II.

CROMATOGRAFIA
Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodat de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie ntre doua faze. Una dintre faze este imobila i poarta denumirea de faza stationara (aflata de regula ntr-un tub numit coloana) iar cealalta faza mobila, denumit i eluent, se deplaseaza prin golurile primei faze. Separarea pe cale cromatografic a speciilor chimice dintr-un amestec se petrece ntr-o coloana cromatografica, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobila, - ce se scurge continuu, cu viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoac migrarea, cu viteze diferite, a celor n componente ale amestecului de-a lungul coloanei. Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la gazcromatografie i pomp de nalt presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si se afla initial fixat ntr-o zona ngusta de la nceputul coloanei. Antrenai de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenie si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza n grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila sesizarea pe rnd a componentilor, la prsirea coloanei cromatografice de catre un detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (n mod ideal la oricare) dintre speciile moleculare ce traverseaz coloana ceomatografic. Detectorul d un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component n faza mobila. Intr-o exprimare plastic se poate spune c detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce compun initial amestecul analizat n mod similar cu un sistem Video care nregistreaza trecerea liniei de sosire de ctre concurenti n atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme Dac se inregistreaz semnalele date de detector in funcie de timp se ob ine o cromatogram. Pe cromatograma se disting o serie de maxime, numite peak-uri (peak engl. = vrf), care se produc deasupra liniei de baza sau a portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. In cazul ideal, oricare peak are forma distributiei normale

Gauss. In cazul introducerii unui singur component intr-un eluent inert se obine cea mai simpl cromatogram posibil de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului exprimat n unitati arbitrare. In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de baz: 1. Peak- urile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele doua semnale sau vrfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate n toate metodele cromatografice n scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in amestecul analizat. In acest sens inlimea peak-ului sau suprafaa lui reprezint o msur a concentraiei speciei chimice i timpul de sosire la detector ( denumit timp de retenie) reprezint o caracteristic a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogram este asemntoare cu o spectrogram. Diferenele intervin la faptul c la o spectrogram identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de und care este o constant fizic, iar la o cromatogram identificarea speciilor se face prin timpul de retenie care este o mrime caracteristic numai in conditii date de temperatur, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe cromatografia este superioar spectrometriei. La analiza spectrometric a unor amestecuri complexe, cu lungimi de und specifice apropiate pentru unele specii chimice, se poate ajunge la identificri greite. Asemenea erori snt excluse la cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferii prin dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclus att confuzia acestora ct i posibilitatea ca acestia s prseasc coloana neidentificai . Primul peak din cromatogram, de nlime mai redus, corespunde unui component inert ( gazul purttor n cromatografia de gaze sau diluantul lichid in cromatografia de lichide ) - care este retinut n foarte mic msur de coloana cromatografic. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice n cazul de fata) analizate. Sosirea intirziat a grupului de molecule a acestei specii fa de eluent se datoreaz staionarii mai ndelungate n coloana cromatografic ca urmare afinitii mai mari a acestei specii fa de materialul coloanei. Gradul de afinitate este exprimat prin numrul absorbiilor i desorbiilor repetate de pe umplutura sau pere ii coloanei i este o caracteritric a naturii speciilor analizate. Cu ct numrul absorbiilor i desorbiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de ctre o specie chimic cu att mai trziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet neretinut de catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pna la detector. Acesta nu poate fi zero. n cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloana si aparitia maximului de concentratie n detector, pentru componentul neretinut. Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si aparitia maximului de concentratie n detector. De exemplu, n cazul prezentat anterior n fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pna la verticala prin vrful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur sau n amestec.

Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea compara timpii masurati pe coloane diferite, n cazul aceluiai component - este dat de diferenta: tR' = tR - tM Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Qe): VR = tRQe

Volum de retentie ajustat VR' are expresia : VR' = VR - VM unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsul: VM = tMFe si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la coloana la detector. Factorul de reinere k ( factorul de capacitate ). Din cromatogram din fig. 1 se observ c natura speciilor chimice poate fi interpretat prin prisma timpului de retenie tr acest timp depinde ns pe lng natura specieiei i de ali factori precum : lungimea coloanei, natura i granulaia umpluturii, etc, ca atare timpul de reinere poate fi considerat specific naturii speciilor chimice numai n condiii precis definite neavnd un caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativ este folosit factorul de reinere (k) denumit in literatur i factor de capacitate:

k=

tr t0 t0

un factor de kapacitate de valoare mic indic o rezoluie de identificare sczut iar un factor de capacitate de valoare mare indic un timp de separare i de analiz mare cu efect negativ asupra producivitii. Din punct de vedere al ordinului de mrime factorul de capacitate trebuie s se situeze intre 1 i 10. Gradul de separare a doi componeni () - exprim gradul de separare cromatografic a dou substane i este definit ca raport intre factorul k de reinere a celor doi componeni :

k 2 t r2 t 0 = k1 t r1 t 0

Eficiena unei coloane cromatografice . Ca msur a eficenei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie numrul N de talere teoretice necesare separrii fie este folosit nlimea teoretic H a talerului. Teoria talerelor se bazeaz pe conceptul c o coloan cromatografic poate fi asimilat cu o mulime de minicoloane

(talere) lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizndu-se echilibrul ntre faza mobil i cea staionar . n acest concept se ia in considerare situaia n care un taler realizeaz singur separarea cromatografic a componentelor, este evident c pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de efectuare a unei cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic cu umplutur pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele comerciale conin cca 50.000 talere pe metru dac este vorba de particule cu diametrul de 5 m sau cca 25.000 talere pe metru liniar dac este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 m. In general eficiena unei coloane cromatografice de separare crete atunci cnd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere necesar ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:

L H unde: L - lungimea coloanei msurat de la sistemul de injecie pn la detector H- nlimea teoretic a talerului N= de unde rezult nlimea talerului ca fiind : H = L N

Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii benzii Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana cromatografic. In condiii ideale o specie chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la traversarea coloanei cauzat de difuzie molecular longitudinal, de curgeri neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei i resorbiei. Eficiena unei coloane cromatografice este cu att mai ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de relaia:
t N = 16 r W
2

Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei coloane poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W. O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli cercettori ca fiind de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii peak-ului la jumtatea nlimii lui, figura , numrul de talere teoretice rezultate fiind :

tr N = 5,54 W 1/2

Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN p1-18)

Dintre cele dou mrimi : nlimea H a talerului i numrul N de talere ce indic ambele eficiena coloanei este preferat exprimarea prin numrul de talere deoarece este adimensional i poate fi folosit n comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiia ca eficiena s fi fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere poate fi mrit foarte simplu prin creterea lungimii coloanei. Rezoluia de separare Rs - reprezint msura separrii unui mai avansate sau mai puin avansate aunui component de altul , cu ct distana ntre dou peak-uri este mai mare cu atit rezoluia este mai bun, totodat crete i timpul de analiz cromatografic:

Rs =

t r2 t r1 0,5 (w1 w 2 )

unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor celor dou componente. Exprimarea pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou Peak-uri neseparate complet.

Fig.2. Situaia unei separri incomplete a Peak-urilor

Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia () devine

Rs =

t r2 t r1 4

ecuaie ce arat influena termodinamic a sistemului cromatografic asupra rezoluieiei prin termenul de la numrtor i a eficienei de separare prin abaterea standard . In situaia in care: tr2 tr1 = 4 rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei separri avansatea a celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistic matematic este justificat de asemnarea dintre peak-urilor cromatografice i curbe de tip Gauss valoarea lirii W fiind egal cu 4

Mrimi specifice cromatografiei

Lungimea coloanei cromatografice (L)reprezint lungimea coloanei msurat de la sistemul de injecie pn la detector Viteza liniar de curgere (u) estedefin it prin viteza de curgere a fazei mobile i este exprimat prin:
L t0 Timpul de traversare (timpul mort) (t0 ) este timpul parcurs de o specie chimic nereinut e (neretardate) de umplutura coloanei de la injecie pn la traversarea coloanei, aceast specie traverseaz coloana cu viteza fazei mobile. Acest timp espe msurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecie i semnalul dat de detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului cromatografic u=

atinge valoarea zero. Timpul t0 formeaz baza de plecare pentru determinarea factorului de reinere Timpul de reinere (tr)- reprezint timpul necesar ca o specie chimic s traverseze coloana cromatografic din momentul injectiei pn la sosirea la detector . Ca i la timpul mort i acest timp espe msurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecie i semnalul dat de detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului cromatografic atinge valoarea zero. Factorul de reinere ( factorul de capacitate ) (k). Din cromatogram din fig. 1 se observ c natura speciilor chimice poate fi interpretat prin prisma timpului de retenie tr acest timp depinde ns pe lng natura specieiei i de ali factori precum : lungimea coloanei, natura i granulaia umpluturii, etc, ca atare timpul de reinere poate fi considerat specific naturii speciilor chimice numai n condiii precis definite neavnd un caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativ este folosit factorul de reinere (k) denumit in literatur i factor de capacitate:

k=

tr t0 t0

un factor de kapacitate de valoare mic indic o rezoluie de identificare sczut iar un factor de capacitate de valoare mare indic un timp de separare i de analiz mare cu efect negativ asupra producivitii. Din punct de vedere al ordinului de mrime factorul de capacitate trebuie s se situeze intre 1 i 10. Gradul de separare a doi componeni ( ) - exprim gradul de separare cromatografic a dou substane i este definit ca raport intre factorul k de reinere a celor doi componeni :

k 2 t r2 t 0 = k1 t r1 t 0

Eficiena unei coloane cromatografice . Ca msur a eficenei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie numrul N de talere teoretice necesare separrii fie nlimea teoretic H a talerului. Teoria talerelor se bazeaz pe conceptul c o coloan cromatografic poate fi asimilat cu o mulime de minicoloane (talere) lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizndu-se echilibrul ntre faza mobil i cea staionar . n acest concept se ia in considerare situaia n care un taler realizeaz singur separarea cromatografic a componentelor, este evident c pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de efectuare a unei cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic cu umplutur pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele comerciale conin cca 50.000 talere pe metru dac este vorba de particule cu diametrul de 5 m sau cca 25.000 talere pe metru liniar dac este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 m. In general eficiena unei coloane cromatografice de separare crete atunci cnd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere necesar ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:

