Protein Microarray

Fondul Social European Investete n OAMENI!
Proiect cofinanat din Fondul Social European Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Tehnici de imunodetectie
de la ELISA la Protein microarray
Tehnologia
PROTEIN MICROARRAY
CSIII Dr. Carolina Constantin Expert termen lung
CSII Dr. Monica Neagu Coordonator tematic Proteomica
Activitatea 1.3.
Proteomica de la cercetare la clinica curs de baza
Cuprins
Notiuni de imunodetectie, ELISA in dezvoltarea testarii
tip array
Tehnica microarray in contextul omicii
Principiul microarray
Detalii de metodologie
Aparatur utilizat
Interpretarea datelor
Tranziia tehnologiei de Protein microarray de la
cercetare la diagnosticul de laborator,
Avantajele si dezavantajele tehnologiei,
Costuri/beneficii probe, echipament, know-how
Cuprins
Notiuni de imunodetectie, ELISA in dezvoltarea testarii
tip array
Aparatur utilizat
Avantajele si dezavantajele tehnologiei,
Pentru a intelege prezentul trebuie
sa ne cunoastem trecutul
adaptare dupa
To know your future, you must know your past,
each stepping stone that has been cast.
Remember the good, as well as the bad,
and feel the emotions of happy and sad.
[Margaret Jang]
You have to know the past to understand the present.

[Dr. Carl Sagan]
"Whoso neglects learning in his youth, loses the past and is dead for the future."
[Euripide]
"Study the past if you would define the future...."

[Confucius]
Epoca pre-ELISA
1960 conceptul de
imunodetectie se rezuma la
radioimunoanaliza - se baza
numai pe utilizarea Ag sau Ac
marcati radioactiv;
Radioactivitatea indica prezenta
in proba a legarii Ag-Ac - Rosalyn
Sussman Yalow si Solomon
Berson
1960 - Roger Ekins publica
saturation analysis
Yalow -1977 post-mortem Premiul Nobel pentru
Medicina the development of the RIA for peptide
hormones
Detectia ne-radioactiva
Efervescenta RIA
Decada RIA
I-131 (radiatii gama si beta)

I-125 (radiatie gama mai slaba)
1970 scepticism in marcarea cu o
enzima
Baby - ELISA
1966 anul nasterii tehnicii un bebe nebotezat inca
Leif Wide si Jerker Porath au fixat Ag sau Ac

pe un substrat imunosorbent
Independent de ei Stratis Avrameas si G.B. Pierce au reusit

legarea unei enzime de Ac
Botezul - ELISA
In 1971, Peter Perlmann si Eva Engvall (Suedia), Anton Schuurs si
Bauke van Weemen (Olanda), au publicat independent tehnicile si
metodologia pentru EIA si ELISA
Rudolf M. Lequin, History-Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry 51: 2415-2418, 2005
1977
1976
ELISA - frenzy (mania)
30 de ani de suprematie!
Comercializare rapida
Caracteristica majora - facilitate
Aplicatii biotehnologie, industria alimentara,
industria farmaceutica, toate ramurile medicinei
umane/veterinare, toxicologie etc
Tipuri majore ELISA
ELISA indirecta
ELISA sandwich sau directa
ELISA competitiva
ELISA indirecta
ELISA directa
ELISA competitiva
ELISA pentru functionalitatea celulara
ELISpot
Aplicatii
Transplant
Dezvoltarea de vaccinuri
Analiza subpopulatii Th1/Th2
Autoimunitate, Cancer
Allergy
Boli Infectioase
Imunitate umorala
ELISpot - unicelular
N. Varadarajan et al, The Journal of Clinical Investigation, Volume 121 (11), Nov 2011
2009 Multiple and Portable ELISA
Faza solida este un stick de polistiren cu 8-12

protuberante ;
Stickul/Tubul se imerseaza in proba;
Toate etapele de lucru (spalare, incubare in conjugat,
incubare in cromogen) se realizeaza prin introducerea
tubului in godeuri de microplaci standard care contin
reactivii de lucru.
Unde intervine ELISA AZI
In dezvoltarea standardelor specifice de
tip de proba: plasma si ser, urina,
(controalele pozitive, negative, curbele
standard) Controlul calitatii
In Prevalidare
In Validare
In Descoperire de biomarkeri
Unde intervine ELISA AZI
In toate etapele descoperii si validarii
unui Biomarker
Faza 1 descoperire fishing stage
Faza 2 validare
Faza 3 etape preclinice
Faza 4 studii prospective
Faza 5 studii de screening
Cancerul ovarian
Cancerul
Colorectal
Exercitiu
Cancerul de
prostata
CD90
CD10
Autoanticorpii
anti-peptide
tumorale
Biomarkeri de detectie timpurie in cancer
(2003 2007)
Site Number of Biomarkers

Bladder 3
Breast 7
Cervical /Endometrial 2
Colorectal 21
Esophagus 7
Hepatocellular 9
Kidney 1
Lung 12
Mesothelium 2
Ovarian 5
Pancreatic 16
Prostate 15
Viitorul ELISA
Validation of saliva-based assay for oral

cancer, refinement of ELISA-based assay
The Early Detection Research Network, NIH

Publication No. 07-6135, March, 2011
Istoria protein microarray incepe cu genele
1995 Schena publica detectia a mii de mRNA-uri ca

expresie a proteinelor in legatura directa cu aparitia
diverselor maladii;
2000 MacBeath si Schreiber (Harvard University)
combina tehnologia imunodetectiei cu microarray-ul
pentru DNA.
Istoria protein microarray incepe cu genele
... si ideea se leaga rapid
Chip-ul pentru proteine

Noua tehnica e imbratisata rapid pentru ca suportul
exista de la gene-microarray (sticla, geluri etc)
tehnica era deja implementata (printere robotizate de
chipuri pentru gene)
toata tehnologia era compatibila cu instrumentatia
standard din orice laborator.
Si totusi, de ce ne trebuie microarray?
ELISA e prea prafuita?
Trebuie sa gatim altfel?

Si totusi, de ce ne trebuie microarray?
Mai mult,
Mai repede
Mai divers
Mai curat
Multianalitiplex
De la ELISA la Protein microarray
Viitorul exuberant creat de

ELISA
Fondul Social European Investete n OAMENI!
Proiect cofinanat din Fondul Social European Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Tehnologia
PROTEIN MICROARRAY
CSIII Dr. Carolina Constantin Expert termen lung

CSII Dr. Monica Neagu Coordonator tematic Proteomica
Cuprins
Notiuni de imunodetectie, ELISA in dezvoltarea
testarii tip array
Aparatur utilizat
Avantajele si dezavantajele tehnologiei
Detaliere cuprins

