230 s; (g) 5 min; (h) 10 min; (j) 30 min. Biosensorul a fost
poteniostat la 0.6 V n soluia 0.1M PBS (pH 7) supus agiiei magnetice.
3.5.3. Performanele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei
Pentru ilustrarea sensibilitii crescute a biosensorilor de gelatin-Gox pentru digestia proteolitic
(triptic), s-a examinat efectul diferitelor concentraii de tripsin (0,001 pn la 300 g/ml) preparate n 0.1
M PBS asupra sensibilitii biosensorului. Figura 3.4. prezint creterea dramatic a curentului
amperometric n momentul injectrii a 2 mM glucoz pentru concentraii cuprinse ntre 0.1 pn la 300
g/ml. Se observ modificri de curent minore pentru concentraii cuprinse ntre 1 i 100 ng, ceea ce
sugereaz c prezenta metod nu poate fii utilizat pentru determinarea de concentraii de tripsin mai
sczute de 1ng/ml tripsin.
Figure 3.4. Creterea intensitii curentului amperometric pentru sensorii de gelatina-Gox n prezena
glucozei (2mM) pentru diferite concentraii de tripsin dup 1 minut de digestie enzimatic. Creterea este
raportat sub forma de raport a curentului obinut de biosensor i cel obinut iniial n absena gelatinei.
Dozarea tripsinei a fost investigat prin incubarea electrozilor gelatinai 10 minute n soluia de
tripsin. Pentru fiecare concentraie de tripsin au fost preparai trei biosensori individuali gelatin-Gox iar
curentul amperometric medie a fost nregistrat. S-a observat o cretere liniar a curentului cu logaritmul
concentraiilor de tripsin n domeniul de 1 pn la 250 ng/ml (Figura 3.6).
Figura 3.6. Curba de calibrare a tripsinei ilustreaz creterea curentului biosensorilor de gelatina-Gox n
momentul injectrii a 2 mM glucoza pentru diferite concentraii de tripsin i dup un timp de degradare a
gelatinei de 10 minute. Condiiile experimentale au fost identice cu cele din Figura 3.4.
Limita de detecie de 1 ng/ml sau 42 pM este remarcabil, fiind mult mai superioar comparativ cu
ali biosensori 25 nM i 40 ng/ml [117,118]. n plus, aceti biosensori prezint un timp de rspuns de 20 i
60 minute, n timp ce electrozii de gelatin-Gox rspund rapid, dup 1 minut pentru 300 g/ml tripsin sau
n 10 minute pentru 1 ng/ml tripsin.
3. 6. Concluzii
n acest capitol se prezint o metod amperometric original i cu potenial de aplicabilitate n
domeniul medical ca urmare a posibilitii de dozare rapide (10 minute) a unor concentraii foarte sczute
de tripsin de pn la 1ng/ml. Acest metod folosete n prima etap suprimarea rspunsului biosensorului
de ctre un strat uscat de gelatin ce acoper un electrod de platin modificat cu un film de polipirol-alchil
amonium coninnd molecule de gluco-oxidaza incapsulate n reeaua polimeric, iar n etapa secundar se
monitorizeaz evoluia curentului amperometric catalitic aprut n prezena glucozei dup o digestie
triptic progresiv a stratului de gelatin. Digestia proteolitic a stratului de gelatin este foarte rapid n
prezena unei concentraii de 300 g/ml tripsina, conducnd la o cretere continuu a curentului anodic
timp de un minut de tratament cu tripsin. Dup acest timp, se observ un efect toxic al tripsinei asupra
moleculelor de gluco-oxidaza ce induce o scderea progresiv a curentului. Acest efect de toxicitate este
datorat tripsinei ce atac situsurilor de arginin i lizin prezente n Gox. Ca urmare, timpul de dozaj foarte
rapid al tripsinei (1 min), precum i simplicitatea cons-truirii biosensorului enzimatic face ca acest tip de
dozare enzimatic s vin n ajutorul monitorizrii strii de sntate a pacienilor suspeci de dereglri n
nivelul tripsinei.
4. DETECTAREA AMPEROMETRIC A CADN-ULUI DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST FOLOSIND
ELECTROZI MODIFICAI CU FILMUL DE POLIPIROL
4.1. Introducere
n acest capitol prezent o noua strategie de fabricare a sensorilor-ADN bazat pe grefarea chimic
a oligonucleotidelor pornind de la simpla elaborare a filmului de poli(pirol) N-substituit de ctre grupele de
hidroxi-sucinimid (NHS). Secvena cADN a fost sintetizat dintr-o secvena ARN a virusului Nile West
(WNV) (de provenien din Israel) [86]. Detectarea ampero-metric a fragmentelor scurte de cADN WNV
a fost investigat dup producerea procesului de hibridizare, prin intermediul unui marker enzimatic glucooxidaza.
4.2.1. Oligonucleodele WNV
Oligonucleotidele WNV au fost obinute de la Integrated DNA Technologies (IA).
Probe-WNV-DNA (WNVP-21 mer): Amino + 12/5'-CTTTGGTGGAGAGATCGCTGA-3' (-)
Target-WNV-DNA (WNVT-36 mer):
5'-GCTATTTGGCTACCGTCAGCATCTCTCCACCAAAG-3' (+)
Figura 4.2. Fabricarea sensorului cADN WNV. 1. Filmul de poli(pirol-NHS); 2. Cuplarea probei ADN
aminate; 3. Hibridizarea cADN WNV - int; 4. Hibridizarea cu lanul oligonucleotic biotinilat; 5.
Cuplarea gluco-oxidazei cu avidin
i detectarea semnalului.
4.5. Rezultate i discuii
4.5.1. Elababorarea electrochimic i caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS).
Comportamentul electrochimic al monomerului de pirol-NHS (2 mM) a fost investigat n CH 3CN
+ 0.1 M LiClO4. Prin scanarea oxidativ, monomerul prezint un pic ireversibil la 1.08 V (fa Ag/10 mM
Ag+ electrod de referin) ceea ce corespunde oxidrii gruprii pirol n radicali cationici (Figura 4.3A).