N=

L H

de unde rezult nlimea talerului ca fiind : H = L N

Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii benzii Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana cromatografic. In condiii ideale o specie chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la traversarea coloanei cauzat de difuzie molecular longitudinal, de curgeri neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei i resorbiei. Eficiena unei coloane cromatografice este cu att mai ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de relaia:
t N = 16 r W
2

Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei coloane poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W. Factori ce influeneaz lirea de band n cltoria ei prin coloan lirea de band a unei probe este influenat de patru factori: 1. difuzia radial 2. difuzia longitudinal 3. efectele transportului de mas 4. efectele exterioare Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de curgere distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite fcnd ca ea s soseasc pe un interval mai mare de timp (band lit). Diferenele de lungime iau natere ca urmare a diferitelor forme i dimensiuni ale umpluturii coloanei precum i datorit golurilor neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic este dat n figura

Fig. Efectul difuziei radiale asupra lirii benzii [VARIAN P1-25] Pentru ca o coloan s prezinte o lire de band mic este nevoie ca ea s aibe o umplutur de dimensiune ct mai mic i de diametru ct mai uniform. Difuzia radial este cu atit mai ridicat cu ct proba traverseaz mai ncet coloana. La coloane capilare fr umplutur , folosite n gazcromatografie, difuzia radial poate fi neglijat. Difuzia longitudinal se datoreaz pe diferenierea axial a vitezei de curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunat pe msura creterii timpului de staionare a probei n coloan. Spre deosebire de difuzia radial la cea axial se poate reduce efectul asupra lirii de band prin mrirea vitezei fazei mobile. Din cauza

Fig. Efectul difuziei longitudinale asupra lirii benzii VARIAN p1-26

Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band . i- la curgere a unui lichid printr-o conduct viteza liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c moleculele din centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a peretelui, iii difuzia multidirecional a probelor lichide duce la lirea de band coeficientului de difuzie mai mic cu ordine de mrime de cca 10 3-104 la lichide dect la gaze difuzia longitudinal este minor n cazul cromatografiei de lichide n schimb la cromatografia de gaze ea joac un rol hotrtor. Influena efectului difuziei longitudinale asupra lirii de band este reprezentat n figura Efectele transportului de mas se manifest asupra lirii de band datorit faptului c cinetica de absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza staionar i cea mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil. Atunci cnd o molecul a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar petrece pe i n aceasta un un anumit timp pn cnd intr din nou n fluxul de curgere i este transportat mai departe de faza mobil. In tot acest timp molecula pierde timp fa de moleculele care nu au interacionat cu faza staionar. Un rol important la retenia moleculelor o joac i structura poroas (atunci cnd este cazul) a fazei staionare. Fenomenele de transport de mas devin cu att mai pronunate cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca atare lirea de band datorit efectului de transport de mas poate fi redus prin scderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redus prin folosirea , (la coloanele cu umplutur) a unor particule cu diametru ct mai mic i neporoase pentru umplutur, precum i folosirea de solveni de vscozitate mic (la cromatografia de lichide) .

Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band

10

Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul coloanei i snt cauzate de volume moarte n injector , n detector, precum i n conductele de transport. Suma efectelor enunate mai sus se numesc Efecte extracolumnare un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate n circuitul de lichid iar n figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :

Fig. Lairea de band: i - la o cromatogram normal, ii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm i diametrul interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm i un diametru interior de 4,6 mm O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli cercettori ca fiind de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii peak-ului la jumtatea nlimii lui, figura , numrul de talere teoretice rezultate fiind :

tr N = 5,54 W 1/2

11

Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN p1-18)

Dintre cele dou mrimi : nlimea H a talerului i numrul N de talere ce indic ambele eficiena coloanei este preferat exprimarea prin numrul de talere deoarece este adimensional i poate fi folosit n comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiia ca eficiena s fi fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere poate fi mrit foarte simplu prin creterea lungimii coloanei. Rezoluia de separare Rs - reprezint msura separrii unui mai avansate sau mai puin avansate aunui component de altul , cu ct distana ntre dou peak-uri este mai mare cu atit rezoluia este mai bun, totodat crete i timpul de analiz cromatografic:

Rs =

t r2 t r1 0,5 (w1 w 2 )

unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor celor dou componente. Exprimarea pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou Peak-uri neseparate complet.

12

Fig.2. Situaia unei separri incomplete a Peak-urilor

Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia () devine

Rs =

t r2 t r1 4

ecuaie ce arat influena termodinamic a sistemului cromatografic asupra rezoluieiei prin termenul de la numrtor i a eficienei de separare prin abaterea standard . In situaia in care: tr2 tr1 = 4 rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei separri avansatea a celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistic matematic este justificat de asemnarea dintre peak-urilor cromatografice i curbe de tip Gauss valoarea lirii W fiind egal cu 4 Lirea de band Lirea de band a unei probe n cltoria ei prin factori: 5. difuzia radial 6. difuzia longitudinal 7. efectele transportului de mas 8. efectele exterioare coloan este influenat de patru

Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de curgere distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite fcnd ca ea s soseasc pe un interval mai mare de timp (band lit). Diferenele de lungime iau natere ca urmare a diferitelor forme i dimensiuni ale umpluturii coloanei precum i datorit golurilor neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic este dat n figura

13

Fig. Efectul difuziei radiale asupra lirii benzii [VARIAN P1-25] Pentru ca o coloan s prezinte o lire de band mic este nevoie ca ea s aibe o umplutur de dimensiune ct mai mic i de diametru ct mai uniform. Difuzia radial este cu atit mai ridicat cu ct proba traverseaz mai ncet coloana. La coloane capilare fr umplutur , folosite n gazcromatografie, difuzia radial poate fi neglijat. Difuzia longitudinal se datoreaz pe diferenierea axial a vitezei de curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunat pe msura creterii timpului de staionare a probei n coloan. Spre deosebire de difuzia radial la cea axial se poate reduce efectul asupra lirii de band prin mrirea vitezei fazei mobile. Din cauza coeficientului de difuzie mai mic cu cca 103-104

Fig. Efectul difuziei longitudinale asupra lirii benzii VARIAN p1-26 la lichide dect la gaze difuzia longitudinal este minor n cazul cromatografiei de lichide n schimb la cromatografia de gaze ea joac un rol hotrtor. Influena efectului difuziei longitudinale asupra lirii de band este reprezentat n figura

14

Efectele transportului de mas se manifest asupra lirii de band datorit faptului c cinetica de absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza staionar i cea mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil. Atunci cnd o molecul a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar petrece pe i n aceasta un un anumit timp pn cnd intr din nou n fluxul de curgere i este transportat mai departe de faza mobil. In tot acest timp molecula pierde timp fa de moleculele care nu au interacionat cu faza staionar. Un rol important la retenia moleculelor o joac i structura poroas (atunci cnd este cazul) a fazei staionare. Fenomenele de transport de mas devin cu att mai pronunate cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca atare lirea de band datorit efectului de transport de mas poate fi redus prin scderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redus prin folosirea , (la coloanele cu umplutur) a unor particule cu diametru ct mai mic i neporoase pentru umplutur, precum i folosirea de solveni de vscozitate mic (la cromatografia de lichide) .