Ce aduce nou tehnologia microarray?
Cu ce incepe protein microarray?
Clasificare protein microarray
In functie de structura proteica imobilizata
In functie de parametrul determinat
Lame (chip) de protein microarray
Detectia in protein microarray
Instrumente de analiza a datelor
Aplicatii de protein microarray
Situatia internationala
Protein Microarray pentru specialisti
Ce aduce nou Tehnologia microarray?
Multiplexare: numar crescut de probe, numar crescut

de analiti pentru o functie specifica se poate testa
intreaga gama de proteine care sunt implicate in acea
functie!
Descoperire de proteine sau descoperire de noi
functii ale proteinelor cunoscute;
Flexibilitate in detectia legarii: colorimetrie,
fluorescenta, chemiluminiscenta, spectrometrie de masa,
SPR etc
David A. Hall, Jason Ptacek, and Michael Snyder, Protein Microarray Technology, Mech Ageing
Dev. 2007 January ; 128(1): 161167.
Ce aduce nou Tehnologia microarray?
Analiza a mii de proteine din domenii cheie (ex.,

toxicologia); interactii moleculare; activitati
enzimatice; identificare cai de semnalizare;
identificare si validare biomarkeri de diagnostic,
prognostic; monitorizare terapie.
Economie de reactivi; timp;
Prelucrarea datelor volum multidirectional de
informatii!
David A. Hall, et al., 2007
Omica castiga teren
Genomica, transcriptomica, proteomica si
metabolomica fortele motrice in studiul avansat al
sistemelor biologice
In era post-genomica protein microarray devine o
tehnologie cheie:
capacitate de analiza pe scara larga
dimensiune miniaturala
necesitati minime de proba luata in studiu si reactivi
satisfactie stiintifica, nu in ultimul rand! (comenzile
audio pe volan!)
Cu ce incepe Protein Microarray?
Cu o prietenie statornica a tehnicii ELISA!

Parteneriat de reactie:
un partener imobilizat pe suportul de lama structura
proteica (anticorpi)
perechea potrivita in proba biologica de analizat analiti
Clasificarea formatele existente de protein
microarray:
Mai multe strategii actuale de clasificare
Structura proteica imobilizata
Parametrul determinat prin interactie
Cu ce continua Protein Microarray?
Echipament
Program de analiza a datelor
Reactivi (kituri)
Echipament adecvat: scanner, computer cu soft
dedicat; optional printer
Chip de proteine - dispozitiv suport de dimensiunea
unei lame de microscop, cu proteine purificate
imobilizate, in densitate mare pe suprafata
Multitudine de suporturi populare (sticla derivatizata)
Modalitati de imobilizare a proteinelor variate
Etape unice ale tehnologiei:
Interactie antigen-anticorp: analitii din proba
sunt incubati cu moleculele/proteinele
imobilizate pe lama/array;
Marcare reactie: enzimatic/colorimetric, fluorofor
etc
Detectia: reactia dintre parteneri (Ag/Ac) este
detectata prin intermediul unei marcari, evaluata
calitativ/cantitativ.
1 Pregatire
Alegere
lama
suport/liganzi/
(chip)
metoda
2
Incubare
cu proba 3
Detectie fara
marcare (MS,
SPR)
Legare
reactanti
Detectie cu 4
marcare 5
Schema generala experiment tipic de protein microarray

Cretich M et al., Biomolecular Eng., 2006
Detaliere cuprins

CLASIFICARE PROTEIN
MICROARRAY
CLASIFICARE FORMATE PROTEIN
MICROARRAY
A. In functie de structura proteica imobilizata:
Standard
Analitic
De faza inversa
B. In functie de parametrul determinat:

De abundenta
De captura
De faza proteica inversa
Functional
Standard proteine purificate recombinante (PMA)
Analitic molecule de anticorpi (AMA)*
De faza inversa lizat celular integral sau fractionat (RPPM)
RPMM = Reverse phase protein microarray
Faza directa standard, analitic, lectinic
Faza inversa lizat celular

Component imobilizat
PMA AMA RPPM
Tipuri de protein microarray in functie de structura

imobilizata pe lama suport
Hultschig C et al., Curr Op Chem Biol 2006

Standard
Analitic
De faza inversa
Microarray in format standard PMA
Specificitati anticorpi -
prima aplicatie cu acest
format;
Identificare substrat
enzimatic;
Studiu interactie proteina-
proteina;
Studiu interactie proteina
ADN;
Markeri de diagnostic!
Standard
Analitic
De faza inversa
Microarray Analitic AMA
Anticorpi imobilizati pe suportul
planar;
Proba de analizat (complex proteic)
este incubata pe lama de microarray
- determinarea afinitatii de legare,
specificitatilor, nivelelor de
expresie a proteinelor din amestecul
analizat;
Aplicabilitate in diagnostic clinic!;
Cercetare fundamentala evaluare
normal versus patologic;
Industria alimentara (control al
calitatii);
Studii de poluare a mediului ambiant;
Standard
Analitic
De faza inversa
Microarray de faza inversa RPPM
Complex nepurificat, simplu
sau fractionat = mixtura
proteica derivata din lizate
celulare sau tisulare;
Acces la studiul modificarilor
post-translationale ale
proteinelor, mai putin
abordabile cu metode
proteomice traditionale;
Analiza pe scara larga, proba
start infima;
Detectie in interval pg/at;
Rezultate omogene;
Domeniu extins de aplicatii
Atentie la costuri!
Microarray de abundenta masoara abundenta unor
biomolecule specifice
De captura
De faza inversa
Microarray functional masoara functiile
biomoleculelor pe scara larga
NAPPA Nucleic Acids Programmable Protein Array
PISA Protein In Situ Arrays
In situ Puromycin Arrays
De captura
De faza inversa
biomoleculelor pe scara larga
Microarray de captura (nu uitati de AMA!)
Molecule de captura imobilizate: anticorpi; aptameri,
fotoaptameri, aficorpi;
Capteaza tintele lor specifice din mixturi complexe;
Analogi directi ai ADN microarray (gene-microarray);
Cantitatea/concentratia de analiti tinta determinata prin
comparatie cu o proba de referinta!
Curba etalon la PMArray cantitativ
Scheme pentru detectia analitilor in microarray de captura:
Marcare directa
Metoda sandwich
Marcarea directa proba de analizat este supusa unui
procedeu de marcare care adauga tuturor analitilor acelasi
marker detectabil (de ex., colorant fluorescent) - calitativ
Metoda sandwich utilizarea a doi reactivi (anticorpi) pentru
acelasi analit, unul pentru captura si al doilea pentru
detectie - cantitativ
De captura
De faza inversa
biomoleculelor pe scara larga (III)
Microarray de faza inversa (va amintiti de RPMA!)
Este un microarray fals nu constituie un aranjament de elemente
cunoscute, cu continut definit
DE FAPT
Suportul este imprimat chiar cu probele experimentale!
Probele sunt ulterior tratate cu reactivi specifici pentru analit (RSA
reagent specific analyt) anticorpi
Disponibilitatea RSA caracterizati si definiti factor cheie
(+) Concentratie de analit mare in cadrul spotului
(-) Posibilitate interactii false
(-) Numar limitat situsuri de legare la nivelul proteinelor din spot
Diferentiere tip de cancer pe baza abundentei proteice

(model experimental)
Avantaje / Dezavantaje formate si marcari array
+ Probe multiple simultan
+ Comparatie 2 tipuri probe cu markeri diferiti
Marcare directa - Probe modificate chimic prin marcare
- Reactivitate incrucisata RSA
+ Probe nemarcate
+ Specificitate prin RSA
Marcare
sandwich - Doi RSA pentru fiecare tinta
- Dificultate in multiplexare
+ Screening rapid probe numeroase
- Reactivitate incrucisata rezultate false