Electropolimerizarea monomerului de pirol-NHS a fost realizat prin repetarea ciclrii potenialului pe
intervalul 0 0.95V. Aparena i continuua cresere a picului reversil la 0.48V indic clar formarea filmului
polimeric la suprafaa electrodului (Figura 4.3B). Electrodul modificat a fost transferat n soluia de
CH3CN + 0.1 M LiClO4 fr monomer de pirol-NHS. Dup cum s-a presupus, voltamograma ciclic a
acestui electrod prezint un pic de potenial de oxidare la E1/2 = 0.58 V reflectnd bine cunoscuta
electroactivitate a scheletului polipirolic (Figura 4.3C).
Figura 4.3. Voltamograme ciclice ale filmului de pirol-NHS (2 mM) la suprafaa electrodului de
platin (diametru 5 mm) (A) nainte i (B) n timpul electropolimerizrii prin repetarea potentalului de
scanare n CH3CN + 0.1 M LiClO4, (C) dup tranferul n CH3CN + 0.1 M LiClO4.; viteza de scanare a fost
de 0.1 V s-1.
4.5.3. Curba de calibrare amperomtric pentru determinarea concentraiilor de cADN WNV.
n prezena oxigenului, Gox catalizeaz oxidarea glucozei cu producerea concomitent a H 2O2 ,
care poate fii detectat i cuantificat prin intermediul oxidrii sale electrochimice.
Figura 4.5. prezint rspuns de curent amperometric al sensorului ADN pentru dou concentraii de
glucoz (20 mM i 140 mM) n funcie de concentraia de WNVT, indicnd o limit de detecie extrem de
sensibil i anume de 1 fg ml. -1 Ambele curbe de calibrare cresc cu creterea concentraiei de WNVT
obinndu-se un pseusoplatou peste 500 ng ml. -1
Figura 4.5. Rspunsul de curent amperometric al sensorului cADN la injectarea glucozei (a) 140 mM, (b)
20 mM n funcie de concentraia de WNVT. Potenialul aplicat: 0.6 V n soluia agitat de 0.1 M PBS (pH
= 7).
4.6. Concluzii
n acest capitol este prezentat electrogenerare filmului de polipirol-NHS n combinaie cu procesul
de supraoxidare electrochimic n vederea obinerii unui polimer permeabil pentru grefarea de
oligonucleotide reagentless. Acest legatur chimic a probei cADN WNV de filmul polimeric conduce la
fabricarea unui sensor cADN eficient prin utilizarea unui marker enzimatic ce identific duplexul ADN
format la suprafaa electrodului de platin. Se obine o limit de detecie extrem de sensibil (1 fg ml -1) de
cADN WNV ce este asociat cu o stabilitatea ridicat a rspunsului amperometric.
5. SENSOR ELECTROENZIMATIC POLIPIROL-INTERCALATOR PENTRU DETECTAREA CADN DERIVAT DIN
VIRUSUL NILE WEST
5.1. Introducere
Lund n considerare procesul de intercalare, n acest capitol se propune un concept original de
identificare a secvenei ADN derivate din
virusul
Nile West
Figura 5.1. Structura chimic a derivatului redox de acridona (RAD) (a) i a celui de pirol N-substituit de
grupul N-hydroxysuccinimida 1 (b).
Elaborarea unui sensor genomic WNV a fost astfel selectat ca model pentru investigarea
conceptului de WNV-sensor. Pentru aceasta, determinarea procesului de hibridizare dintre dou
oligonucleotide derivate dintr-un fragment provenind din partea proteic a WNV regiunea codat 11451180 a fost realizat prin capturarea (fishing) duplexului ADN. Ulterior, carac-teristicele analitice ale
sensorului WNV cDNA au fost investigate prin msuratori amperometrice ce folosesc unui marker
enzimatic [87].
5. 4. Rezultate i discuii
Scopul electrozilor modificai a fost acela de a detecta duplexul-ADN dup marcarea cu molecule
de Gox, prin oxidare electrochimic la suprafaa electrodului de platin cu producerea de H 2O2 de ctre
Gox. Oricum, caracterul hidrofobic a filmului poli1 ngreuneaz transformarea H2O2 n ap, influennd
astfel detectarea amperometric. Pentru creterea permebilitii, filmul polimeric [150] a fost superoxidat
prin ciclarea potenialului ntre 0.0V i 1.3V (Figura 5.2B).
Immobilizarea covalent a RAD a fost efectuat la temperatura camerei, prin depositarea unei
soluii apoase de RAD pe electrodul polipirolic modificat (20 l, 140 g/ml) i lsat la incubaie peste
noapte n condiii de mediu umid.
Voltamograma ciclic a electrodului RAD-modificat efectuat n tamponul fosfat deaerat prezint
n regiunea negativ un pic reversibil la 0.35 V, regiune n care filmul poli1 nu este electroactiv (Figura
5.2C). Acest semnal redox este n bun acordan cu valoarea potenialului (- 0.25 V) obtinut pentru
reducerea a RAD-ului n soluie. n plus, intensitate de curent a picului reversibil variaz liniar cu viteza de
scanare, confirmnd astfel grefarea chimic a RAD.
Acoperirea aparent a electrodului cu RAD ( = 2.25 x 10 -9 mol x cm-2) a fost estimat prin
integrarea sarcinii caracteristic picului. Lund n considerare c din punct de vedere teoretic, acoperirea
maxim a suprafeei electrodului cu un strat compact de RAD corespunde la 2.37 x 10 -10 mol x cm-2, se
confirm clar c moleculele de intercalator au fost grefate att la interfaa polimer-solute ct i n interiorul
structurii polipirolice.
Figura 5.2. Voltamogramele ciclice pentru electrodul modificat cu poly(pirol) (diametrul de 5mm): (A)
electroactivitatea polipirolului (B) supraoxidarea polipirolulu (a) primul scan, (b) patru scanari n
CH3CN + 0.1M LiClO4 ; viteza de scanare 0.1 Vs -1 ; (C) dup imobilizarea chimic a RAD n tampon PBS
deaerat, viteza de scanare 20 (a), 50 (b), and 100 (c) mVs -1. (D) Voltamograme ciclice ale electrodului
poly-1-RAD (a) nainte i (b) dup incubarea cu WNV dsDNA (10 ng/mL) n soluie tampon PBS; viteza de
scanare 0.1 Vs-1.
Rspunsul curentului obinut de electrozii modificai (poli1-RAD-dsDNA) la injecia glucozei (20
mM) a fost investigat n tamponul PBS (Figura 5.3). Curentul maxim a fost obinut ntr-un timp foarte scurt
(30-40 secunde). Intensitatea curentului obinut a fost proporional cu concentraia ADNului-int, iar limita
de detecie a fost de 1 mg/ml (90 fM).
