CITOLOGIE ANIMALĂ

Anul I Biologie
Anul I Biochimie
LUCRĂRI PRACTICE

Conf.dr. Marina Nechifor

 TEHNICI UTILIZATE ÎN
BIOLOGIA CELULARĂ
 1. Microscopia optică
 - microscopia optică convenţională
 - microscopia de fluorescenţă
 - microscopia cu contrast de fază
 2. Microscopia electronică
 3. Tehnici de fracţionare celulară
 4. Metode de izolare şi purificare a materialului
biologic
 5. Tehnici de culturi celulare
 6. Metode bazate pe folosirea izotopilor radioactivi şi a
anticorpilor
 7. Tehnologia ADN recombinant
Imagini de microscopie optică
Imagini de microscopie electronică
 Obţinerea omogenatelor celulare şi
fracţionarea lor prin centrifugare
 În Biologia Celulară prin metode de omogenizare se
înţeleg metodele de disociere a celulelor în elementele lor
componente.

 Omogenizarea ţesuturilor şi celulelor - orice tehnică de

omogenizare trebuie să acţioneze asupra celulelor într-o
manieră care să provoace ruperea suprafeţei celulare şi
să elibereze citosolul şi organitele.

 Principalul scop este acela de a găsi condiţiile

reproductibile în care ruperea celulelor să se producă cu
eficienţă maximă, dar utilizând un minimum de forţe
distructive, astfel încât să nu provoace leziuni ale
organitelor de interes şi să se evite denaturarea proteinelor.
 Omogenat celular
 Pentru obţinere omogenatului celular se
porneşte de la 2 componente:
 Materialul biologic (organul, ţesutul sau
suspensia de celule) care este supus
omogenizării;
 Mediul de omogenizare ce reprezintă soluţia
apoasă ce urmează a realiza dispersia efectivă a
elementelor subcelulare.
 MATERIALUL BIOLOGIC

 Să conţină organitele ce urmează a fi investigate

în cantitate mare;
 Să poată fi prelucrat cu un minim de dificultăţi
tehnice, în conditii controlate, reproductibile, care
să evite apariţia de artefacte;
 Să fie bine delimitat din punct de vedere anatomic
şi relativ uşor accesibil pentru a scurta timpul de
prelevare şi pentru a evita pericolul confuziei cu
alte ţesuturi sau organe.
Omogenizator POTTER-ELVEHJEM
 Omogenizatorul Potter-Elvehjem este
format din:
 - piston de sticla sau teflon;
 - eprubetă din sticlă sau teflon,

între care există un spaţiu foarte mic

(~0,2mm).
Pistonul este antrenat de un motor
electric pentru a efectua o mişcare de
rotatţe (circa 1000 ture/min) şi în acelaşi
timp se realizează şi o mişcare în sus şi
în jos a eprubetei ce conţine mediul de
omogenizare şi ţesutul. Acesta din urmă
este forţat să treacă prin spaţiul dintre
piston şi peretele interior al eprubetei,
spaţiu în care se dezvoltă forţe de
forfecare extrem de mari, ce produc la
început mărunţirea ţesutului şi apoi
ruperea membranelor celulare.
MEDIUL în care se realizează
omogenizarea
 Menţinerea unor condiţii cat mai apropiate mediului intern
al organismului (soluţii tampon, agenţi osmotici).
 Limitarea, pe cât posibil, a acţiunii enzimelor autolitice,
pentru a reduce gradul în care acestea afectează structura şi
funcţionalitatea particulelor subcelulare (substanţe cu efect de
chelare a ionilor divalenţi, inhibitori ai proteazelor
intracelulare).

RAPORTUL DE OMOGENIZARE
În mod tradiţional, de foloseşte un raport de omogenizare
1:10 (g/v) între cantitatea de ţesut şi volumul de mediu de
omogenizare utilizat, însa este posibilă varierea acestui raport
în funcţie de necesităţi.
Centrifuga cu răcire
Centrifugarea: cea mai comodă şi mai frecvent
utilizată metodă de realizare a fracţionării omogenatelor
celulare
Prin rotirea centrifugii cu viteza
unghiulară ω, se constată că
se produce o deplasare a unei
particule, cu o viteza dată de
expresia:

dx (V   p  V   m )    x
2

v 
dt Ff
Relaţia lui Svedberg

2 R 2 ( p  m )   2  x
v
9

 Din relaţia lui Svedberg se deduce că diferenţa

de densitate dintre mediu şi particulă decide
direcţia deplasării particulei, iar viteza deplasării
acesteia depinde preponderent de dimensiunea
sa.
Coeficientul de sedimentare
 Coeficientul de sedimentare al unei particule S
reprezintă viteza de sedimentare a unei particule
într-un camp centrifugal de valoare unitară (=1).
 Coeficientul de sedimentare depinde exclusiv de
mediul de centrifugare şi de caracteristicile
particulei şi are drept unitate de măsură
svedbergul [S].

v 2R2 ( p  m )
S 2 
 x 9
 Acceleraţia centrifugală căreia îi este supusă o particulă
depinde de parametrii funcţionali ai aparatului în care se
realizează procesul:
 raza rotorului = r;

 viteza de rotire = ω

fiind posibilă utilizarea unor combinaţii diferite ale celor 2

parametri pentru generarea unei valori unice a acceleraţiei
centrifugale. De aceea, pentru a se descrie în mod univoc
condiţiile de centrifugare, se obişnuieşte să se specifice
acceleraţia centrifugală sub forma de multiplii de g
(acceleraţia gravitaţională - 9,81 m/s2).

 2 x 4 2 n 2 x

g 3600 * g
 n = nr de rotaţii/minut
 x = raza medie a rotorului
 g = acceleraţia gravitaţională
Condiţii de realizare a separării centifugale a
particulelor dintr-un omogenat celular
 separarea în funcţie de dimensiune şi formă, mediul
în care sunt suspendate având densitatea mai mică
decât a lor şi constantă în tot tubul de centrifugă, situaţie
denumită centrifugare diferenţială (se realizează prin
aplicarea unor acceleraţii centrifugale succesiv
crescătoare);
 separarea pe baza diferenţelor de densitate, într-un
mediu a cărui densitate variază continuu sau în trepte
de-a lungul tubului de centrifugă spre valori din ce în ce
mai mari, fiecare particulă deplasându-se până în zona
de izodensitate, unde se stabilizează, ceea ce
corespunde centrifugarii izopicnice (denumită şi
centrifugare în gradient de densitate)
densitate
Centrifugarea diferenţială
1 2
3 4
Centifugarea în
gradient de densitate
Schema de fracţionare celulară prin
centrifugare diferenţială
Separarea lizosomilor, mitocondriilor şi peroxisomilor
prin centrifugare în gradient de densitate
 Integritatea structurală şi identitatea a
fracţiilor subcelulare

 Integritatea structurală şi identitatea a fracţiilor

subcelulare obţinute prin centrifugare se stabileşte
şi prin observarea lor la microscopul cu contrast de
fază, ori după colorarea specifică prin metode
histochimice sau histoenzimologice, prin
microscopia cu câmp luminos.
 De asemena este utilă studierea distribuţiei unor
enzime marker, a căror localizare exclusivă la
nivelul anumitor organite celulare a fost bine
documentată prin studii anterioare.