Faza inversa - Interval dinamic ingust in detectie analiti
- Proteine rare pierdute!
LaBaer J et al., Curr Op Chem Biol, 2005

De avut in vedere la microarray de abundenta
(captura/faza inversa):
Captura analitilor: RSA rol cheie (de regula anticorpi);
Stabilitate, selectivitate, afinitate pentru ligand sensibilitate si
stabilitate formatul de abundenta;
RSA de inalta calitate sunt disponibili pentru un numar limitat de
molecule tinta!
Succesul microarray de captura - analiza de citokine (nu uitati
acest aspect!), pentru care exista bateria de anticorpi corespunzatori;
Risc de reactivitate incrucisata;
Cu Pro si Contra format aplicat cu succes in biomedicina

Exemple de aplicatii - microarray de captura (1)
Monitorizare modificari in abundenta proteica in celule
de carcinom colon, supuse radiatiei ionizante
Utilizarea unui array cu 146 anticorpi fata de proteine
implicate in functii celulare importante (ciclu celular,
apoptoza)
Validare rezultate prin Western Blot
Exemple de aplicatii - microarray de captura (2)
Identificare potentiali biomarkeri in cancerul de prostata
Microarray de captura cu 184 anticorpi fata de proteine
tinta din ser pacienti
Proteinele marker candidat au fost validate prin ELISA
De captura
De faza inversa
biomoleculelor pe scara larga.
A fashion guide:
Microarray de proteine functional
Proteom/proteine/peptide imobilizate, ce vedem:
o Proprietati biochimice si functionale;
o Interactii cu alte proteine, acizi nucleici, lipide;
o Studiu activitate enzimatica si specificitate de substrat;
Limitari cand studiem functiile biomoleculelor:
o Labilitatea proteinelor pe suportul microarray;
o Timp indelungat si costuri ridicate pentru purificare si
concentrare proteine;
o Metodele de fixare a proteinelor la suport efect asupra
comportamentului proteinelor!
Dincolo de limitari! - Sisteme de protein array
compacte: Self-assembled systems
Consecinta unor provocari continue:

Generare anticorpi de calitate inalta: expresia si
purificarea in sistemele E.coli pentru constructia de
array.
Desi majoritatea proteinelor recombinate pot fi exprimate in
sisteme celulare, alte numeroase proteine (inclusiv anticorpii)
ridica probleme in acest sens datorita solubilitatii, prezentei
puntilor diS sau toxicitatii fata de sistemul celular gazda.
In aceste situatii se prefera sistemele de expresie proteica cell-
free - sisteme in vitro bazate pe sinteza de la ADN.
Mentinerea structurii si functiei proteice in stadiu
imobilizat solutie propusa de metodele in situ
de productie proteica, in sisteme cell-free.
Abordarile in situ: proteine cu proprietati diferite
sunt simultan produse si imobilizate, permitand
crearea unor arrayuri la ordin, cu concentratii
initiale de reactant extrem de scazute.
In situ protein arrays conversia array de acizi
nucleici in array de proteine, in acelasi sistem!
Microarray functional: A fashion guide
NAPPA Nucleic Acids Programmable Protein

Array
> 2000
Agent imobilizare
Protein in situ arrays (PISA) expresie in situ a proteinelor de interes

Proteinele sintetizate de la ADN, in solutie sau imobilizat, fiind ulterior
atasate la suprafata array-ului printr-o secventa tag specifica;
Limitare fixarea pe suprafata array a unui agent de imobilizare, capabil sa

lege secventa tag si astfel sa faciliteze reactia de expresie proteica.
Post translatie, proteinele sunt atasate specific de array sinteza la locul

faptei!
He M, Taussig MJ (2001), Nucleic Acids Res 29:E7373
> 2005
Initial ADN este transcris in ARNm iar la capatul 3 este hibridizat cu un ADN
monocatenar modificat cu puromicina si biotina.
Hibridul ARNm este imobilizat pe suprafata cu streptavidina si translatia proteica in situ

are loc
Ribozomii care fac translatia intarzie in dreptul regiunii hibride RNA/DNA iar eliberarea
proteinei nascente este incetinita.
Puromicina atasata la ADN capteaza si imobilizeaza proteina noua pe suprafata array-

ului.
Tao S-C, Zhu H (2006) Nat Biotechnol, 24:12531254

> 2008
O dorinta arzatoare 2 in 1 a tehnologiei pe chip: conversia ADN array la

protein array, prin transcriptia si translatia de la o matrita de ADN
imobilizat.
Plasmide biotinilate care codifica pentru proteine de fuziune GST sunt

printate pe lame de silica, simultan cu streptavidina si un anticorp anti-GST
drept molecula de captura;
Sistemul este incubat cu un extract celular pentru expresia proteinei de

interes care va fi captata de Ac anti-GST rezulta un protein array co-
localizat cu matrita ADN.
Ramachandran N et al (2008). Nat Methods, 5:535538
Aplicatii protein in situ arrays
NAPPA
1. Evaluare imunitate in maladii autoimune

Expresie a 3498 proteine de la pacienti cu spondilita
anchilozanta (AS) si artrita reumatoida (RA),
comparativ cu donori sanatosi.
Raspunsuri diferite ale autoanticorpilor in AS fata
de RA sau normal.
Evidenta unei autoimunitati umorale sistemice si
productie de autoanticorpi multi-specifici la
pacientii cu AS.
Anderson KS, (2011). J Proteome Res 10:8596

2. Dezvoltarea de biomarkeri
Studiu pentru valoarea ca biomarker de diagnostic si
prognostic a autoAc p53 serici in cancerul ovarian.
AutoAc p53 au fost detectati in peste 40% cazuri
de cancer ovarian avansat si 8% control.
AutoAc p53 nu ajuta semnificativ diagnosticul sau
discriminarea benign versus malign comparativ cu
alte antigene ca CA-125 sau HE4.
AutoAc p53 utili ca biomarker de diagnostic
independent de CA-125 si HE4, cu valoare de
prognostic pentru supravietuirea globala a
pacientului.
3. Semnatura proteica in detectie timpurie cancer
4988 antigene proteice

testate Cancer de san
761 antigene selectate Pre-screening de

eliminare antigene non-
119 antigene selectate
informative;
Selectie succesiva
antigene cu set
28 antigene selectate
final independent de seruri;
Panel pentru detectie
timpurie antigene asociate
Panel detectie timpurie cancer san!
Ramirez AB, et al (2010), Mol Cell Proteomics, 9:14491460

Detaliere cuprins

LAME (CHIP) DE PROTEIN MICROARRAY
Spoturi
Lame (chip) de microarray proteine
Suportul solid, plan, pentru reactia antigen anticorp