Figura 5.3. Rspunsul curentului amprometric pentru sensorii de poli 1 RAD dsADN n funcie de
concentraia de ADN analizat (target). Insertul reprezint curentul otinut de sensorul ADN la injecia
glucozei (20mM) pentru 1 ng/mL de ADN-target. E = 0.6 V/Ag/AgCl.
5.5. Concluzii
n acest capitol s-a prezentat realizarea unui nou tip de sensor genomic amperometric foarte
sensibil pentru detectarea unui singur lan oligonucleotidic (ssADN) derivat dintr-o secven din virusul
virusul virusul Nile West (WNV). Sensorul este bazat pe folosirea unui intercalator-ADN (un derivat redox
acridinic) grefat chimic la suprafaa unui electrod de platin modificat cu un film electropolimerizat de
polipirol N-substituit de ctre gruprile N-hidroxisuccinimida (pyrrole-NHS). Intercalatorul grefat de
electrod se inser n duplexul-ADN format ntre ssADN WNV (analitul) i oligonucleotida
complementar (ssADN) ce este marcat cu uniti biotinice ceea ce, ulterior permite ancorarea unui
marker enzimatic ca gluco-oxidaza prin intermediul intercaiei de afinitate dintre avidin i biotin. Dozajul
amperometric simplu a permis obinerea unei limite de detecie foarte sensibil n domeniul de 1pg/ml
ssADN-WNV.
6. IMUNOSENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS Ig
IgG FOLOSIND UN
COPOLIMER FOTOACTIV
6.1. Introducere
Cu scopul de fabricare a unui imunosensor portabil i necostisitor pentru dozarea anticorpilor WNV
acest capitol prezint elaborarea unui transducer amperometric bazat pe imunoreacia cu phagii-WNV
displayed-epitope imobilizai la suprafaa electrodului de platin (bacteriophagii sunt virusuri ce infecteaz
bacteriile).
In acest capitol se raporteaz elaborarea reauit a unui film copolimeric n scopul utilizrii sale n
construcia de imunosensori, copolimerul avnd la baz doi monomeri pirolici: un monomer fotoactivabil
pirol-benzofenona (monomerul 1) i un monomer cationic tris(bipiridin-pirol)rutenium complex (monomer
2) (Figura 6.1).
a investiga efectul produs de aceast reacie fotochimic, electrozii modificai au fost incubai cu diferite
concentraii de anticorpi-WNV (de la 10 la 10 6). Apoi, electrozii au fost incubai cu cel de-al doilea
anticorp marcat cu peroxidaza din hrean. Recunoaterea anticorpilor-WNV legai de phagi este realizat
prin intermediul unui marcr enzimatic ca peroxidaza. Ulterior, toi imunosensorii-WNV au fost imersai n
soluia de tampon fosfat salin 0.1 M (20 ml, pH 7.2) coninnd 2 mM hidrochinon i poteniostai la 0V.
Dup injectarea peroxidului de hidrogen (2 mM), semnalul amperometric corespunznd reducerii chinonei
produse enzimatic a fost nregistrat n fucie de diluia de anticorpii-WNV (Figura 6.5).
Figura 6.6. Curba de calibrare pentru anticorpii-WNV obtinut de filmele de poli(1-2) n raport de 1:1
prin intermediul imunodozarii electroenzimatice. Potenialul aplicat a fost de 0V in PBS 0.1M (20 ml pH =
7.2)
Fiecare punct din curba de calibrare reprezint media de rspuns n curent nregistrat de trei
imunosensori diferii. Se observ o scdere a semnalului amperometric pentru titrul anticorpilor din
intervalul 1:10 la 1:106 constituind astfel o limit de detecie foarte sensibil.
6.5. Concluzii
n acest capitol este prezent electrogenerarea filmelor de polipirol compuse din grupri de
benzofenon i grupri de tris(bpiridin-pirol) rutenium (II) pentru o imobilizare fotochimic inovatoare a
entitailor biologice, n particular a phagilor virusului Nile West ce-i prezerv proprietile de recunoatere
molecular n prezena anticorpilor specifici. Pentru dozarea reaciilor imunologice s-a utilizat dozajul
amperometric ceea ce permite obinerea unei limite de detecie n intervalul de 1:10 6 ce reprezint titrul
anticorpilor IgG-WNV. Acesta reflect eficiena legrii covalente fotochimice dintre phagii i filmul
polipirolic, fr a afecta ulterior imunoreaciille, precum i o permeabilitate bun a filmului copolimeric
datorat complexului de rutenium ce permite transducerea amperometric a imunoreaciei.
7. IMUNOSENSORUL AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS Ig
IgG FOLOSIND
INCAPSULAREA PHAGILOR INTR-UN FILM DE POLIPIROL(ALCHIL-AMONIUM)
7.1 Introducere
n acest capitol este raportat construcia imunosensorilor amperometrici pentru identificarea rapid
a anticorpilor IgG-WNV folosind filme de poli(pirol-alchilamonium) pentru reinerea phagilor-WNV la
suprafaa electrodului de crbune. Ca urmare au fost investigate proprietile electrochimice ale electrozilor
modificai cu polimer-phagi WNV, iar performanele analitice amperometrice ale imunosensorului cu
configuraie optimizat au fost determinate. Moleculele de phagi au fost modificate cu o secvena de 15
aminoacizi provenii din anvelopa proteic avirusul virusul Nile West virusului (WNV) ce au fost folosii
drept antigeni n loc de virusul propriu-zis (phagi identici cu cei din capitolul 6). Avantajul major al
phagilor const n faptul c sunt inofensivi pentru oameni iar preparea lor nu necesit etape complicate de
execuie.