Fig.
Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul coloanei i snt cauzate de volume moarte n injector , n detector, precum i n conductele de transport. Suma efectelor enunate mai sus se numesc Efecte extracolumnare un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate n circuitul de lichid iar n figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :

15

Fig. Lairea de band: i - la o cromatogram normal, ii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm i diametrul interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm i un diametru interior de 4,6 mm Simetria Peak-urtilor. Forma peak-urilor poate fi foarte diferit , n vederea caracterizrii acestora IUPAC a elaborat o clasificare , astfel: la crestere mai accentuat a frontului Peak-ului decit a scderii acestuia denumirea este de Tailing la cresterea mai lin a frontului peak-ului fa de scderea acestuia denumirea este de Fronting

Factorul de Tailing sau de fronting reprezint o msur a simetriei peak-ului i se determin la valoarea de 10% din nlimea peak-ului dup relaiile din figura

16

Analiza calitativ

17

Analiza cantitativ
Metoda normrii suprafeei (nlimii) La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa respectiv inlimea unui peak este proportional cu concentraia componentului reprezentat de acel peak. Pentru a exprima concentraia procentual a unui component trebuie avut n vedere nlimea total sau suprafaa total a tuturor componentelor din amestec care este considerat ca avnd o compoziie de 100% . Concentraia fiecrui component din amestec se determin pe urm prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se accept urmtoarele: 1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate componentele i c fiecare component apare sub forma unui peak individual bine definit. Aceast presupunere nu ine cont de faptul c dou sau mai multe componente pot parsi n acelai timp coloana fiind identificate ca o singur specie, sau unele specii pot fi reinute total pe coloan i iar altele eventual nici nu snt detectate 2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu se adeverete bazat pe aceste presupuneri i efectele generate de ele se procedeaz la calibrarea sensibilitii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise n continuare. Metoda standardului extern La folosirea acestei metode se prepar un standard extern care conine specia (speciile) urmrit , dac se bnuiete ordinul de mrime al concentraiei componentei

18

(componentelor) urmrite este bine ca la standardul extern concentraia s fie n acelai domeniu. Faza mobil astfel preparat se trimite prin cromatograf i se traseaz o cromatogram , operaia se repet pentru proba de analizat. Din cromatograma standard se determin pentru peak- ul urmrit, figura, un factor de rspuns r ca fiind raportul dintre concentraia componentei [Ai] urmrite i nlimea h sau suprafaa S a peak-ului, :
r =

[ Ai ]
h

[ Ai ]
S

Fig. Mrimi caracteristice ale peak-ului luate n calcul la

determinarea concentraiei prin metoda standardului extern

n continuare concentraia oricrei componente din prob se determin prin nmulirea factorului de rspuns r cu nlimea h sau cu suprafaa S peak-ului. De fapt prin calcularea acestui factor de rspuns r se simplific determinarea concentraiei prin regula de trei simple, factorul de rspuns regsindu-se de fiecare dat n aceast regul sub forma unei constante, la calcularea concentraiei diferitelor componente din amestec. Acest mod de determinare a concentraiei unei componente presupune o dependen liniar ntre nlimea respectiv suprafaa peak-ului i concentraie. Atunci cnd aceast dependen este cunoscut sau bnuit ca fiind neliniar se efectueaz mai multe cromatograme etalon cu concentraii cunoscute care includ n domeniu valoarea concentra iei necunoscute , figura i cu valorile obinute se traseaz o curb de

Fig. nlimea i forma peak-urilor la

calibrarea multipl cu concentraii cresctoare a componentului urmrit

Fig. Curba de etalonare a componentului

urmrit oarecare

etalonare n coordonate h(S) i concentraie. Pe aceast curb de etalonare se extrapoleaz valorile nlimii sau suprafeei peak-ului urmrit pentru detrminarea concentraiei speciei pe care o reprezint acesta. Imprecizia acestei metode este legat de erorile de dozare ale probei de analizat avnd n vedere i volumele mici ce se dozeaz.

19

Metoda standardului intern

La folosirea acestei metode se obin cele mai mari precizii deoarece snt evitate erorile datorate impreciziei de dozare a probei la injecie. Tehnica se bazeaz pe adugarea atit la proba standard ct i la proba urmrit o cantitate bine stabilit dintrun standard intern. Raportul dintre suprafeele peak-urilor sau a nlimii probei i suprafaa peak-ului standardului intern reprezint parametrul analitic urmrit respectiv factorul de rspuns r :
S Ss factor care se poate exprima , atunci cnd se ine cont de corespondena dintre suprafaa S a peak-ului i concentraia c , i ca fiind [LINDSAY]: r = r = c S cs Ss

unde: c - concentraia componentei care intereseaz S - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului cs - concentraia standardului intern Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardukui intern In aceste condiii concentraia componentei urmrite cu are expresia:
cu = Su r c's A's

unde: cu - concentraia componentei analizate Su - suprafaa (respectiv nlimea) peak-ului componentei analizate cs - concentraia standardului intern Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardului intern

20

II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE

S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge:

21

a. cromatografia de gaze (GC) cnd faza mobila este un gaz; b. cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobila este un lichid c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat peste temperatura critica. In cadrul cromatografiei de gaze (GC) se disting urmatoarele tehnici: 1. Cromatografia gaz-lichid (cromatografie de repartiie), faza stationara este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, de tip silicagelul sau alumina, situat ntr-o coloan, la asa-numita cromatografie conventional sau suportul poate fi chiar peretele coloanei, confectionat la dimensiuni capilare, la aa numita cromatografie pe coloana capilara. 2. Cromatografia gaz-solid (cromatografie de absorbie), faza stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (niste silicati naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importanta pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE

Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau exist n stare gazoas i care nu se descompun la nclzire n alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiz este acela n care amestecurile supuse analizei snt n stare lichid din care snt aduse n stare gazoas prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la substanele la care temperatura de vaporizare este mai mare dect temperatura de descompunere a substantelor de analizat rezultind ali compui dect cei supui analizei. In aceste cazuri nainte de introducerea probei n cromatograf se pot realiza niste derivati (compusi noi), volatili, utiliznd anumite reactii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode. Printre domeniile n care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica. La cromatografia cu gaze proba este evaporat la intrarea n coloana cromatografic fie direct la captul acestei fie ntr-un dispozitiv special plasat tot la intrarea n coloan. Separarea de-a lungul coloanei (eluia) are loc cu ajutorul unui gaz purttor care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacioneaz cu faza mobil , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din amestec prin coloan. nceputurile Cromatografiei de gaze snt legate de coloane cu umplutur n care se transfera amestecul de substane gazoase dup ce n prealabil erau evaporate spontan ntr-un injector nclzit. La ora actual este folosit n exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fr umplutur cu cele dou[ tipuri : - cromatografia de gaze pe faze staionare solide (cromatografie de absorbie) - cromatografia de gaze pe faze staionare lichide (cromatografie de repartiie) La cromatografia de gaze pe faze staionare solide retenia speciilor de analizat din amestec este realizat pe baz de absorbie fizic pe peretele interior al

22

coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii i lungimi apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbii ireversibile, care duc la rndul lor reproductibiliti slabe, aceast tehnic este folosit rar i numai la substane cu puine molecule n structur. Cromatografia de gaze pe faze staionare lichide se bazeaz pe repartiia substanei de analizat ntre faza mobil gazoas i o faza lichid imobilizat pe peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este folosit la ora actual la scara cea mai larga. Relaiile matematice care o descriu snt valabile cu mici modificri i la cromatografia de lichide, aceste modificri snt dictate de faptul c gazele snt compresibile i ca atare proprietile i comportarea reologic snt influenate de presiune i de temperatur. Din acest motiv la cromatografia de gaze este folosit n locul timpului de retenie tr volumul de retenie Vr care ine cont de debitul mediu Q al fazei mobile exprimat n ml/min, debit ce depinde de presiune i de temperatur : Vr= tr . Q Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen mare asupra lirii de band ( vezi i cap. Cromatografia de lichide) influena difuziei longitudinale fiind important dtorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine de mrime la gaze fa de cel al lichidelor.

II.2.1. Aparate folosite n gazcromatografia de gaze

Un gazcromatograf respect schema bloc din figura avnd particulariti specifice pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arat ca n figura II.2.

Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purttor, 2-reductor de presiune, 3 - manometru de nalt presiune, 3- manometru de joas presiune, 5- regulator de presiune i debit, 6- sering de injecie pentru substane de analizat n stare iniial lichid, 7dispozitiv de evaporare rapid , 8-cuptor termostatat de nclzire, 9- coloan cromatografic tubular, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de achiziie prelucrare i afiare date, 13 calculator, 14- imprimant

23

II.2.1.1. Alimentarea cu gaz purttor

Gazul purttor trebuie s fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de vedere intr n discuie gazele inerte, hidrogenul, azotul i bioxidul de carbon. Natura gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rndul lui de mai muli factori dar n principal de clasa de substane analizate. Gazele purttoare de nalt puritate snt preluate de regul din butelii speciale de nalt presiune prevzute cu reductoare de presiune ce asigur presiuni de intrare cuprinse ntre 1,5 i 3 ata, dar pot fi produse i pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purttor se gsete un debitmetru electronic precum i o sit molecular pentru reinerea vaporilor de ap i a eventualelor impuriti solide de dimensiuni mici.

II.2.1.2. Sistemul de injecie

Caracteristicile sistemului de injecie asigur n mare parte calitatea analizelor cromatografice, fiind responsabile de lirea de band a peak-urilor. Un sistem

Fig.II.3. Fazele de injecie ale amestecului lichid de analizat performant de injecie trebuie s asigure injecia n timp scurt a unor cantiti extrem de mici de subsatan de analizat numai aa snt asigurate peak-uri nguste la baz. Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticl aezat pe suportul mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale acionat automat. Acul seringii perforeaz un dop de cauciuc siliconic sau i absoarbe o cantitate bine definit de prob, figura II.3. , dup care se ridic automat , se deplaseaz i injecteaz proba printr-un semptum prevzut cu un dop de cauciuc siliconic ntr-un dispozitiv de evaporare rapid situat la intrarea n coloan. Este foarte important ca evaporarea s se produc practic instantaneu astfel nct amestecul fazei purttoare cu substana de analizat s se produc chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe analizate pentru coloane analitice normale variaz de la civa l la cca 30 l, la coloane capilare volumul probei este mult mai mic de ctiva nl fiind necesar folosirea unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigur preluarea pentru analiz numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat n mediu.