Moleculele de studiat se afla imobilizate sub forma de spoturi;
Moleculele imobilizate trebuie sa-si mentina activitatea, conformatia, sa
ramana stabila si sa nu se desoarba in timpul etapelor experimentale;
Tipul de fixare/imobilizare sa prezerve la maximum capacitatea de
legare a proteinei (situsuri de legare in numar mare, nemascate);
Echipament disponibil (printere robotizate, scanner) adaptat din

generatia microarray de ADN
Reactivi speciali si conditii experimentale dedicate pe parcursul
imprimarii lamelor;
Necesitati cheie ale suprafetei pentru microarray
de proteine
1. Furnizarea unei capacitati optime de legare a

analitilor/liganzilor pentru probele biologice de studiat;
2. Retinerea activitatii biologice a moleculei fixate;
3. Accesibilitatea ligandului la partenerul de interactie
imobilizat pe suport;
4. Grad scazut de interactii nespecifice.
1 Adsorbtie de suprafata: Interactii
hidrofobe/electrostatice
2 Blocare fizica
3
Legare covalenta
4
Biorecunoastere
Mecanisme uzuale de atasare a biomoleculelor la suport

Adsorbtie de suprafata
Forte electrostatice pe suprafete incarcate (ex. lame
cu poli-L-lizina)
Interactii hidrofobe (nitroceluloza sau membrane

poliviniliden fluorura PVDF)
Dezavantaje adsorbtie de suprafata

Desprindere proteine la o spalare stringenta;
Nivelul bazal ridicat datorita reactiilor nespecifice de
adsorbtie-desorbtie ale proteinei;
Proteinele adsorbite la suprafete hidrofobe tind sa se
denatureze.
Legare covalenta
Grupari electrofile pe suport grupari nucleofile ligand
Electrofile: epoxizi, aldehide, succinimidil esteri etc
Nucleofile: amino, tiol, hidroxil
Grupari functionale introduse pe suport prin modificarea

sticlei cu: organosilani (3-glicidoxipropiltrimetoxisilan GOPS, 3-
aminopropiltrietoxisilan APTES)
Monostrat self-asamblat (SAM) sau polimeri grefati pe suprafata
Dezvoltat recent - ProLinkerTM este derivat calixarenic
imobilizare eficienta pe film aur sau sticla aminata
Blocare fizica (physical entrapment)
Inglobarea proteinei intr-un matrix special gel de poliacrilamida

sau agaroza
Structura tridimensionala a acestora, mareste capacitatea de
incarcare cu proteina
Nu perturba situsurile potential functionale sau domeniile
reglatoare ale proteinei;
Mediul apos caracteristic gelului impiedica denaturarea proteinei;
Abordari mixte adsorbtie cuplata cu filme de polielectroliti
(PET)
Biorecunoastere - Orientarea pe suport a biomoleculei
Atasare/imobilizare randomizata
Proteine imobilizate prin intermediul gruparilor NH2 (amino)
- sticla derivatizata cu rest aldehidic sau epoxi;
Proteine imobilizate prin adsorbtie pasiva sticla tratata cu
nitroceluloza sau poli-L-lizina
Atasare/imobilizare uniforma
Proteine modificate prin aditia unei molecule mici
(biotina)/cozi (tag, ex HisX6);
Suprafata de sticla imbracata cu streptavidina/nichel;
Orientare proteina spre exterior, confera acces partenerilor
de reactie la situsurile active din structura proteinei.
Proteina
Modalitati de atasare
Atasare randomizata
proteine la suport
A. Legare randomizata pe
lame sticla tratate chimic;
proteine legate covalent
prin grupari NH2 sau prin
adsorbtie.
Atasare prin ligand/orientata B. Legare orientata prin
ligand. Proteinele
biotinilate/tag pot fi atasate
pe lame imbracate cu
streptavidina/nichel. Tag
Proteina orienteaza proteina pe
suprafata lamei.
Tag/biotina
Hall DA et al., Mech. Ageing Dev, 2007

Spot, bloc, grila
Cum e configurata o lama?
Lama/chip cu 224
anticorpi diferiti, in
duplicat
Imprimati in 4x8
zone/subarray/grile
Lame sticla cu
nitroceluloza
Fiecare grila 7 anticorpi
in duplicat, un control
pozitiv, un control
negativ
Grila/subarray
512 spoturi total FAK,
MAPK, Raf, p38 etc
Lama
Detaliere cuprins

DETECTIA IN PROTEIN
MICROARRAY
Detectia inseamna
Captare semnal eliberat de parteneriatul de reactie
Strategii majore de detectie cu marcare/fara marcare
Marcare marcare molecule de interes cu coloranti

fluorescenti; radioizotopi; chemiluminometrie;
Fara marcare determinarea unei proprietati intrinseci
(masa, proprietati dielectrice)
Detectie at first sight!
Cu marcare
Directa:
Fluorofori
Cromofori
Chemiluminiscenta
Radioactivitate
Alte metode directe
Indirecta
Sandwich
Fara marcare
A. Metode de detectie cu marcare
Sunt incadrate urmatoarele subtipuri:
Directa o mixtura de proteine este imobilizata, detectia
se realizeaza cu molecule de legare, marcate: anticorpi
Indirecta sunt utilizati anticorpi imobilizati ca si
captura, tratati cu proteine marcate
Sandwich un anticorp primar imobilizat functioneaza
ca agent de captura pentru proteina din proba,
recunoscuta ulterior cu un anticorp secundar marcat
Metode de detectie cu probe marcate
1. Directa: detectie specifica

cu anticorpi marcati
2. Indirecta: anticorpii de captura

sunt tratati cu proteine marcate
(proba marcata)
3. Sandwich: intervin anticorpi

secundari marcati anti-analit
Cu marcare
Directa:
Fluorofori,
Cromofori,
Chemiluminiscenta,
Radioactivitate,
Alte metode directe
Indirecta
Sandwich
Fara marcare
Marcare directa
Markeri fluorescenti
Markeri cromofori/cromogeni
Marcare prin chemiluminiscenta
Marcare prin radioactivitate
Alte metode directe

Markeri fluorescenti
Sunt prima alegere in detectia pentru analiza protein
microarray
Compusi de detectie fluorescenta consacrati
Fluoresceina
Cianine
Rodamina
Acridine
Ficobiliproteine
Alegerea depinde de tipul probei de analizat, spectrul de
emisie si substratul de reactie
Reprezentanti - Markeri fluorescenti
Cy3 (ex 550/em 570)
Cy5 (ex 650-670/em 649)
Tendinta redusa de foto-oxidare si timp de injumatatire
adecvat;
Detectia simultana a celor doua specii permite
compararea directa a intensitatilor fluorescentelor in
probe diferite, fara variatii interexperimentale;
Specii fluorescente cuplate cu anticorpi cea mai
simpla si versatila strategie pentru o detectie
specifica si sensibila.
Markeri cromogeni
Cromogeni = substraturi in reactii enzimatice care
genereaza un produs colorat, insolubil
Enzime pentru reactii cromogene in analiza microarray
Fosfataza alcalina
Peroxidaza
Substrat cromogen
TMB, DAB pentru peroxidaza
BCIP/NBT pentru fosfataza alcalina
Marcare prin chemiluminescenta
Utilizare in analiza microarray pentru detectia proteinelor
recunoscute de un anticorp secundar marcat cu
fosfataza alcalina/peroxidaza
Substrat chemi - oxidarea enzimatica a substratului
(luminol) produce o emisie prelungita de lumina, captata
de o camera CCD
Desi foarte sensibila, chemiluminescenta prezinta un
interval dinamic limitat
Marcare prin radioactivitate
Realizata prin intermediul unor izotopi precum 32P sau
3H, incorporati in proteina;
Varianta cu 125I sub forma de specii de triiodotironina;