7.4. Prepararea imonosensorului-WNV avnd la baz phagi incapsulai ntr-un film de polipirol
Dup imobilizarea phagilor de electrod, a fost realizat saturarea eventualelor siturilor nonspecifice de adsopie a proteinelor cu albumina seric bovin (BSA) sporind astfel sensibilitatea testului de
dozare. Soluia blocant a fost preparat zilnic din soluie de tampon fosfat salin (0.1 M PBS, pH = 7.2)
coninnd 5 % (w/v) BSA. Din aceast soluie s-au depozitat 20 l pe electrodul modificat cu filmul
polimeric de poli(pirol-alchilamonium) coninnd particule phagi i incubat pentru 1 ora la temperatura
camerei. Apoi, imunosensorii au fost cltii cu PBS (pH = 7.2) pentru 5 minute i incubai cu 20 l soluie
de anti-IgG WNV de concentraii diferite (de la 10 la 10 7). Anticorpii-WNV au fost diluai cu o soluie de 1
% (w/v) BSA/PBST (PBS coninnd 0.05 % (v/v) Tween-20, PBST) i pstrai la 4C. Electrozii rezultai
au fost clatii pentru 20 de minute cu soluia de PBST. Ulterior electrozii au fost incubai cu 20 l de
solute de anticorpii-IgG marcai cu HRP (10 2) pentru 20 de minute urmnd cltirea lor pentru 20 de minute
cu PBST nainte de efectuarea msurtorilor amperometrice (Figura 7.1).
Figura 7.2. Voltamogramele ciclice ale filmelor adsorbite de monomer de pirol-alchil amonium (120 nmol)
n timpul procesului de polimerizare i a polimerului obinut. (A) monomerul singur; (B) monomerul
amestecat cu 10 l monomerul amestecat cu 20 l phagi; (D) monomerul amestecat cu 30 l phagi.
Electropolimerizarea a fost efectuat timp de 10 minute prin ciclarea potenialului ntre 0 i 0.9V /Ag/AgCl
ntr-o soluie apoas coinnd 0.1M LiClO4, cu o vitez de scanare de 0.1V s-1.
Prezena phagilor imobilizai, densitatea lor i acesibilitatea pentru imunoreacia cu anticorpiiWNV este direct reflectat de intensitatea curentului obinut la reducerea chinonei. Valorile de curent
maxim (Imax) corespunznd a trei cantitai diferite de phagi (10, 20 si 30 l) imobilizate prin CPE sau RPS
sunt schematizate in Tabelul 7.2.
Tabelul 7. 2. Influena diferitelor cantitti de phagi T7-Ep 15x2 incapsulai n filme polimerice de
poli(pirol_alchilamonium) generate fie prin CPE, fie prin RPS asupra rspunsului de curent amperometric
cnd s-a folosit anticorpi-WNV n stare de saturare (1/10 dilutie)a
phagi T7-Ep15x2 (l)
10
20
30
Imax (CPE) (nA)
240
140
70
40
15
10
Figura 7.3. (A) 10 l phagi T7 -Ep 15x2 in prezena a 2 mM soluie de hidrochinon dizolvat in 0.1 M
PBS (pH = 7.2). Voltamogramele electrodului turnant de carbon (diametru de 5 mm) modificat cu filmul
de poli(pirol-amonium): (a) 3000, (b) 2500, (c) 2000, (d) 1500, (e) 1000, si (f) 500 rpm/min. Viteza de
scanare a fost de 0.020 V s -1. (B) Graficul Koutecky-Levich pentru (a) un electrod nemodificat, (b) pentru
un electrod modificat cu un film polimeric i (c) pentru un electrod modificat cu un film polimeric
coninnd 10l phagi T7lEp15x2 phage. Soluia test a fost 2 mM hidrochinon n soluia de 0.1 M PBS
(pH = 7.2).
7.5.3. Performanele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV
Pentru a investiga capabilitile analitice ale electrozilor modificai cu polipirol-phagi pentru
dozarea amperometric a anticorpilor-WNV, electrozii cu phagi au fost incubai cu diferite diluii de
anticorpi-WNV n intervalul de 10 pn la 10 7. Aceste rspunsuri de curent au fost proporionale cu
concentraia anticorpilor, iar limita de detecie a fost de10 7 (Figura 7.4).
8.1. Introducere
Lund n considerare problema permeabilitii sczute a filmelor de polimer biotinilate, n acest
capitol se prezint un nou protocol de construire de imunosensori amperometrici bazai pe electrogenerarea
unui film original de copolimer biotinilat ce prezint o foarte bun permeabilitate, ceea ce permite
tranducerea sa amperometric [79]. Filmul copolimeric prezint grupe de biotin -ce permite ancorarea
anticorpului sau antigenului prin intermediul interaciilor de afinitate cu avidina- i grupe de
lactobionamid ce imbunatesc caracterul hidrofilic al filmului organic electrogenerat i astfel
permeabilitatea sa.
Transducerea implic recunoaterea anticorpilor capturai de ctre cel de-al doilea anticorp
(anticorp secundar)
ngreuneaz difuzia speciilor electroactive ca chinona la suprafaa electrodului [188]. Pentru a mbuntai
detectarea amperometric a chinonei au fost introduse prin electrocopolimerizare grupe hidrofilice de pirollactobionamid n scheletul polimeric de poli-pirol-biotin) pentru a contrabalansarea caracterului su
hidrofobic (Figura 8.2).
Figura 8.3. Voltamogramele ciclice n prezena 1 mM hidrochinon i 0.1 M LiClO 4 n PBS (pH = 7)
pentru (a) un electrod de crbune nemodificat (diametru de 5 mm), (b) un electrod modificat cu poli(pirolbiotin) i poli(pirol-lactobionamid) , (c) un electrod modificat cu polipirol biotin. Viteza de scanare a
fost de 100 mV s-1.
Figura 8.4A prezint voltamogramele de disc-rotitor caractristice filmului copolimeric n soluta
apoas de hidrochinon (1 mM).
Experienele de voltametrie RDE au fost reprezentate sub forma de grafic Koutechy-Levich unde
densitatea de curent limit este reprezentat n funcie de ptratul rdcinii vitezei de rotaie (Figura 8.4B).
Din grafic, se observ un comportament liniar al copolimerului cu aceeai pant ca i electrodul
nemodificat prezentnd o intersecie pozitiv ce permite extragerea raportului D mK/ ca fiind de 2.38 x 10-2
cm s-1.
8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT
Pentru a determina sensibilitatea de dozare a anticorpului-CT, imunosensorii au fost testai cu
diferite concentraii de analit n domeniul de 0.01 -500 g/ml. Prin imersarea imunosensorilor-HRP n
soluia de tampon coninnd 2 mM hidrochinon, curentul de baz s-a stabilizat dup 4 minute iar semnalul
de curent a fost nregistrat dup injectarea peroxidului de hidrogen n celula electrochimic. Curba de
calibrare pentru detectarea amperometric a anticorpului CT a fost obinut dup fiecare concentraie de
anticorp-CT prin nregistrarea a rspunsului de curent caracteristic electrodului modificat (Figura 8.5).