24

Aceste sisteme de splitare snt n principiu divizri de debit cu tuburi de tip T, existente att pe traseul gazului purttor ct i pe cel al amestecului gazos, pe ale crori ramuri se creaz rezistene hidraulice bine controlate astfel nct s poat fi purjat cea mai mare parte din substana de analizat, pe coloan ajungnd numai o parte infim de amestec i gaz purttor aa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantiti

Fig. II.4. Dou procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze a-cu splitare, b- fara splitare, 1-debitmetru, 2-port de injectie (sepptum), 3- tub de evaporare cu dop de vata de sticl sau de cuar , 4 corpul dispozitivului de injecie , 5- ventil cu trei ci, 6ventil cu ace cu debit reglabil , 7- regulator de presiune mici de prob, aa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manual duce la erori importante motiv pentru care pentru dozare i injecie snt recomandate dispozitive de tip autosampler.

II.2.1.3. Coloane cromatografice

Termenul de coloan cromatografic este oarecum impropriu pentru cromatografia de gaze, el provine inc din timpul n care se foloseau coloane cu umplutur de lungimi rezonabile care ncpeau n gazcromatograf sau care erau montate n poziie vertical lng aparat avnd o termostatare concentric. Diametrul interior al coloanelor cu umplutur pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm sau la aa numitele coloane micro <1mm. Acest tip de coloane este astzi extrem de rar folosit din cauza faptului c au o capacitate de separare redus i o rezoluie slab. Astzi snt folosite cu precdere coloane capilare care se prezint sub forma unor tuburi metalice de cupru , oel inoxidabil sau din sticl cele din urm fiind trase ntr-un film de poliamid sau de aluminiu pentru a le mri rezistena mecanic la incovoiere.

25

Coloanele capilare snt goale, au diametre interioare submilimetrice i lungimi de zeci de metrii putnd depi chiar i o sut de metri. Coloanele capilare au capacitate de separare i rezoluie mare n schimb din cauza cantitilor extrem de mici de substan analizat au au o limit de detecie sczut i un timp de analiz mai ridicat. Asa cum s/a ar[tat deja din cauza volumului extrem de mic necesar ntr-o coloan capilar , de ordinul l sau chiar nl, ale amestecului gazos de analizat nainte de intrarea n coloana cromatografic se folosete splitarea (divizarea) probei ,prin aceast operaie numai o mic parte a acesteia, la limita dozrii volumice, este admis n colan cealalt parte fiind purjat n atmosfer. Cantitate mic de substan analizat este motivul limitei de detecie mai sczute la cromatografia de gaze. Att coloanele cu umplutur ct i cele capilare pot funciona n regim de cromatografie de absorbie (gaz- solid) sau n regim de cromatografie de repartiie (gaz - lichid). La folosirea coloanelor cu umplutur pentru cromatografia de absorbie umplutura este format dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de repartiie umplutura este format dintr-un material poros figura II.5, a crui suprafa este impregnat cu o faz lichid staionar.

Fig.II.5. Tipuri de coloane utilizate n gazcromatografie. a- coloane cu umplutur pentru cromatografia de absorbie, 1-perete coloan, 2-umplutur poroas . b-coloane cu umplutur pentru cromatografia de repartiie, 1-perete coloan, 2- umplutura, 3-faz staionar lichid depus pe umplutur, 3-umplutur. c-coloan capilar cu film lichid subire, 1-perete coloan, 2-film lichid , d-coloan capilar cu strat subire impregnat cu lichid, 1-perete coloan, 2- film lichid, 3-strat granular subire.

La folosirea coloanelor capilare se deosebesc coloane cu film i capilare cu strat. La coloanele capilare cu film, figura, faza staionar ader sub forma unui film subire de peretele interior neted al coloanei capilare iar la coloanele capilare cu strat, figura, faza stationar este aplicat sub forma unui strat subire de diatomee impregnat cu faza lichid staionar. n cadrul cromatografiei de gaze snt valabile tot relaiile stabilite la ceromatografia de lichide cu condiia ca influena temperaturii i a presiunii s fie redus la maxim. n acest scop procesul de sparare n coloan trebuie s fie izoterm iar trecerea amestecului n faz gazoas ct mai rapid posibil. Pentru alegerea corect a unei coloane pentru gazcromatografie este nevoie s se in cont de urmtoarele:

26

proprietile negative ale unei coloane ( cost, timp de analiz, absorbie rezidual) snt proporionale cu lungimea crescnd deci cu creterea acesteia singura proprietate pozitiv a coloanei i anume capacitatea ei de separare crete abia cu ptratul lungimii coloanei, acesta fiind i motivul folosirii unor coloane de lungime medie de 20 -30 m n locul unor lungimi ce pot depi 100 m. Afar de aceasta la coloane scurte scade timpul de analiz i absorbia rezidual deoarece ea este proporional cu lungimea drumului parcurs de faza mobil n mediul absorbant Atunci cnd se solicit o separare avansat se vor folosi coloane de lungime mare cu recomandarea ca drept gaz purttor s se foloseasc hidrogenul deoarece se reduc sensibil timpii de analiz. Reducerea timpului analiz prin mrirea presiunii iniiale a gazului purttor duce la reducerea capacitii de separare a coloanei capilare

II.2.1.4. Cuptoare de termostatare

Temperatura coloanei este un parametru esenial pentru gazcromatografie deoarece ea provoac practic gradientul de presiune ce transport gazul prin coloan. Creterea Temperaturii duce la creterea exponenial a presiunii amestecului gazos care la rndul ei duce la creterea vitezei de migrare reducnd sensibil timpul de retenie. n general se consider c o cretere atemperaturii cu cca 300C duce la reducerea la jumtate a timpului de retenie. n realitate nu intereseaz viteza absolut de migrare ci viteza relativ de migrare vr ca fiind raportul dintre viteza medie vma liniar a substanei analizate raportat la viteza medie vmp a gazului purttor:

vr =

v ma v mp

valoarea vitezei relative de migrare se situeaz ntre 0 i 1, ceea ce nseamn c la valoarea zero nu are loc nici o migrare, temperatura fiind prea mic, iar la valoarea 1 nu are loc nici o separare deoarece amestecul de de analizat traverseaz coloana cu aceei vitez cu gazul purttor nefiind reinui difereniat n timp diferiii componeni. Care valoare intermediar ntre zero i 1 este optim depinde n mare parte de dificultatea separrii. Temperatura optim a coloanei depinde de temperatura de fierbere i de gradul de separare. Pentru amestecuri a cror temperatur de evaporare se situeaz ntr-un domeniu destul de apropiat se poate spune cu o apreciere relativ bun c o temperatur egal sau ceva mai mare dect temperatura medie de evaporare a probei duce la un timp de eluie apreciat de cca 4-30 minute ceea ce reprezint valori acceptabile. Dac se folosete acest raionament se apeleaz la regimul de lucru izoterm (temperatura coloanei constant). In cadrul lucrului n regim izoterm valoarea temperaturii trebuie meninut constant n limitele 0,1 0C motiv pentru care coloana se gsete ntr-un cuptor termostatat . n cazul unor probe cu un interval mare de fierbere este de dorit s fie folosit un program de temperatur n cadrul cruia temperatura este crescut fie n mod continuu fie n trepte . La injecie proba se gsete la temperatura cea mai sczut optim pentru componentele volatile dar necorespunztoare pentru componentele cu temperatur de vaporizare mare. n timpul analizei temperatura este crescut progresiv pn cnd se obine n final temperatura corespunztoare componentelor volatile. n cadrul programelor de temperatur nu

27

trebuie depit ns temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative de migrare vr

II.2.1.5. Detectoare pentru gazcromatografie

II.2.1.5.1. Caracteristicile detectoarelor
La ieirea din coloana gascromatografice exist condiii optime de msurare pentru multe tipuri de detectoare deoarece aici ies pe rnd substane gazoase pure cu o diluie ideal realizat cu un gaz inert. Pentru identificri calitative este indicat folosirea de spectrometre la ieirea gazcromatografelor. Cele mai utilizate combinaii snt: gazcromatograf- spectrometru de mas ( GC-MS) sau gazcromatograf- spectrometru n infrarou cu transformat Fourier (GC-FTIR). Pentru analiza cantitativ a probelor ( probe a cror compoziie calitativ este deja cunoscut) s-au impus cteva detectoare utilizate la ora actual la scar mare acestea se clasific dup principiul lor fizic n: Detectoare sensibile la variaie de concentraie Detectoare sensibile la variaie de debit masic

La detectoarele sensibile la variaie de concentraie semnalul electric al detectorului este proporional cu concentraia momentan a substanei ( i) din volumul din imediata vecintate a detectorului. La un detector sensibil la variaie de debit masic semnalul electric al detectorului este proporional cu debitul masic ( Mi), adic cu masa de substan ce trece n unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile la variaia de concentraie snt influenate de debitul de gaz purttor motiv pentru care debitul de gaz purttor trebuie reglat automat n vederea meninerii constante a valorii lui. Influena debitului de gaz purttor nu se manifest la detectoarele sensibile la variaie de debit masic. Sensibilitatea S a detectorului reprezint nivelul de conversie a mrimii fizice neelectrice ntr-o mrime electric proporional. La detectoarele sensibile la