Detectia semnalului se face prin autoradiografie si
cuantificare cu un densitometru;
Traditional, una dintre cele mai sensibile proceduri de
marcare;
Limitari datorate normelor de siguranta, putin
compatibila ca metodologie pe scara larga.
Alte metode directe - in sfera nanotehnologiei
Progresie continua a tehnicilor de marcare
Quantum dots introduse cu succes in cercetarea clinica si
biochimica - abilitate de a se conjuga cu diverse biomolecule
(peptide, proteine, acizi nucleici si anticorpi);
Nanotuburi functionalizate (SWNTs) ca marker multicolor
pentru detectie autoanticorpi umani anti-proteinaza 3; antigenul
specific de prostata (PSA) imunodetectie in ser si lizat tisular, cu
poli-marcare pe baza de bioconjugate anticorp secundar
SWNT.
Protein microarray direct sau faza inversa
Nanotuburi in
detectia
protein
microarray
Srivastava S et al., 2008

QD in detectia protein microarray
Geho D et al., 2005
Cu marcare
Directa:
Fluorofori,
Cromofori,
Chemiluminiscenta,
Radioactivitate,
Alte metode directe
Indirecta
Sandwich
Fara marcare
Metode de detectie fara marcare
Spectrometrie de masa
Rezonanta plasmon de suprafata (SPR)
Rezonanta plasmon de suprafata cuplata in grilaj (GC-
SPR)
Microscopie de forta atomica (AFM)
Sisteme micro-electromecanice (MEMS)
Analiza microbalanta in cristal de cuart (QCM)
Nu interfera in structura si activitatea proteinei de
interes, determina cinetica reactiei in timp real!
Surface Plasmon Resonance (SPR)
Analiti
Flux proba
Captura
Val propagare plasmon
Strat metalic
Prisma
sticla
Raza
incidenta Raza
reflectata
Formate PMA si tehnici de detectie
Microarray analitic Microarray de faza Microarray functional

inversa
Metode cu marcare Metode fara marcare

Cum aducem detectia la suprafata?
Chip-ul este scanat cu un scanner adecvat;

Rezultatul scanarii este o imagine salvare imagine
array intr-un format conform soft-ului de analiza (tiff
files);
Fiecare kit de analiza este asociat cu un fisier cu o baza
de date despre proteinele/biomoleculele testate;
Informatia din fisier identificare tinte achizitionate
Scanner ArrayIt cu
computer si soft achizitie
imagine (Full Substrate
Spot Light)
Detaliere cuprins

Un strop de analiza a datelor
Instrumentul de analiza a datelor soft dedicat
Ce ar trebui sa ofere un program de analiza a datelor de
protein microarray?
Achizitie multiplexata a imaginii setari predefinite care
sa elimine necesitatea de scanare manuala a fiecarui
array din chip;
Algoritm de identificare spot fara trasare manuala a
zonei de interes; aliniere globala, translatie, rotatie a
spotului;
Metodologie multipla de scadere a semnalului bazal la
alegerea utilizatorului; obtinerea cuantificarii optime a
modificarilor biologice din array
Semnalizare automata spoturi/array interfata de design
parametri, utila de asemenea in standardizare control de
calitate in cadrul unui grup de utilizatori
Analiza multigrup grup de imagini achizitionate

prelucrate simultan automat: extragere valori numerice,
semnalizare spoturi, review rezultate pentru fiecare
calup imagini analizate
Instrumente de masurare
Ideal pentru controlul de
calitate si dezvoltarea de
metode cantitative: masurare
intensitate pe linii/coloane,
regiuni definite din array.
Normalizare
Corectie semnalul de marcare
(din etapa de detectie) cu
metode de normalizare prin
raportare lungimi de unda, fie
cu toti parametrii sau subset
de parametrii.
Rapoarte si inregistrari
sa includa modele de rapoarte de analiza ready-to-use, incluzand
control de calitate array, identificare parametrii de interes etc .
Rapoartele sa fie editabile, sa furnizeze tiparele pentru crearea si
customizarea fiecarui experiment in parte
Verificarea inter-laboratoare a datelor
Fisiere in formate care sa permita transmiterea si compararea
datelor obtinute, intre laboratoare similare; imaginile obtinute sa
satisfaca cerintele de publicare in jurnale de specialitate
Integrare sistem hardware
Intre scanner si programul de citire sa se realizeze achizitie si
analiza simultan, eliminand necesitatea de transfer date intre 2
programe diferite (au mare dreptate!)
Evaluare
fluorescenta spot
Mapix soft (Innopsys)
Date brute la analiza imaginii
Ce avem pana acum?
Un scurt istoric;
Cateva definitii cheie pentru tenologia
microarray;
O clasificare a tipurilor de tehnica;
Cum e suportul de reactie;
Ce metode de detectie exista pentru protein
microarray;
Stim etapele de lucru (sau nu)
Intrebarea care apare este .
Si la ce foloseste?
Ce aplicatii exista in prezent pentru protein
microarray?
Si intrebarea care ne bazaie in minte: cum e
cu diagnosticul?
Detaliere cuprins

APLICATII DE PROTEIN MICROARRAY
Formate PMA si aplicatii cu bune si rele!
Directii de aplicare protein microarray
Medicina personalizata
Descoperire de biomarkeri
Validare de biomarkeri*
Diagnostic in vitro
I. Medicina personalizata cu protein microarray
Identificare seturi de biomarkeri specifici maladiei si

combinare cu o tehnologie robusta de screening;
Clinicienii vor putea monitoriza pacientul inainte de
instituirea unei terapii excluderea efectelor potential
adverse si/sau determinarea dozei optime de medicatie;
Setul de date generate prin multiplexare, va putea fi
integrat in modele de diagnostic multivariate
imbunatatire sensibilitate si specificitate diagnostic
comparativ cu modelele de analiza bazate pe un singur
parametru!
Probe clinice
Ser/plasma Ser/plasma/ Lizat tisular/

lizat tisular celular
Protein
microarray in Array Array
proteine anticorpi RPPM
medicina fuziune
personalizata
flux de lucru, de
la proba
biologica la
Analiza datelor
monitorizarea
raspunsului la Autoanticorpi
Proteine biomarker candidat
biomarkeri
terapie candidati
Evaluare risc Terapie

Preventie Diagnostic Raspuns
II. Descoperirea de biomarkeri cu protein
microarray
Abordare bazata pe date experimentale

Abordare bazata pe cunostintele in domeniu
Biomarkeri de diagnostic
Biomarkeri de prognostic
Biomarkeri predictivi
Profilare cai de semnalizare
Abordare prin prisma sistemelor biologice
Abordare bazata pe date experimentale
The data-driven approach
Analiza extinsa a proteomului pentru identificarea corelatiilor dintre
concentratiile proteice si un stadiu particular al maladiei;
Protein microarray in format high-density identificare de
autoanticorpi specifici
PMA high-density pentru identificare seturi de autoanticorpi ce
recunosc 94 antigene din serul pacientilor cu cancer ovarian;
4 dintre antigene confirmate ulterior prin imunoblot/microarray de
tesut;
Focus pe lamina A/C si SSRP1: nivele mari in tesutul canceros
comparativ cu controlul;
Specificitatea si sensibilitatea diagnosticului imbunatatita prin
utilizarea combinata a laminei A/C si SSRP1 comparativ cu CA-
125 ca atare in identificarea cancerului ovarian.
Hudson ME et al, 2007