Figura 8.5. Curba de calibrare a imunosensorului-HRP cu anticorpii-CT in intervalul de 0.05 -500 g/ml
folosind sistemul hidrochinona/H2O2.
8.8 Concluzii
n acest capitol se prezint o nou strategie de imobilizare a materialului imunologic de un electrod
modificat cu un film copolimerict pentru dozarea anticorpilor specifici holerei. Studiul efectuat prezint
pentru prima dat
variant de film polimeric eficient pentru ancorarea biomoleculelor n stare lor biologic activ. Datorit
caracterului hidrofilic ridicat, monomerul de pirol-lactobionamid sporete considerabil permeabilitatea
copolimerului pentru speciile electroactive. Acesta a permis detectarea amperometric rapid i foarte
sensibil a anticorpului de holer n combinaie cu un indicator enzimatic (peroxidaza).
9. COMPARAREA A TREI CONFIGURAII DE IMUNOSENSORI ENZIMATICI PENTRU DETECTAREA
ANTICORPULUI ANTI-TOXINA HOLEREI
9.1. Introducere
n acest capitol au fost fabricati imunosensori amperometrici pentru detectarea anti-toxinei holerice
bazai pe imobilizarea materialului imunogenic (subunitatea B a toxinei holerei biotinilat) la suprafaa
electrodului biotinilat, folosind interaciile de afinitate avidin-biotin [78]. Analitul - anticorpul anti-toxina
holerei- a fost detectat folosind alternativ trei markeri enzimatici: anticorpul IgG din iepure marcat cu
peroxidaza (HRP), gluco-oxidaza biotinilata (Gox-B) sau polifenol oxidaza biotinilata (PPO-B) n
combinaie cu avidina legata de anticorpii IgG din iepure care a fost pentru prima data folosit pentru
tranducerea unei imunoreacii. Pentru a asigura accesibilitatea speciilor active la suprafaa electrodului i
imobilizarea calitativ a probei, au fost elaborate puni de avidina-biotina cu un film copolimeric biotinilat
ce a fost obinut prin electropoli-merizarea monomerului de pirol-biotina (pentru interactii de afinitate) si
monomerului de pirol-lactobionamida (pentru mbuntirea permeabili-tii). Prin metoda de
electropolimerizare se asigur formarea unui film controlabil ca grosime, reproductibil, activ cu uniti de
biotin, fr defecte, cu stabilitate chimic i de stocare n timp [172, 175, 176, 188, 198].
9.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici
Electropolimerizarea copolimerului bioti-nilat a fost realizat prin controlarea potenialului de
electroliz la 0.85V n electrolitul de acetonitril coninnd amestecul de monomer de pirol-lactobionamid
(4 mM) i de monomer de pirol-biotin (4 mM). Lund n considerare natura reaciei electroenzimatice
folosite pentru detectarea anticorpului anti-holer, electrozii de platin au fost utilizai pentru sistemul
enzimatic bazat pe Gox-B, n timp ce electrozii de crbune au fost folosii pentru HRP i PPO-B (Figura
9.1).
Figura 9.3. Voltamogramele ciclice ale electrozilor de platin (diametru de 5 mm): (a) electrod
nemodificat, (b) electrod modificat cu copolimerul poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida), (c) electrod
modificat cu polipirolul biotinilat n prezena a 1 mM catecol n soluia apoas de 0.1 M LiClO 4 (pH 7).
Filmele polimerice au fost electrodepozitate prin controlarea potenialului de electroliz la 0.8 V (sarcina
de electropolimerizare a fost de 1 mC). Viteza de scanare a fost de 100 mV s -1.
9.6.1. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP
Configuraia enzimatic cea mai simpl a constat n folosirea anticorpului secundar conjugat cu o
enzim, n cazul de fa HRP. Datori spectrului larg de substrate enzimatice, trei sisteme electroactive
(ferocianura/H2O2, acidul dicarboxilic/H2O2 i hidrochinona/H2O2) au fost alese pentru investigaia
amperometric. Timpul de rspuns pentru toi imunosensorii-HRP a fost extrem de rapid, variind ntre 5 la
30 de secunde. Acesta ilustreaz o permeabilitate bun a filmului copolimeric. Figura 9.4. prezint curbele
de calibrare ale imunosensorilor-HRP pentru detectarea amperometric a anti-CT prin intermediul celor trei
substrate-HRP.
Figura 9.4. Curbele de calibrare pentru anti-CT n cazul imunosensorilor-HRP folosind diferite sisteme de
mediatori redox /H2O2 ;( ) hydrochinona, () ferocianid, () ferocen.
9.6.2. Performanele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, i PPO-B
Sensibilitatea imunosensorului a fost determinat ca panta obinut din partea liniar a curbei de
calibrare. n Tabelul 9.1. sunt prezentate valorile limitei de detecie, sensibilitii i a curentului maxim
(Imax) obinute n condiii de saturare a anti-CT pentru cele trei sisteme de detecie enzimatic.
Sistemul hidrochinona/H2O2 conduce la obinerea celor mai bune performane analitice: cea mai
sczut limit de detecie (50 ng/ml) i cea mai ridicat sensibilitate (1.5 Ag -1ml cm-2). De asemenea, au
fost nregistrate valori ridicate ale Imax pentru formarea teoretic a unui monostrat de anti-CT i astfel a
monostratului de HRP.
Cele mai bune perfomane analitice obinute cu substratul hidrichinon pot fii atribuite
dimensiunilor reduse ale cestui mediator redox comparativ cu ferocianura i ferocenul, conducnd astfel la
o mai bun permeabilitate n filmul copolimeric.
Valorile de detecie de 50 ng/mL anti-CT sunt similare cu cele obinute cu imunosensorii bazai pe
fibre optice folosind anticorpul secundar marcat cu HRP (160 ng/ml) [180, 181, 199, 200].
9.6.3. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B i PPO-B ca markeri enzimatici
n construcia de imunosensori
Cu scopul mbuntirii limitei de detecie, anticorpul secundar marcat cu HRP a fost nlocuit cu
anticorpul-biotinilat. Markerii enzimatici, Gox-B i PPO-B au fost ataai de anticorpul secundar prin
puntea de avidin-biotin.