28

Fig.II.6. Componente duntoare ale semnalului electric al detectoarelor variaie de concentraie sensibilitatea detectorului este dat de raportul dintre semnalul electric Ei i concentraia substanei i din gazul purttor, iar la detectoare sensibile la variaie de debit masic sensibilitatea este dat de raportul dintre semnalul electric Ei i debitul masic Mi - mas n unitate de timp). Prin nregistrarea semnalului electric al detectorului (potentialul electric E-mV sau curentul electric ImA) n funcie de timp se obine cromatograma. Semnalul electric al unui detector conine pe lng semnal electric util i componente duntoare sau parazite precum: abateri, zgomot de fond , drift (plaj de variaie) , figura II.6., care pot duce la erori importante de msurare. Abaterile periodice i au originea n reglrile periodice automate ale temperaturii i debitului gazului pe cnd oscilaii neperiodice trebuie puse mai ales pe seama coloanelor de separare inclzite incomplet sau murdare. Zgomotul de fond are frecven ridicat este specific fiecrui detector i electronicii sale aferente i se manifest mai ales atunci cnd amplificarea electronic a semnalului este mare. Componentele parazite din semnalul electric se determin n felul urmtor: din semnalul nregistrat al detectorului n funcie de timp se alege ntimpltor un interval de 15 minute si se traseaz pe ambele pri ale liniei de baz a semnalului dou linii paralele n aa fel nct aceste linii s ating tangenial intr-un interval de cca 10 minute peak-urile (virfurile) a cele mai mari. Drift-ul , figura , este definit ca fiind nclinaia celor dou linii paralele fa de abscis. Abaterile snt definite ca distana ntre cele dou linii. Pentru stabilirea mrimii zgomotului de fond se alege intervalul de un minut care prezin cel mai mare zgomot. Nivelul zgomotului de fond se determin prin mrimea distanei ntre cele dou linii paralele ce unesc vrfurile semnalului de zgomot. Limita de detectare Ld reprezint concentraia [mg/l] sau debitul masic [g/s] a substanelor analizate de valoarea cea mai mic care snt detectabile cu un senzor cromatografic adecvat: Pentru descrierea capacitii unui senzor folosit n cromatografie se folosete exclusiv limita de detectabilitate i nu sensibilitatea lui. Limita de detectabilitate se determin din raportul dintre nivelul p a tuturor semnalelor parazite praportat la sensibilitate S: Ld =p/S Numai atunci cnd diferena E ntre valoarea mrimii msurate i valoarea medie a unei analize oarbe este de trei ori mai mare dect abaterea standard (s) a tuturor semnalelor parazite p se poate susine cu o siguran de 99% c c un punct de msurare oarecare P de pe cromatogram reprezint un punct a semnalului util i nu a componentelor parazite ale semnalului. La acest raionament se iau n calcul numai abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jumtatea semnalului de eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este modificat n practica cromatografic n sensul c se iau n considerare att abaterile pozitive ct i cele negative , msurtorea fcndu-se vrf vrf. Din aceste msurtori ar rezulta prin mprire un factor f , (f = 1,5 (n loc de 3) pentru distana punctului de msurare P de la valoarea median a semnalului de abatere . de regul pentru calculul limitei de detectabilitate Ld se fololosete un factor f =1,2 2:

29

Ld = (1,5...2) semnal de abatere /Si Ld = (5...10) semnal de abatere /Si n conformitate cu alte standarde snt folosite i alte valori pentru factorul f, de ex IUPAC recomand f = 3. Limita de determinare real Ldet reclam valori mai mari pentru (f) dect n cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie s fie cuprins ntre 5-10 corespunztor cu sigurana statistic cerut pentru rezultatul msurtorilor. Constanta de timp () , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a electronicii aferente, reprezint timpul care trece din momentul iniierii msurtorii pn n momentul n care este indicat 63,2% a ntregului semnal. Dup (5 ) se obin 99,3 % a ntregului semnal

Fig.II.7. Influena consatantei de timp asupra timpul de rspuns t Selectivitatea unui detector Si,j descrie sensibilitile diferite pentru dou materiale diferite i i j. Selectivitatea Si,j este indicat ca fiind raportul sensibilitii detectorului pentru cele dou substane: Sij= Si/Sj Dac sensibilitatea pentru substana j se apropie de valoarea unu detectorul este specific pentru substana i, (Si = ) Domeniul liniar al unui detector, figuraII.8, reprezint domeniul unde sensibilitatea Si este constant . n partea de jos domeniul liniar este limitat prin limita

30

Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie de detectabilitate Ld. n partea de sus prin o abatere tolerat de 5% de la dreapta ideal de liniaritate. Pentru exemplificare grafic a domeniului liniar se reprezint n coordonate dublu logaritmice suprafaa peak-ului Ai sau a semnalului detectorului Ei n funcie de cantitatea m i a probei, concentraia Ci , respectiv fa de debitul masic Qmii, figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosit se reprezint sensibilitatea Si n funcie de cantitatea de prob folosit mi, n funcie de concentraia Ci sau n funcie de debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul liniar se exprim prin raportul dintre limita superioar a domeniului liniar i limita de detectabilitate, este obligatorie i indicarea naturii substanei analizate i. Domeniul dinamic al detectorului este plasat n continuarea domeniului liniar i reprezint domeniul n care o modificare a concentraiei sau a debitului masic mai provoac o modificare sensibil i posibil de calibrat a semnalului detectorului, figura II.8.a,b.

II.2.1.5.2. Detectorul de ionizare cu flacr ( FID)

Detectorul de ionizare cu flacr, figura II.9, este un detector folosit pentru substane organice ( hidrai de carbon) ce are aplicaia de baz la cromatografele de gaze deoarece mbin o sensibilitate ridicat cu robusteea. Un detector de ionizare cu flacr este de cca 1000 ori mai sensibil dect un detector de conductivitate termic. Alte domenii de aplicare ale acestui detector snt la supravegherea apelor privind prezena de hidrocarburi volatile precum i la supravegherea polurii atmosferei i a aerului din spaii interioare cu hidrocarburi gazoase. Principiul detectorului se bazeaz pe msurarea conductivitii electrice unei flcri de hidrogen plasat ntre doi electrozi. Substanele de analizat snt transportate n flacr cu un gaz purttor unde snt ionizate termic datorit aportului de cldur din flacr. n felul acesta n cmpul electric dintre cei doi electrozi apare un curent ionic msurabil care este nregistrat n funcie de timp de ctre nregistrator sub form unor vrfuri (Peak-uri) cu aplicaii n analiza chimic calitativ. Intensitatea semnalului electric al detectorului (nlimea maxim al Peakului) este liniar i proporional cu coninutul de hidrocarbur ntr-un domeniu foarte larg de concentraie , cu aplicaii n analiz cantitativ. Din acest motiv concentraia unei hidrocarburi poate fi determinat direct din semnal fr a se folosi curbe de etalonare. Unele substane organice ( de ex. acidul formic, acetaldehida) au detectabilitate slab . Alte substane precum: gazele nobile, H 2 ,

31

N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legturi de halogen , halogenuri de siliciu

Fig.II.9. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip FID. 1-areztor, 2-flacr de

hidrogen, 3,4- electrozi colectori de electroni, 5 amplificator electronic, 6- sistem electronic de prelucrare i afiare

Sistemul cromatospectrometric prezentat in figura II.10 permite determinarea concomitent a compoziiei calitative i cantitative moleculare precum i a celei calitative i cantitative atomice din amestecuri complexe de gaze. n acest scop este folosit un gazcromatograf echipat cu detector FID dispozitivat cu o structur spectrometric modular format dintr-o sond, compus la rndul ei dintr-o lentil colimatoare, o fibr optic, un spectrometru miniatural compact echipat cu reea de difracie fix , detector Diode- Aray, soft pentru prelucrare informaii spectrale de emisie atomic precum i un sistem de procesare, afiare i tiprire spectre. Sonda se monteaz perpendicular pe direcia de ardere a flcrii de hidrogen i valorific emisia spectral a atomilor elementelor chimice excitate n flacra de hidrogen la cca 3.000 0 C. Informaia spectral ajunge prin lentila colimatoare i fibra optic pe reeaua de difracie a unui spectrometru miniatural, iar dup difracie, pe un detector Diode-Array care mpreun cu microprocesorul spectrometrului furnizeaz spectrograma de emisie atomic a speciilor chimice elementare (elemente chimice) prezente in amestecul de gaze analizat.