Evaluare raspuns imun fata de proteinele patogene
PMA continand 82 proteine purificate de la virusul
SARS si inca 5 virusuri inrudite monitorizarea
raspunsului imun al pacientilor infectati cu SARS
400 seruri de la un grup din Canada (epidemie); au
inclus cazurile confirmate cu SARS, pacienti cu
deficiente respiratorii si indivizi sanatosi
asimptomatici;
Analiza serurilor prin PMA a demonstrat o acuratete
de 91% privind infectia cu SARS (90% sensibilitate si
93% specificitate a diagnosticului)
Zhu H et al., 2006
The knowledge-driven approach
Punct ochit punct lovit: biomarkerii candidati,
relevanti pentru o patologie, sunt definiti in acord
cu datele stiintifice din domeniu
Biomarkeri de diagnostic
Biomarkeri de prognostic
Biomarkeri predictivi*
Biomarkeri de diagnostic - Diagnostic timpuriu in cancer:
sanse semnificative de supravietuire
Laura Spinney, Cancer: Caught in time, 2006, Nature 442, 736-738

Top biomarkeri moleculari:
1. DNA
2. RNA
3. Proteine
4. Metabolonica (molecule mici)
5. Carbohidrati (glicomica)
De ce proteinele pot fi candidati mai buni la titlul de

biomarker?
diversitate comparativ cu ADN sau ARN
structuri dinamice, reflexia fidela a fiziologiei celulare
Kirmiz, C. et al. 2007

Biomarkeri proteici in ser
Anderson, N.L. et al. Mol Cell Proteomics 3, 311-326 (2004)

Biomarkeri predictivi
Evaluare raspuns la
terapie la pacienti cu
artrita reumatoida;
Evidence Biochip Array
(Randox Laboratories)
masurarea 10 citokine
proinflamatoare si 2
citokine antiinflamatoare
evaluarea terapiei cu
etanercept;
Concentratii plasmatice crescute de MCP-1 si
EGF s-au asociat cu raspunsul la terapia cu
etanercept;
In plus, combinatia dintre proteina C reactiva si
EGF asigura o buna predictie a efectului
etanerceptului / 3 luni tratament (sensibilitate
87,5%; specificitate 75%).
Fabre S et al.. Clin Exp Immunol 2008;153:188 95.

RPPM si tehnologia de microdisectie cu laser analiza
sistematica a semnalizarii celulare la nivelul cancerului
de san si a leziunilor metastatice;
25 piese chirugicale testate pentru prezenta a 90 molecule de
semnalizare;
Definire subgrupe probe: tumori primare si leziuni metastatice
investigare proteine din cai de semnalizare specifice (EGFR,
AKT/mTOR, c-kit/abl sau ERK);
Profilare cai de semnalizare din compartimentele
epiteliale si stromale la carcinom de colon
Wulfkuhle JD et al. 2008;7:150817.

Abordare prin prisma sistemelor biologice
The systems biology-driven approach
Integrarea seturilor de date proteomice si genomice in
combinatie cu cunostintele biologice si tehnologii
computationale;
PMA furnizeaza seturi de date experimentale pentru:
Cuantificare seturi de parametrii din plasma si
combinare cu datele clinice (indicele de masa
corporala, tensiune arteriala etc)
Ex: Predictie supravietuire la pacienti aflati sub dializa
renala atunci cand markerii moleculari au fost
combinati cu variabilele clinice;
Permite prognoza individualizata si ofera clinicianului
suport in alegerea tratamentului pentru un pacient
personalizare!
Diagnostic in vitro
Produsi de diagnostic cu protein microarray

aprobati de FDA (USA) sau piata CE (Europa)
Diagnostic maladii autoimune (Zeus Scientific)
Alergii (VBC Genomics Bioscience Research)
Infectii virus Epstein Barr (Randox Evidence Biochip
Array)
Parteneriate in scop de diagnostic & dezvoltare de
noi medicamente
FDA Food and Drug Administration www.fda.gov
IMI Innovative Medicines Initiative www.imi.europa.eu
Detaliere cuprins

Din 40 de companii inregistrate ca domeniu de activitate

Proteomica in 2000, in 2002 -16 aveau ca domeniu de
aplicatie Protein Microarray-ul
2011 numai 5 companii au dezvoltat aceasta

tehnologie/echipamente
Arrayit (Sunnyvale, USA) infiintata in 1993 s-a dezvoltat in
diagnostic molecular, farmacologie, genetica, cercetare, si
aprilie 2011 microarray de proteine pentru screeningul
cancerului ovarian si detectia timpurie
Biacore (Uppsala, Sweden) Analiza interactiilor

Biomoleculare detectata prin rezonanta Surface Plasmon
Resonance (SPR) utilizare in imunodiagnostic, cercetare
biomedicala si descoperire de medicamente tehnica
publicata in 2002, in 2011 dezvoltata;
Biosite Diagnostics (San Diego, CA) Biochip de
proteine cu array de anticorpi si bazat pe tehnici
microfluidice diagnostic proteomic - initiata in 2004
si dezvoltata in 2011;
BioTraces Inc. (Herndon, VA) Multi Photon

Detection permite cuantificarea sub-zeptomol a
proteinelor - Diagnostic tehnica lansata in 2005,
abandonata in 2011;
Caliper/Agilent Technologies (Palo Alto, CA) - Lab-on-a-chip: chip
miniaturizat cu procesare incorporata asistata de calculator, analiza
performanta in secunde - amplificare DNA, analiza automata de acizi
nucleici, secventiere genom, proteomica - publicata in 2002,
. up-date
pentru genomica in 2011;
Ciphergen (San Diego, CA) ProteinChip pentru monitorizarea

expresiei proteice, rapid, sensibil ; noi biomarkeri, noi medicamente;
noi tinte terapeutice - l-au dezvoltat si ca chipuri si ca tehnologie;
GenoSpectra Inc. (Fremont, CA) Chipuri de proteine de inalta

densitate pentru testarea proteinelor denaturate sau a interactiilor cu
cinetici dificile medicamente noi si diagnostic molecular - au
dezvoltat tehnologia pe ramura de genomica in 2010.
.
NextGen Sciences (Cambridgeshire, UK) Biochip
multiproteic microfluidic tehnologie bazata pe
interactia proteina-proteina dezvoltata in special pe
cancerul de san;
Phylos Inc. (Lexington, MA) Chip Trinectin Proteome

selectia automata dintr-o platforma de baza de date
PROfusion - anticorpi de inalta afinitate pentru aplicatii
pe scara larga, de la studii clinice la medicamente noi si
tinte noi terapeutice.
Protiveris (Rockville, MD) micro and nanocantilever Chip
de proteine de densitate ridicata, detecteaza si cuantifica
proteine cunoscute si necunoscute; descoperire de
medicamente si diagnostic molecular;
Quantum Dot Corp. (Hayward, CA) QBEAD cu microsfere