Figura 9.5A prezint curba de calibrare a imunosensorilor Gox-B n funcie de concentraiile de
anti-CT.
n ceea ce privete PPO-B, polifenol oxidaza biotinilat este folosit pentru prima dat ca marker
enzimatic n fabricarea unui imunosensor. Acest enzim catalizeaz n prezena oxigenului oxidarea
fenolului i o-difenolilor n o-chinona. Ca urmare, detecia amperometric a anti-CT a fost efectuat n
prezena a 10 mM catecol (principalul substrat al PPO) prin poteniostatarea imunosensorilor PPO-B la
-0.2V fa de SCE pentru a reduce o-chinona generat. Figura 6B prezint urba de calibrare pentru
imunosensorii PPO-B n funtie de concentraiile de anti-CT.
Figura 9.5. Curba de calibrare pentru anti-CT folosind (A) imunosensorii Gox-B n prezeta glucozei,
Eapplicat= 0.6V, (B) imunosensorii PPO-B n prezea catecolului; Eaplicat= -0.2V.
9.7. Concluzii
n acest capitol este demonstrat posibilitatea fabricrii de imunosensori pentru dozarea
anticorpilor specifici pentru holera prin intermediul simplei imobilizri a materialului imunologic (toxina
holerei) la suprafaa electrodului modificat cu un nou film de pirol copolimeric ce poart grupri de biotin
si lactobionamid. Interacia antigen-anticorp este dozat amperometric. Datorit permeabilitii bune a
filmului copolimeric, a fost posibil utilizarea a trei sisteme de transducere electroenzimatic (HRP, Gox-B,
PPO-B) pentru detectarea anticorpului de anti-toxina holerei, ce au fost ulterior studiate i comparate n
ceea ce privete performanele analitice obinute pentru fiecare marker. Astfel, imunosensorii ce folosesc
HRP prezint cea mai sensibil limit de detecie (50 ng/ml).
10. MBUNATATIRI ADUSE N REINEREA ENZIMELOR DE FILMUL DE POLI(PIROL-ALGINAT) N
ELABORAREA BIOSENSORILOR
10.1. Introducere
De-a lungul timpului s-au folosit diferii polimeri naturali i sintetici pentru incapsularea
biomoleculelor, celulelor i microorganismelor pentru scopuri variate. Dintre acestea, alginatul este unul
dintre polimerii naturali cel mai promitor folosit la imobilizarea de celule [203, 204] i enzime [205].
Capitolul de fa ilustreaz superioritatea oferit de un matrix nou sintetizat de pirol-alginat [216]
comparativ cu cel bazat pe alginatul natural n elaborarea biosensorilor. De fapt, idea a fost de a
demonstrata ca dup electropolimerizarea conjugatului de pirol-alginat (Figura 10.1), n condiiile n care
alginatul natural este ndeprtat, alginatul modificat este reinut de suporturi (electrozi) datorit
polimerizrii grupelor pirolice grefate. De asemenea, s-a efectuat o evaluare a cantitii de gluco-oxidaza
pierdut din matrixul de polipirol-alginat ca a fost comparat cu cea din matrixul de alginat natural.
Capitolul descrie performanele analitice ale biosensorilor amperometrici bazai pe matrixul de glucooxidaza-polipirol-alginat i cel de gluco-oxidaza-alginatul natural [228]
Figura 10. 2. Voltamogramele ciclice n prezena ferocenului dicarboxilic n tamponul 0.1M Tris-HCl
(pH = 7) pentru (A) (a) un electrod nemodificat de crbune vitros (diametrul de 5 mm), (b) un electrod
modificat cu pirol-alginat (3 l), (c) un electrod modificat cu polipirol-alginat (3 l) otinut prin
controlarea poteialului de electroliz la 0.93V, (d) identic cu (c) dup imersarea n soluie de etanol (10
min) i 0.1M tampon fosfat (pH 7) pentru alte 10 minute.(B)(e) un electrod modificat cu 3 l alginat, (f) un
electrod modificat cu 3 l alginat dup electroliza la potenial fix de 0.93 V, (g) un electrod modificat
identic cu (e) dup imersarea n soluie de etanol (10 minute) i n soluie de 0.1M tampon fosfat (pH 7, 10
minute). Timpul de gelificare a fost de 5 minute n prezena agentului de gelificare 0.1 M CaCl 2. Viteza de
scanare a fost de 0.1V s-1.
10.4.2. Studii de permeabilitate
Pentru a dovedi prezena lanurilor de polipirol n gelul de alginat, a fost determinat
permeabilitatea filmelor de alginat i polipirol-alginat cu ajutorul experienelor de electrod-disc rotitor
(RDE) la diferite turaii i n prezena 1 mM hidrochinona dizolvat n 0.1 M Tris-HCl (pH = 7) i a
ecuaiilor Gough i Leypoldt descrise n capitolul 4 (Figura 10.4).
Diferena mare de permeabilitate estimat pentru filmul de alginat i polipirol-alginat (3.65 x 10 -1 i
respectiv 2.7 x 10-2 cm s-1) reflect clar mpiedicrile sterice datorate lanurilor de polipirol generate in situ.
Figura 3. Voltamogramele RDE ale electrodului de platin n form de disc (diametru = 5 mm) modificat
cu polipirol-alginat n prezena soluie de hidrochina (1 mM) in tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH=7): (a)
2000; (b) 1500; (c) 1000; (d) 500; (e) 100 rpm/min. Viteza de scanare: 20 mV 1.
Figura 10.4. Graficul Koutecky-Levich pentru un electrod nemodificat (a), modificat cu alginat (b) i
modificat cu polipirol-alginat (c). Soluia test a fost 1 mM hidrochinon n tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH
= 7).
10.4.4. Biosensori amperometrici bazai pe filmele de alginat i polipirol-alginat
Pentru evideierea aplicabilitii noului matrix sintetizat (pirol-alginatul) au fost elaborai
biosensori amperometrici pentru dozarea glucozei. Prin compararea performanelor analitice ale
biosensorilor n ceea ce privete valorile de curent maxim (I max) i de sensibilitate se obin valori superioare
ale Imax = 1.11 A, i sensibilitii = 122 AM -1 pentru filmul de polipirol-alginat, fa de un I max = 0.62 A,
i o sensibilitate = 34 AM-1 obinute pentru filmul de alginat (Figura 10.5).