32

Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3sistem de adaptare pentru sonda optic, 4-flacr de hidrogen, 5-lentil colimatoare din sticl de cuar, 6- fibr optic de transmisie, 7-spectrometru cu reea de difracie i detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afiare i tiprire spectre

II.2.1.5.3. Detectorul pentru compui de azot i fosfor (NPD)

Detectorul pentru azot i fosfor este un detector modificat de tip FID care conine o surs alcalin de silicat sub forma unei perle din sticl sau ceramic dopat cu elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce elibereaz uor electroni. Perla alcalin este fixat pe o srm de platin ntre flacra de hidrogen i electrozii colectori de electroni ai detectorului, figura fiind nclzit att pe cale electric prin srma de platin pus sub tensiune ct i prin flacra de hidrogen, n jurul ei formndu-se un nor termic plasmatic care prin norul de electroni emii are totdeauna sarcina negativ fa de sarcina pozitiv a electrozilor colectori . Detectorul NPD poate fi folosit n dou moduri: - ca detector de fosfor (P) ca detector de azot (NP) n cazul utilizrii lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flacra de hidrogen arde ca la detectorul FID deasupra arztorului cu deosebirea c arztorul este legat la pmnt, figura, deoarece electronii rezultai din arderea unor componente ce conin atomi de carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , snt respini n acest caz de potenialul negativ al perlei scurgndu-se la mas, n schimb electronii ce iau natere pe suprafaa perlei alcaline , al cror numr este proporional cu concentraia de fosfor, ajung nestingherii la electrozii colectori formnd semnalul electric al detectorului. n ce privete mecanismul propriuzis de reacie trebuie artat c la nceput se formeaz n flacr oxizi de fosfor cu un numr impar de electroni , prin fixarea a electronului impar se formeaz n prima faz anionii diferiilor acizi fosforici care n flacr snt oxidai n flacr cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,

33

a)

b)

Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P).
1-arztor, 2- flacr de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin, 6-plasm, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afiare

ocazie cu care electronul fixat este eliberat i se constituie n semnalul electric al detectorului. La folosirea detectorului pentru compui de azot mecanismul este asemntor ca la fosfor deoarece i i azotul are un numr impar de electroni care duce la formarea de oxizi numai c acetia se descompun prea repede i nu reacioneaz cu perla alcalin . Dac n schimb se scade regimul termic de nclzire al perlei se formeaz radicali cian care dau reacie alcalin specific . Pentru a reduce regimul termic se micoreaz debitul de hidrogen la un nivel de cca 1-3 l/min i cel de aer la cca 100 l/min, condiii n care flacra de hidrogen se stinge iar aportul slab de hidrogen existent , ca urmare a reducerii debitului acestuia, duce la aprinderea lui n jurul perlei sub forma unui nor plasmatic slab . Radicalii cian formai prin piroliz termic fixeaz un electron iar anionii CN - formai reacioneaz cu hidrogenul o respectiv cu radicali OH cu formare de compui neutrii de tip CO2, H2O, N2 cu eliberarea unui electron ce se constituie , aa cum s-a mai artat, n semnalul detectorului . Detectorul azot - fosfor este un detector selectiv putnd fi folosit n principiu pentru toate elementele care au un numr impar de electroni , inclusiv pentru compui volatili de bor i arsen , utilizarea lui de baz este totui cea pentru compui fosfor i azot n regimul de lucru N-P, figura II.11 b. n regimul de lucru numai pentru fosfor (regimul P) detectorul este selectiv pentru compui de fosfor dar are sensibilitatea mai redus ca n regimul de lucru N-P. Un mod de lucru numai pentru azot (regim de lucru de tip N) nu este posibil fiind indicate alturi de compui de azot totdeauna i compui de fosfor , bineneles dac acetia snt prezeni n amestecul de subsatane analizate

II.2.1.5.4. Detectorul de conductivitate termic

Detectorul de conductivitate termic este unul din cele mai vechi detectoare folosite n cromatografie. El se bazeaz pe msurarea continu a conductivitii termice a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purttor i amestecul gazos de analizat, figura. Conductivitatea termic este o mrime fizic specific naturii i concentraiei substanelor. Amestecuri de gaze de compoziii i concentraii diferite ce scald cei patru rezistori nclzii ai punii Wheatstone modific proporional cu natura i cu

34

concentraiilor substanelor rezistena acestor rezistori ducnd la apariia unei tensiuni de dezechilibru a punii.

Fig.II.12.

Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul punii Wheatstone. 1- amplificator electronic, 2- sistem electronic de achiziie , prelucrare i afiare, R1,R2, R3, R4 - rezistori din platin nclzii electric

Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic compact bine termostatat n care se gsesc patru celule de gaz identice prevzute cu filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm, legate electric ntr-o punte de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o msurare comparativ de compensaie. n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale braelor punii, trece gazul purttor pur, iar prin celelalte dou brae ale punii trece gazul purttor n amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt parcurse de un curent electric care provoac nclzirea acestora prin efect JouleLenz. Temperatura srmelor i prin aceasta i rezistena lor electric depinde de conductivitatea termic a gazelor ce trec prin celule. Modificri ale compoziiei gazelor provoac prin conductivitile lor termice specifice modificri corespunztoare de temperatur i prin aceast modificri ale rezistenei electrice a filamentelor de srm. Diferenele de temperatur a filamentelor n celulele de msurare i n celulele de referin duc la un dezechilibru electric msurabil al punii Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este proporional cu natura substanei care traverseaz la acel moment dou brae opuse ale punii , iar valoarea dezechilibrului este proporional cu concentraia acelei substane din amestecul de gaze analizat. Detectorul de conductivitate termic este un detector universal, utilizabil la aproape toate substanele, singurele ngrdiri snt la substane puternic corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de sczut.

II.2.1.5.5. Detectorul cu capcan de electroni (ECD)

Detectorul cu capcan de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este un detector specific pentru gazcromatografie folosit n analiza substanelor sulfuroase, substanelor cu azot i a substanelor halogenate ( ex. PCB, Lindan, etc). Aplicaiile de

35

baz snt n analiza urmelor i n chimia mediului. Detectorul este format dintr-o camer de ionizare ce conine un catod i un anod i un flux continuu de gaz. Pentru ionizare snt folosite radiaii () emise de o surs radioactiv sub forma unei folii foarte subiri al izotopului Ni63, sursa de radiaii constituie totodat i catodul, figura II.13. Descompunerea radiaiei () duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu moleculele (N2) ale gazului purttor i ca urmare iau natere ioni N2 ncrcai pozitiv i electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni ntre cei doi electrozi apare un cmp electric prin care electronii secundari liberi se deplaseaz spre anod unde produc un curent electric de civa nanoamperi numit curent de ionizare de baz. Dac n amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare fa de electroni atunci aceast substan colecteaz o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micorarea curentului de ionizare de baz. Aceast micorare afecteaz proporional curentul de baz i reprezint semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcan de electroni reacioneaz la substane cu afinitate de electroni cum snt de exemplu substane halogenate precum i anumite pesticide. Sistemul clasic cu msurarea curentului de ionizare de baz, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv pentru care n aparate moderne se folosete alt sistem de lucru. Astfel se aplic un impuls de tensiune cu frecven variabil . n momentul n care exist semnalul de tensiune (0,5 pn la 1s), electronii care nu au reacionat cu substanele amestecului de gaze din gazul purttor snt colectai de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric se aleg aa de scuri pentru ca ionii grei, rezultai ca urmare a absorbiei de electroni, s nu poat ajunge la anod. Frecvena semnalelor electrice aplicate nu este constant ci modificat continuu n sensul asigurrii unei intensiti de curent constante. Dac n detector intr prin amestecul de gaze un numr mare de molecule electrofile pentru compensarea scderii sub limit a curentului (ca urmare a scderii numrului de electroni) se mrete frecvena curentului. La acest mod de lucru semnalul util al detectorului nu-l mai reprezint micorarea curentului de ionizare de baz ci modificarea frecvenei tensiunii aplicate n scopul meninerii constante a intensitii curentului , frecvena semnalului fiind proporional cu concentraia moleculelor captoare de electroni. Prin timpul de pauz ntre semnale se asigur n limite largi un numr de electroni liberi constant , ceea ce nsemn c i la concentraii mari ale substanei de analizat snt suficieni electroni la dispoziie pentru ionizare. Numrul de electoni se adapteaz concentraiei substanei de analizat prin acesta extinzndu-se sensibil i domeniul liniar.

36

Fig.II.13. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip ECD. 1

Camera de ionizare, 2- folie de izotop Ni 63, 3- amplificator electronic, 4sistem electronic de prelucrare i afiare

Tab.II.1. Sensibilitatea aproximativ pentru diferite clase de compui organici Gruparea chimic
Hidrocarburi eteri, esteri Alcoli alifatici, cetone, amine Aldehide i legturi tri-Cl Legturi mono-J-, di-Br- i legturi nitro Legturi di-J-, tri-Br-, legturi poly-Cl i poly-F

Sensibilitatea relativ
1 10 100 104 105 106

Legturi mono-Cl- i mono-F-, mono-Br-, legturi di-Cl i di-F 1000

Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizrii. Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleiai grupri chimice deoarece ea depinde de structura legturilor .

II.2.1.5.6. Detectorul de emisie atomica

Detectorul de emisie atomic (AED - Atomic Emission Detector), figura II.14, reprezint o realizare relativ recent fiind legat n principal de evoluia detectorului de tip Diode- Array. Eluatul ce prsete colana cromatografic este introdus ntr-o plasm termic de heliu generat ntr-un cuptor cu microunde . Energia nalt a plasmei atomizeaz toate elementele din prob provocnd emisie atomic specific a acestora . Prin decompunerea radiaiei rezultate cu o reea de difracie rezult spectrul atomic al probei care este preluat de un detector Diode Array. Marele avantaj al acestui tip de detector este analiza multipl fiind posibil detectarea mai multor elemente n acelai timp. Profitnd de prezena unei plasme de nalt energie deja existent la spectrometrele clasice cu plasm cuplat inductiv (ICP-MS), la ora actual se realizeaz combinaii deosebit de performante ntre cromatografe HPLC i spectrometrele cu plasm cuplate inductiv (HPLC-ICP-MS) i gazcromatografe i spectrometre cu plasm cuplate inductiv (GC -ICP-MS). Aceste combinaii snt avantajoase ca pre de cost deoarece un cromatograf clasic beneficiaz de o plasm termic deosebit de performant generat de un alt aparat , respectic un spectroscop cu plasm cuplat inductiv (ICP) prezent poate chiar n acelai laborator.