marcate cu quantum dots amprente proteice dependente
de maladie si de terapie; expresie proteomica si genica
multiple brevete;
SomaLogic (Boulder, CO) PhotoSELEX; array cu aptameri;

detectie de zeci de mii de proteine simultan ; tehnologie
dezvoltata in Multiplex SOMAmer Assay platforma
specifica, sensibila, simultana, spectru larg de proteine
circulante;
Sa recapitulam
De fapt de ce avem nevoie?
3 Probe biologice
Curba de etalonare
4
5
Software
2 Scanner de microarray Analiza de date
Pacient Medic
1 Rezultate
Cum lucreaza casele
mari
Analiza prin microarray cu anticorpi
(analitic) a unor mediatori ai
inflamatiei eliberati in modele
celulare experimentale
configurarea kiturilor ExcelArray
Thermo Fisher Scientific
Despre ce kituri este vorba?
Antibody Sandwich Microarrays:
Thermo Scientific ExcelArray Inflammation I (Prod. No. 82002)
Thermo Scientific ExcelArray Inflammation II (Prod. No. 82003)
Thermo Scientific ExcelArray Angiogenesis (Prod. No. 82004)
Thermo Scientific ExcelArray Chemotaxis (Prod. No. 82006)

Journal of Biomolecular Techniques, Volume 18, issue 4, september 2007
Cum au gandit
Lame cu 16 subarray analiza 10 probe
cu o curba standard in 6 puncte;
Arhitectura array ELISA sandwich:
analit proteic prins intre Ac de captura fix
si un Ac de detectie biotinilat, detectie tip
streptavidina cu DyLight 649
Sensibilitatea metodei <10 pg/mL.
PBMC culturi primare
Linia celulara Jurkat model pentru
leucemie umana cu celule T
Linia celulara A549 model pentru cancer
plaman cu celule mici.
Stimuli pentru citokine/chemokine:
TNF
phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)
Phytohemagglutinin (PHA).
Cum au procedat?
1. Printarea suportului
Lame PATHplus Thin-film Nitrocellulose (GenTel
BioSciences, Madison WI);
Concentratia anticorp de captura titrata, pentru a
asigura semnal maxim in tamponul de printare;
Anticorpi de captura in triplicat 2 nL volum, diametru
spot 250 M;
16 subarray 2 coloane a cate 8 randuri;
Fiecare subarray C(-) si C(+) triplicat
Lamele blocate cu un tampon specific minimizare
adsorbtie nonspecifica, prezervare intensitate semnal,
mentinere stabilitate
Lamele blocate uscate si asamblate intr-un cadru

subimpartit in 16 zone, grila de silicon
Ansamblul etanseizat prin vacuum stabilitate prezervata

pentru anticorpii printati
2. Verificarea cross-reactivitatii
Anticorpii de captura
Anticorpii de detectie
Antigene standard (recombinate)
Fiecare subarray a fost testat cu un singur antigen
incubare, spalare I, incubare cu anticorpii biotinilati de
detectie, spalare II, incubare cu fluorofor legat la
streptavidina
Masurare intensitate semnal la fiecare cuplu Ac captura-
Ag
Concentratia 0 din curba control si pentru semnalul
generat de interactia nespecifica a Ac detectori (if any!)
Criteriu pentru cross-reactivitate acceptabila
Semnalul generat de interactia specifica cu tinta
cautata este interactia corecta.
Se accepta insa si o cross-reactivitate de max 5%
din semnalul generat din interactia corecta.
Sa nu calce stramb mai mult de 5% din

valoarea interactiei corecte!
3. Recuperare analit tinta from outside si sensibilitate
Cantitati cunoscute din fiecare analit sunt picurate in ser
uman si supernatanti de cultura celulara;
Probele sunt testate pe fiecare din cele 4 platforme de
microarray;
Se calculeaza % de analit recuperat/recunoscut
[(conc analit masurata contributie proba nula)/(concentratie analit
picurat)] x 100 = % Recuperare
Criteriu acceptabil de recuperare analit clandestin
trebuie sa fie > 80%!
Sensibilitate de dorit: < 10 pg/mL
4. Recunoasterea naturelului
In scopul validarii abilitatii platformelor de a recunoaste
tinte exprimate in mod natural!
PBMC umane izolate si stimulate astfel:
PHA (Inflam I, II, Angio, Chemotaxis)
ConA (Inflam I, II, Angio)
PMA sau ionomicin (Inflam II)
Fragment B al enterotoxinei stafilococice (Chemotaxie)
Supernatantii izolati si testati dupa 48 ore de cultura

Supernatanti recoltati de la PBMC nestimulate control
negativ
5. Modele celulare de testare cu linii standard
Linia celulara Jurkat - stimulate pentru eliberare citokine

cu PMA si PHA
Linia celulara A549 - stimulate pentru eliberare citokine

cu TNFa
Controale celulare negative
Supernatanti de cultura recoltati la 24-48 ore si testati pe

platformele mentionate
Analiza probelor cu platformele de ExcelArray
PBMC, linii celulare, probe picurate

Etape comune pe scurt
100 l standarde/probe aplicate in fiecare subarray/well

Incubare cu agitare 2 ore la RT
Spalare I cu tampon adecvat
Adaugare anticorpi de detectie biotinilati
Incubare cu agitare 1 ora la RT
Spalare II cu tampon adecvat
Adaugare fluorofor (DyLight 649) legat la streptavidina
Incubare cu agitare ora la RT
Spalare III si suplimentar cu tampon de clatire
Achizitie imagine, densitometrie spoturi, import in program Excel
pentru calcul sensibilitate, coeficienti de variatie
Rezultate si discutii
Alternativa viabila la traditionala ELISA - microarray trebuie sa
atinga standardul de performanta stabilit anterior adaugand
multiplexare!
1. Cross-reactivitatea: minima, pentru evitarea rezultatelor fals-
pozitive (interactii nespecifice cu tinte neintentionate); omologia
analitului conteaza perechea de Ac care genereaza cel mai
ridicat nivel de cross-reactivitate recunoaste membri din aceeasi
familie proteica: MIP-1a si MIP-1b; MCP-1 si MCP-3.
2. Recuperare: experimentul demostreaza abilitatea imunometodei
de a recunoaste analiti indiferent de tipul si conjunctura probei
3. Sensibilitatea detectiei: de ce? Pas important in stabilirea
conditiilor in care o metoda poate fi utilizata; dicteaza limita
inferioara a concentratie de analit care poate fi determinata cert
4. Recunoasterea naturelului: detectia proteinelor exprimate in
mod natural comparativ cu proteinele recombinate. Important de
verificat pentru ca proteinele recombinate etaleaza adesea diferit
determinantii antigenici (epitopi) comparativ cu proteinele produse
natural (secretate in mediul de cultura)!
5. Modele cu linii standard Jurkat si A549 stimulate pentru secretia
de citokine. A549 stimulate cu TNFa secreta in grad ridicat 12 din
cele 41tinte analizate comparativ cu celulele nestimulate. Scadere
pentru secretia de angiogenina in urma stimularii cu TNFa. Datele
obtinute cu platformele ExcelArray au fost in concordanta cu datele
din literatura
Performanta in platformele ExcelArray