Figura 10.5. Curbele de calibrare pentru dozarea glucozei nregistrate de electrozii de platin modificai
cu alginat-Gox (3 l) (), polipirol-alginat-Gox (3 l) () i 15 l (), ce au fost poteniostai la 0.6 V n
tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH = 7).
Aceste rezultate confirm faptul c procesul de polimerizare induce o cretere a gradului de retenie
a moleculelor de Gox, contribuind la mbuntirea performanelor biosensorului.
10.5. Concluzii
Rezultatele descrise n acest capitol demonstreaz pentru prima dat abilitatea polimerizrii
electrochimice a unui film de pirol-alginat polimer pre-depozitat pe suprafaa unui electrod sub form de
gel. De asemenea este demonstrat prin studii de permeabilitate i de distrugere organic a celor tipuri de
polimeri (alginat i polipirol alginat) cum unitile de pirol contribuie substanial la mbuntirea
proprietilor mecanice i chimice ale gelului de alginat. Astfel, matrixul de polipirol-alginat electrogenerat
constituie un suport atractiv pentru imobilizarea enzimelor active i n fabricarea potenial a biosensorilor
pentru diagnosticul medical.
11.1. Introducere
Cum a fost menionat in capitolul 10, alginatul face parte din familia de polizaharide liniare ce
conine cantiti variate de reziduuri de acid -D-manuronic i reziduuri de acid -L-guluronic. Aceste
reziduuri pot varia mult ca procent formnd aranjamente compacte de-a lungul lanului polizaharidic.
Cationii divaleni sunt legai de prile de acid guluronic ntr-o manier cooperativ sporit, iar mrimea
unitilor cooperative este mai mare de 20 de monomeri [222].
Alga verde eucariot Chlorella vulgaris este frecvent utilizat pentru studii de imobilizare i
ndeprtarea nutrienilor [223, 224] Celule de C. vulagaris sunt foarte abundente n natura i sunt de
importan major pentru ecosistemul acvatic, fiind considerate bioindicatori naturali ale bioactivitii
reziduurilor industriale. Analiza microscopic a acestor celule, evideniaz o form sferic, de 5-10 mm n
Figura 11.1. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) pentru (A) un electrod de platin
nemodificat la 30C; B) un electrod de Pt modificat cu un gel de poli(pirol-alginat) coniind celule algale
- etapa inial; C) acelai electrod (B) folosit dup 50 de minute ntr-o soluie dimamic tampon.
Potenialul de scanare a fost ntre 0 i 0.7 V fa de Ag/AgCl n 0.1M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM
MgCl2 la 30C. Viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.
APPyA la suprafaa electrodului de platin la 30C.
Cum s-a presupus, depozitul de alginat-celule algale (AA) induce iniial aceleai impiedicri sterice
ca APPyA n ceea ce privete accesul speciei redox, efect ilustrat prin valoare de curent anodic de 60 A
(Figura 11.2A). Din contr, se observ o cretere a curentului anodic pn la 120 A dup imersarea n
soluia de tampon termostat la 30C, indicnd astfel pierderea aproape total a depozitului de alginat n
soluie (Figura 11.2B). Deoarece stabilitatea gelului de alginat a fost influenat de temperatura de 50C, sau efectuat experiene similare cu gelul de AA la temperaturi sczute de 10C i 15C. Din rezultatele
obinute se observ o cretere a curentului anodic de la 60 A la 100 A i respectiv 105 A (Figura 11.2C,
D). Dei creterea temperaturii sporete instabilitatea gelului de AA, la temperaturi sczute de asemenea
AA este instabil la suprafaa electrodului de platin.
Figura 11.2. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) n soluia tampon 0.1 M Tris-HCl
(pH 9) + 1 mM MgCl2 pentru un A) electrod de platin (Pt) modificat cu gel de alginat coninnd celule
algale (faza iniial); B) acelai electrod modificat dup 50 de minute de agitare ntr-o soluie tampon
termostat la 30C. C) acelai AA electrod dup 50 de minute ntr-o soluie dinamic, termostat la 10C;
D) acelai AA electrod dup 50 de minute ntr-o soluie termostat la 15C. Potenialul de scanare a fost
cuprins ntre 0 si 0.7 V fa de Ag/AgCl; viteza de scanare a fost de 0.1 V s -1.
Stabilitatea operaional a celor dou tipuri de biosensori algali a fost studiat prin nregistrarea
continu a rspunsului de curent maxim (Imax) obinut n prezenta a 1mM pNPP dispersat n soluia agitat
magnetic de 0.1 M Tris-HCl (pH 9, 20C) n funcie de timp. Rspunsul biosensorului a fost stabil pentru
20 i 120 minute pentru gelul de AA i respectiv APPyA
Stabilitatea de stocare a biosensorilor-AA i APPyA la 4C a fost investigat n soluie de tampon
0.1 M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM MgCl 2. Pentru acesta au fost nregistrate rspunsurile de curent
caracteristice biosensorilor n prezena concentraiilor cresctoare de pNPP. Mai mult, se observ cum
sensibilitatea biosensorului bazat pe gelul de APPyA scade la 65% din valoarea iniial a curentului dup
10 zile, n timp ce a fost total distrus sensibilitatea bio-sensorului-AA.
11.7. Concluzii
n acest capitol este prezentat elaborarea reuit a biosensorilor amperometrici cu celule algale de
Chlorella vulgaris incapsulate fie ntr-un gel natural de alginat, fie ntr-un gel sintetic de alginat ce conine
grupri de pirol grefate.
Studiul comparativ al celor dou geluri de alginat ilustreaz prin intermediul activitii fosfatazei
alcaline a celulelor algale incapsulate, rolul benefic jucat de polimerizarea electrochimic a reelei de
polipirol n interiorul gelului de alginat. Acest reea sporete stabilitatea mecanic a gelului n prezena
temperaturilor ridicate (30C) i a convectiei.