37

Fig.II.14. Schema de principiu a detectorului de emisie atomic. 1-camer cu plasm

termic dat de microunde, 2- plasm termic, 3-oglind plan de reflexie, 4retea de difracie, 5-detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem electronic de achiziie , prelucrare i afiare II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare
Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, n cromatografia de gaze se datoreaz att selectivitii ct i sensibilitii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor

Fig.II.15. Schema de principiu a detectorului cu fotoionizare. 1-camer de ionizare cu radiaii

ultraviolete, 2,3- electrozi, 4- lamp de ultraviolete, 5- amplificator electronic, 6- sistem electronic de prelucrare i afiare

aromatice sau a speciilor organice cu heteroatomi . Acest tip de detector utilizez ionizarea cu radiaii ultraviolete a compuilor ce prsesc coloana cromatografic dup urmtorul model:
R + h R + + e

Doi electrozi colecteaz electronii rezultai ca urmare a ionizrii, electroni ce formeaz de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este proporional cu gradul de ionizare , iar acesta la rndul lui este proporional cu concentraia specieiei anlizate ce se gsete n acel moment n camera de ionizare.

38

II.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, n functie de mecanismele de separare, astfel exist : - cromatografia de lichide pe coloana inchisa; - cromatografia de lichide pe coloana deschisa; In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana inchis snt cunoscute metodele: 1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, folosinduse, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici. 2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara solida, poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni - substante cu o retea solida afnata, de natura organica sau anorganica. Cele mai raspndite sunt rasinile schimbatoare de ioni. 3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare poroase dar cu porozitatea selectionata astfel nct sa corespunda dimensiunilor moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin pori, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic neretinute odata cu faza mobila. Tehnica se mai ntlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeatie prin geluri n functie de natura apoasa sau organica a fazei mobile. 4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza stationara este o faza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, ntr-o coloana. Aici suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide. In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana deschisa faza mobila circula printr-un material poros dispus ntr-un plan si formnd un strat relativ subtire, dar de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana nchis. Se disting metodele : 1. Cromatogafia pe hrtie, tehnica n care faza stationara este o hrtie poroasa din celuloza (initial o hrtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte capilare. 2. Cromatografia pe strat subtire (TLC), n care faza stationara pulverulenta este fixat de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate. 3. Cromatografia pe strat subtire de nalta performanta (HPTLC), n care faza stationara are granulatie extrem de fina ridicndu-se astfel eficienta separarilor dar si viteza acestora. Cromatografia HPLC Cromatografia de lichide de nalt performan ( engl. HPLC - High Performance Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea de cromatografie de

39

nalt presiune (High Pressure Liquid Chromatography) este metoda cromatografic cea performant i este folosit n separarea i identificarea calitativ i cantitativ a substanelor din amestecuri lichide. Separri i analize de substane imposibul de realizat prin alte metode pot fi realizate uor prin HPLC. Pe de alt parte la aceast tehnic pot fi fcute i multe greeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experien practic bogat dar i de cunostiine stiinifice fundamentale. Avnd n vedere c att n cromatografia de gaze (GC) ct i in cromatografia de lichide HPLC starea de agregare iniial a probelor este cea lichid trebuie luat decizia asupra metodei cromatografice folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute n vedere urmtoarele: - la cromatografia de gaze proba trebuie adus n stare gazoas prin nclzire fr ca aceast operaie s duc la distrugere integritii moleculare a speciei anlizate , in practic numai cca 20 % din speciile moleculare ndeplinesc aceast condiie [LINDSAY - la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare i au limite de detecie mai bune dect la cromatografia de lichide - comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare cromatografic necorespunztoare n gazcromatografie ca urmare analiza lor trebuie fcut in cromatografie lichid - n cromatografia de gaze exist numai o singur faz staionar care poate interaciona cu moleculele probei , faza solid sau faza lichid, cu aceasta faz poate absorbi proba gazoas n orice raport - n HPLC att faza staionar ct i cea mobil pot interaciona mai selectiv cu proba . Multitudinea acestor interaciuni selective face cromatografia HPLC multilateral fa de cromatografia de gaze cu ea putnt fi rezolvate probleme de separare avansat deosebit de complexe. - n situaiile n care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare i snt mai rapide, iar dac este vorba de determinri curente la anumite clase de compui trebuie avut in vdere c un gazcromatograf este sensibil mai ieftin dect un cromatograf pentru HPLC. La cromatografia HPLC faza mobil purttoare denumit "Eluent" mpreun cu substanele lichide de analizat este pompat cu ajutorul unei pompe printr-o coloan cromatografic de separare ce conine faza staionar. n mod obinuit naintea coloanei de separare propriu zise se cupleaz o pre - coloan de separare pentru reinerea impuritilor, coloan care este sensibil mai ieftin dect coloana de baz. O coloan de separare ntr-un cromatograf HPLC are lungimea cuprins ntre 5 i 30 cm iar debitul de faz mobil este cuprins ntre 1-5 ml/min. La ora actual exist urmtoarele metode de cromatografie de lichide : cromatografie prin absorbie cromatografie prin repartiie cromatografie prin schimb ionic cromatografie de excludere cromatografie prin gel

La cromatografia schimbtoare de ioni faza stationar este este o rin schimbtoare de ioni iar gradul de separare este dat de intensitatea interaciunilor intre ionii probei i grupele schimbtoare de ioni din rin . In cromatografia de excludere ca faz staionar este folosit un gel cu pori mari care poate separa moleculele dup

40

mrime i form , la acest tip de cromatografie moleculele mari traverseaz cel mai rapid sistemul cromatografic. Cromatografia cu lichide supracritice Dac n timpul separarii cromatografice compoziia substanei de analizat rmne constant tehnica de cromatografic este denumit eluie izocratic. Dac compoziia fazei analizate este schimbat n timpul procesului de separare dup o modalitate prestabilit, tehnica poart denumirea de eluie de gradient .Cea din urm tehnic este folosit atunci cnd domeniul timpilor de retenie a moleculelor din prob este att de mare nct acetes nu pot fi eluate ntr-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solveni. Detectorii folosii n HPLC lnt detectori selectivi, ceea ce nseamn c ei nu rspund la toate moleculele existente nt-un amestec ci numai la anumite molecule sau clase de compui. In cromatografia de lichide nc nu exist un detector universal i de inalt sensibilitate aa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacr FID din cadrul cromatografiei de lichide, n schimb detectoarele din cromatografia de lichide acoper un numr mult mai mare de substane dect cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe snt greu de detectat n HPLC i trebuiesc aduse dup prsirea coloanei cromatografice ntr-o form detectabil tehnic denumit derivatizare dup coloan. Ca i la alte cromatografii n condiii tehnice date pentru analiza calitativ este definitoriu timpul necesar unei molecule din prob pentru a traversa sistemul cromatografic i a ajunge la detector, timp denumit timp de retenie. Dat fiind numrul extrem de mare de substane organice unele substane au timpi de retenie identici situaie n care peak-urile se suprapun putnd da natere la erori importante de interpretare. Pentru nlturarea acestui neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC snt spectrometrele. Tot mai des ieirile din coloanele cromatografice se cupleaz la spectrometre clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de mas (MS) situaia clasic fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaii de aparate au sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automat prin compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare, n momentul sosirii ei din coloana cromatografic la spectrometru, cu spectrele etalon din bibliotec electronic de spectre.

Aparatura folosit n cromatografia HPLC Cromatografele de lichide de nalt performan snt formate dint-un sistem de vase cu solveni (1) , o pomp de nalt presiune (3), o coloan cromatografic (6), unul sau mai muli detectori (8), i un sistem de prelucrare a datelor (9), ele mai snt completate cu elemente de reglare automat a debitului , a presiunii i a temperaturii. In figura 1 este reprezentat schema de principiu a unui cromatograf de lichide.

41

Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt presiune, 3manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pomp cu sistem de gradient, 11-sistem de msurare a presiunii i a debitului, 12-sistem de introducere prob, 13- xxxx, 14coloan cromatografic, 7- incint de termostatare a coloanei, 8-detector, 9-sistem de achiziie i prelucrare date, 10-cromatogram.

Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau soluii tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul lor de la recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare. O alt recomandare este aceea ca volumul mort , denumit i volum extracolumnar, ntre introducerea probei i traversarea detectorului s fie meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o lire de band (vezi i cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin msuri constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele componente ale unui cromatograf de tip HPLC Cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC) acopera azi, n proportie aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organo-metalice si anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea, mpreuna cu cromatografia de

42

Fig. II.16. Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Desi eficacitatea coloanelor nu o egaleaza nca pe cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pe lnga faza stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face posibile separari si analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masa a transformat, n ultimul timp, aceasta metoda n principalul mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna. Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica, care servea n primul rnd la izolarea preparativa a compusilor naturali. Prin introducerea pompelor si n consecinta, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze stationare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd cu anul 1969, la configuratia actuala figura II.16. Se poate observa ca din recipientele continnd unul sau mai multi solventi pompa (sau pompele), alimenteaza coloana cu eluent (de regula un amestec de doi sau mai multi solventi). n imediata vecinatate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. n coloana aflata ntr-o etuva termostat, are loc separarea propriu-zisa. Efluentul coloanei intra ntr-un detector de unde componentul, daca este separat complet, poate fi colectat si izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni. Semnalul este nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esenta, un cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai prezentat colectorul de fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora constituind-o sursa de eluent pompa.