CONCLUZII FINALE
Lucrarea de doctorat a avut drept obiective construcia i caracterizarea unor biosensori cu
aplicabilitate n laboratorul medical, n particular a imunosensorilor amperometrici pentru dozarea
enzimelor proteolitice (exemplu: tripsina) ce sunt importante n metabolismul uman, a imunosensorilor
amperometrici pentru dozarea anticorpilor specifici pentru microorganismul Vibrio cholera, a biosensorilor
amperometrici pentru identificarea virusului Nile West, si a biosensorilor ce folosesc un nou matrix
sintetizat -pirol-alginatul- pentru o imobilizare eficient a enzimelor i celulelor (exemplu: celule algale de
Chorella vulgaris), ntruct biosensorii sunt instrumente analitice rapide i ieftine n comparaie cu
metodele convenionale utilizate n monitorizarea sntii oamenilor.
Toi biosensorii fabricai n aceast tez au la baz utilizarea derivailor de pirol [pirol-alchil
amoniu, pirol-biotin, pirol-benzofenona, pirol-hidroxisuccinimida, pirol-alginat, pirol-tris(bipyridin)
ruteniu (II)] care n urma procesului de electropolimerizare asigur formarea reelelor polimerice ce permit
ulterior imobilizarea speciilor biologice (enzime, anticorpi, antigeni, oligonucleotide) n starea lor biologic
activ. Ca urmare, dozarea tripsinei s-a realizat rapid i simplu cu ajutorul unui biosensor amperometric
avnd la baz digestia graduat a unui strat uscat de gelatin (strat format la suprafaa unui electrod de
platin modificat cu filme de polipirol alchil-ammoniu ce conine molecule enzimatice de gluco-oxidaza) n
funcie de concentraia utilizat de tripsin. O limit de detecie foarte sensibil a fost obinut pentru
dozarea tripsinei cu o concentraie de 1 pg/ml unde timpul de rspuns al biosensorului a fost de 10 minute.
n continuare au fost construii biosensori ce sunt capabili de a detecta specific anticorpii
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA
21.
Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Gregoire Herzog, Karine Gorky, Boaz Leshem, Sebastien
Herrmann, Robert S. Marks, Amperometric immunosensor for the detection of anti-Nile West virus IgG
using a photoactive copolymer, Enzyme and Microbial Technology, 40(3), 403-408, (2007).
22.
immunosensor for the detection of anti-Nile West virus IgG, Anal. Chem., acceptat spre publicare.
48.
65.
Razvan Stoia, Adriana Dumitrescu, Ioana Mooiu, Rodica E. Ionescu, Dan Coli, Major
parameters of chronic lymphocytic leukemia, Documenta Haematologica, 3(1), 41- 45, (1999).
78.
Rodica E. Ionescu, Chantal Gondran, Serge Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks,
Comparison between the performances of amperometric immuno-sensors for holera antitoxin based on
three enzyme markers, Talanta, 66 (1), 15-20 (2005).
79. Rodica E. Ionescu, Chantal Gondran, Serge Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks, Construction
of amperometric immuno-sensors based on the electro-generation of a permeable biotinylated
polypyrrole, Anal.Chem, 76( 1), 6808-6813, (2004)
82.
Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah, Serge Cosnier, Claude Durrieu, Jean-Marc Chovelon,
Robert S. Marks, Amperometric algal Chlorella vulgaris cell biosensors based on alginate and
polypyrrole-alginate gels, Electroanalysis 18 (11), 1041-1046, 2006.
86. Rodica E. Ionescu, Sebastien Herrmann, Serge Cosnier, Robert S. Marks, A polypyrrole cDNA
electrode for the amperometric detection of Nile West virus, Electrochem. Comm., 8 (11), 1741-1748
(2006).
87. Serge Cosnier, Rodica E. Ionescu, Sebastien Herrmann, Laurent Bouffier, Martine Demeunynck,
Robert S. Marks, Electroenzymatic polypyrrole-intercalator sensor for the detection of Nile West virus
cDNA, Anal. Chem., 78(19), 7054-7057 (2006).
117. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth, C.R. Lowe, Anal. Chem., 67 (1995) 4229.
118. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth, C.R. Lowe, Sens. Actuators, B: Chem., 33 (1996) 55.
136. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, J. Electrochem. Soc., 127 (1980) 1278.
137. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, Anal. Chem., 51 (1979) 439.
138. J.M. Saveant, J. Electroanal. Chem., 302 (1991) 91.
145. L. Bouffier, M. Demeunynck, A. Millet, P.J. Dumy, J. Org. Chem., 69 (2004) 8144.
150. F. Palmisano, C. Malitesta, D. Centonze, P.G. Zambinin,. Anal. Chem., 67 (1995) 2207.
172. S. Cosnier, B. Galland, C. Gondran, A. Le Pellec, Electroanalysis 10 (1998) 808.
175. S. Cosnier, M. Stoytcheva, A. Senillou, H. Perrot, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, Anal.Chem., 71 (1999)
3692.
176. O. Ouerghi, A. Touhami, N. Jaffrezic- Renault, C. Martelet, H. Ben Ouada, S. Cosnier, Bioelectro-
216. Khalil Abu-Rabeah, Boris Polyak, Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Synthesis
and characterization of a pyrrole-alginate conjugate and its application in a biosensor construction,
Biomacromolecules, 6(6), 3313-3318, (2005).
217. E. Taqieddin, M. Amiji, Biomaterials 25 (2004) 1937.
222. O. Smidsrod, G. Skjak-Braek, TIBTECH 8 (1990) 71.
225. P. Pandard, D. M. Rawson, Environ. Toxicol. Water. Qual., 8 (1993) 323.
226. C. Chouteau, S. Dzyadevych, C. Durrieu, J.-M. Chovelon, Biosens. Bioelectron., 21 (2005) 273
228. Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Improved enzyme
retention from an electropolymerized polypyrrole-alginate matrix in the development of biosensors,
Electrochem. Commun., 7 (12), 1277-1282, (2005).
231. B.M. Cullum, T. Vo-Dinh, Trends Biotechnol., 18 (2000) 388.
232. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi A.Gheber, Nanolithography using protease etching of
protein surfaces, NanoLetters 3(12), 1639-1642 (2003).
233. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi A. Gheber, Manufacturing of nanochannels with
controlled dimensions using protease nanolithography NanoLetters 5(5), 821-827 (2005).
234. M.I. Song, K. Iwata, M. Yamada, K. Yokoyama, T. Takeuchi, E. Tamiya, I. Karube, Anal. Chem., 66
(1994) 778.
235. R.A. Felder, G.J. Kost, MLO Med. Lab. Obs., 30 (1998) 22.