43

Solvent Pompa Injector Coloana Detector nregistrator

Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

II. 2.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC)

Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii n cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o coloana si care pot nregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar semnalul lor. ntruct coloanele de separare performante au capacitati de ncarcare mici, sistemul de detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca n LC volumul de proba este de ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza n mod continuu picul cromatografic. n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare dispozitiv de analiza chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinatia dintre un detector refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza polimerilor n amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica n urma adaugarii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate practica chiar nainte de introducerea probei n coloana, dar si dupa iesirea din coloana a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pna n prezent n special legata de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza unor amestecuri de compusi numerosi avnd aceleasi functiuni reactive (de exemplu aminoacizi). Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici n UV-VIS

Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC, ct si n HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral. Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea LambertBeer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita de detectie sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS (prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la ntreaga scala, l. engl.). Astfel n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.

44

Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH 2). ntre acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct proporionala cu coeficientul de extincie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui mrita lungimea celulei dar aceasta este restricionata. Sensibilitatea este de ordinul 5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm. Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori. 1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentata n figura II.18.

Sursa Monocromator Celula nregistrator

Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric 2. Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit si selectarea lungimii de unda la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbanta celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai mare sigurana analizei, n sensul ca permite stabilirea puritii, adic daca picul constituie un semnal dat de o singura substana sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii picului). Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentat n figura II.19. Detectorul este format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1l-10l care este intersectata de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treac prin celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta mrete intensitatea semnalului) si apoi la sistemul de achiziie, prelucrare si afiare a datelor obinute (8); rezultatul este o cromatograma (9) ale crui picuri va oferi informaii calitativa si cantitative despre substanele din soluia analizata.

45

10 2 3 6 7

8 t

Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de
la coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7amplificator,8- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9cromatograma,10- cuva detectorului

II. 2.1.2. Detectori refractometrici

Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii. Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de transmitere a luminii prin medii transparente avnd un indicele de refractie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente unul continnd doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura II.20
3 1 5 8 M 6

9
6 C 2 I 10

Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6,6 *fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcie de unghiul sub care cad razele

46

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul 6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt diferite, motorul primete un semnal de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are loc compensarea modificrii indicilor de refracie. In urma deplasarii urubului 8 , sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre detector. n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu, neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura (0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.

II. 2.1.3. Detectorii electrochimici

Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv reduce. Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda analiza si identificare a substantelor. Exista doua tipuri de detectori electrochimici: - Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti - Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la substantele organice;

II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici

Detectorii conductometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde substantele disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere n cromatografia pe schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg1ng). Detectorii conductometrici msoar conductivitatea fazei mobile. Este constituit din doi electrozi situai in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta este msurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata. Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat n figura II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub

47

forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in cromaograma. Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu 5kH.

6 1 2

4 3

Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta

frecventa, 2- celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat ce vine de la coloana cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica, 6- amplificator, 7- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 8cromatograma in coordonate conductivitate si timp

II. 2.1.3.2. Detectorii amperometrici sau coulometrici

Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din trei electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar alimentat cu solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de referinta se aplica o tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba cinetica a curbelor de reducere, care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt negative , figura II.23. ale elementelor care se gasesc in solutia electrolitica complexa. Din E1 substantele incep sa se reduca, intensitatea de reducere creste cu potentialul. Daca se aplica potential negativ in partea stanga a lui E0, se observa ca E3 reprezinta inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii acelui element.

48

i 3 4 7

10

6 2 5

9 8

Fig.II.22.

Principiul de functionare al detectorului electrochimic amperometric. 1- substantele ce vin de la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4celula electrochimica,5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6electrodul de referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor,10- cromatograma in coordonate intensitatea cinetica si timp

+i

E6

E5

E4

E3 E0 E1 E2 E(mv)

-i

Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinuta Pentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama potentialelor. Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se duc tangente la curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se duc din capatul tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).

II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta

Detectorii de fluorescenta se bazeaz pe msurarea intensitii fluorescentei pentru substanele ce prezint acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care apare la unele substane cnd sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substane emit radiaii pe o lungime de unda mai mare dect a radiatei incidente. Daca emisia de radiaii are

49

loc in acelai timp cu emisia de radiaie ultravioleta incidenta fenomenul se numete fluorescenta. Putini compui prezint fluorescenta iar cei ce nu prezint pot fi transformai in derivai ai lor ce au aceasta proprietate. Fluorescenta s-a artat a fi foarte folositoare ca proces de detecie iar cu detectorii bazai pe fluorescenta s-au obinut unele dintre cele mai nalte sensibilitati din cromatografie de lichide. Tehnicile de detecie bazate pe fluorescenta confer o buna sensibilitate probelor concentrate si o sensibilitate mult mai mica atunci cnd se folosesc instrumente de genul senzorilor de temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina de fluorescenta este msurata pe un fundal ntunecat( sau la zgomot de fond redus). Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poat fi msurata instrumental, raportul dintre cantitatea de radiaie remisa si cantitatea de radiaie UV incidenta trebuie sa aib valori cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este aranjat astfel incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90), figura II.24., pe raza incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar interactiona cu semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal aproape negru (pentru a mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru). Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi foarte sensibil si relativ ieftin).
1 2 3 4 I 16 15

t 5 8 13

14 7 9 10 11 12

Fig.II.24.

Principiul de funcionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radiaie, 2- fanta, 3- filtru, 4- lentila, 5- substana ce vine de la coloana. 6- substana de analizat, 7cuva cu perei de cuar, 8- unghi de 90 grade,9- substana ce iese din cuva, 10lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem de preluare, prelucrare si afiare a datelor, 16- cromatograma.

Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la detectorul de fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si preluat de sistemul de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate sub forma unei cromatograme (16).

II. 2.1.5.Detectoare Diode Array

50

Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice. Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7). Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare, prelucrare si afiare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si timpii lor de retentie (analiza calitativa). Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10 -7 g/ml iar domeniu dinamic liniar de 5x103. Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25
2 1 3 6

10 7 t 8 9

Fig.II.25. Principiul de funcionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaii ultraviolete, 2substana ce vine de la coloana cromatografica,3- substana ce pleac la tratament chimic, 4- fereastr cuart, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6reea de difracie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziie si afiare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de unda)

II. 2.1.6. Alti detectori

In practica analitica se mai ntlnesc si alti detectori prezentati schematic n tabelul 2. Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria de masa si FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin alte variante de detectie n lipsa etaloanelor cunoscute. Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre cunoscute, sa se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate substantele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenti n proba. Tab. II.2. Alti detectori utilizati n LC

51

Detectori LC Fluorimetrici Electrochimici (Amperometrici) Bazati pe Spectrometria de Masa (MS) FT-IR Difuzia luminii Activitate optica Electrozi ion selectivi Fotoionizare

Limita de detectie 1-10pg 10pg = 1ng 100pg 1ng 1g 10g 1ng 10ng

Caracteristici Este necesara uneori derivatizarea Sensibilitate 10-10M Sensibilitate 10-10M Compusi oxidabili sau reductibili Necesare coloane capilare Necesara pulverizarea Pret de cost ridicat Pret de cost ridicat Adecvati pentru macromolecule Pentru substante optic active Doar pentru ioni sau compusi ionizabili -

Disponibilitateco merciala Da Da Da

Da Da Nu Nu

1pg- 1ng

Nu

II. 2.2. Electroforeza capilara

Electroforeza este o metoda cromatografica de analiza la care separarea componentilor se face pe baza unui gradient de potential in curent continuu. Electroforeza poate fi: fara medii stabilizante; cu medii stabilizante. Mediile stabilizante pot fi: hartia electroforetica; geluri speciale pe placi de sticla; structuri de pulberi depuse in tuburi. Bazele electroforezei au fost puse de catre Tisellius ce a dezvoltat electroforeza fara medii stabilizante figura II.26. a si b. In fig. II.26. a este reprezentata forma initiala a montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand sistemul este alimentat cu tensiune electrica componentele se separa in functie de gradientul lor de potential, fig. II.26.b.

52

+ electrozi Solutie tampon A C A+B B+C B A

B+C

A+B+C a b

Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de detectare al eletroforezei capilare).

7 8 9

10

+ I

2 3

1 11 t

Fig.II.27.

Principiul electroforezei capilare.1- anod, 2- solutie tampon, 3- celula electroforetica, 4- catod, 5- fotodetector (in UV, Dioda Array etc), 6- tub capilar, 7-sursa de radiatie, 8-fanta, 9- Amplificator, 10- sistem de preluare,achiziie si afiare a datelor, 11cromatograma electoforetica

Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din amestecul de analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi

53

detectati cu ajutorul unui sistem de detectie ce vor transmite semnalul la un amplificator. Dupa amplificarea semnalul ajunge la sistemul de preluare, achiziie si afiare a datelor care ne va oferi informatiile in ceea ce priveste substantele din amestecul analizat sub forma unei cromatograme electroforetice. Fiecare substanta este caracterizata de timpul propriu de retentie (analiza canlitativa) iar inaltimea picului corespunzator ofera informatii despre cantitatea de substanta existenta. Avantaje ale electroforezei capilare sint: - separarea componentilor dintr-un amestec este mai avansata ca la HPLC i creste cu cit tensiune electrica aplicata este mai mare - pretul este mult mai mic decat cel de achizitie a unui HPLC; - fiabilitate mai buna decit la HPLC

54