Imagini pentru kitul de Chemotaxie
(A) supernatanti de celule A549 nestimulate
(B) supernatanti de celule A549 stimulate cu TNF

Cuprins
Notiuni de imunodetectie, ELISA in dezvoltarea
testarii tip array
Aparatur utilizat
cercetare la diagnosticul de laborator
Avantajele si dezavantajele tehnologiei
Daca nu ne plac array-urile
comerciale?
Incercam sa le facem singuri ...
Cum lucreaza
temerarii
Aplicatii in afara de concurs
Protein microarray for the analysis of human

melanoma biomarkers
Patrick Domnanich, Ursula Sauer, Johanna Pultar,
Claudia Preininger
Austrian Research Centers GmbHARC, Department of Bioresources,
2444 Seibersdorf, Austria
Sensors and Actuators B 139 (2009) 28
Customizarea chip-ului
Dezvoltarea unei platforme de microarray pentru
testarea paralela a 5 markeri serici in melanom: S100B,
VEGF-A, CRP, IL-6 si IL-10.
Ca si suport solid - ARChip Epoxy (sticla derivatizata)
pentru imobilizarea covalenta a anticorpilor cu un printer
de contact.
Detectie fluorescenta
Immunometoda de tip sandwich cu sistem streptavidina-
biotina si detectie fluorescenta.
Optimizare protocol
CRP ca model de optimizare marker a sistemului iccp
tamponul de printare, concentratia de antigen (1 mg/mL),
tampon de legare si timp de incubare (120 min).
Reproductibilitate inalta (CV < 20%), reactivitate
incrucisata scazuta (<0.5% la IL-10) si limita scazuta de
detectie LOD (1.88104 mg/L).
Curbe standard cu acuratete adecvata (R2 0.966).
Sensibilitatile sunt comparabile cu ELISA iar intervalele
de detectie permit discriminarea intre normal si markerii
crescuti in melanom
Materiale si metode
1. Materiale necesare - ARChips Epoxy, tampoane,

derivatizanti pentru sticla, anticorpi de captura, de
detectie biotinilati, proteina ca atare
2. Fabricare chip si blocare situsuri nereactive
3. Procesare chip (reactiile propriu-zise)
4. Detectia fluorescenta
5. Analiza datelor si modelare curbe de calibrare
Rezultate
Optimizarea protocolului de fabricare a chip-ului
Tamponul de printare PBS like, pH; detergenti in tampon sa nu
perturbe interactia Ag Ac si intensitatea semnalului;
Au ales PBS/CHAPS/BSA si PBS/sodium deoxycholate (semnal fluo
bun, legare optima)
Concentratia anticorpului
Timpul de incubare cu antigenul (30, 60, 120 min)
Curbele de etalonare biomarkerii pot fi testati in ser
nediluat;
Fabricarea (customize) a unui chip proteic de biomarkeri ca

instrument in detectia melanomului si monitorizare
terapie.
Aplicatii
custom
carcinom
scuamos de
cap si gat
Fig. 1 Schema
experimentala
LCM si flux de
lucru microarray
de anticorpi.
Facem singuri array, daca stim
reteta!
Daca am avea oua, am face o omleta cu

sunca daca am avea sunca....
Inscriptor de microarray
Microarray Spotter PersonalArrayer 16 (CapitalBio)
Fluorescent NanoArray Instrument System (NanoInk, Inc )
VERSA Mini Workstation (Aurora Biomed) Microarray Spotter
Instrument automatizat, rapid, economie reactivi pentru realizarea

lamelor specifice
Applicatii
Diagnostic personalizat pe tip de boala, terapie etc/ identificare
biomarkeri proteomici
Posibilitatea cuplarii si cu analize genomice
o Capacitate inscriptioneaza simultan 16 lame
o Software pentru adaugarea automata de reactivi
o Cod de bare proba pacient
o Conectare la hota sterila HEPA/UV pentru protectia lamelor si a
personalului
Schleicher & Schuell BioScience GmbH
Randox Laboratories Ltd
Protein microarray-er
Evidence analyser platforma complet
automata, rapida, probe pe scara larga pentru o
clinica cu flux mare de pacienti; diagnostic.
Evidence Investigator - platforma semi-
automata, nr. probe scara medie; cercetare.
Evidence MultiStat lansat in 2011, analizor
rapid cu rezultate in 20 minute; aplicatie
punctuala
Software
VERSA Mini's ArrayVision
Utilizatorul selecteaza si salveaza un nr. nelimitat de
protocoale
Informatiile pacientilor se pot introduce direct utilizand
scannerul de coduri de bare.
Export de date la alta platforma sau baza de date
Instructiuni Step-by-step de la incarcarea probelor,
lamelor, reactivilor pana la manevrarea instrumentului
Lista de sarcini acesibila in orice etapa a procesului
Posibilitate de curbe standard incorporate
Mapix, GenePix, Invitrogen
Lame de protein microarray
Whatman* FAST* Protein Microarray Slides
Lame adaptabile oricarei tip de protein-microarray

Domeniu de preturi FAST SLIDE 2 10/PK 587 $ - FAST
SLIDES 20X60MM UC 20/PK 1138$
Nexterion-Protein Microarray Slides
Format standard sau multiwell, afinitate de imbracare

standard sau aditionate cu un strat reflectiv dielectric
(Nexterion HiSens slides).
Randox Laboratories Ltd
Biochip Kits
Aplicatii
determinare Citokine
toxicologie medicamentoasa
biomarkeri pentru Cardiologie
biomarkeri pentru boli Cerebrale
determinare molecule de Adeziune
determinare hormoni tiroidieni
determinare markeri fertilitate
Profil Lipidic - trigliceride, colesterol total, Trigliceride, HDL si
LDL colesterol, Apolipoproteine A-I, A-II, B, C-II, C- III si E,
Lipoprotein (a)
Chip-uri
FAST Quant Human Cytokines determina

citokine simultan, in triplicate, utilizand 64 de
anticorpi monoclonali cu afinitati specifice;
Curba standard din antigen recombinant
standard;
FAST Quant Human Angiogenesis determina
Angiogenin, Angiopoietin-2, PDGF-BB, VEGF,
FGF-b, KGF, TIMP-1, ICAM-1
Chip-uri
S&S Serum Biomarker Chip Profil proteic

din ser, determina atat proteine aflate in urme
cat si proteine abundente
Probe pe scara larga stratificarea pacientilor
pe grupe de risc, prognostic, recurenta,
eficacitate medicamente, predictie de efecte
secundare, monitorizare terapie
Un chip contine 120 de anticorpi anti-proteine
umane srice specifice de tipul de cancer
Noutati ArrayIt (USA)
PlasmaScan 380
Antibody Microarrays,
instrument de descoperire
proteom uman din plasma;
mAB anti-proteine native
plasma umana;
Format lama de sticla
standard 25 x 76 mm;
6 microarray per substrat;
identificare biomarkeri
serici pentru cancer ovarian,
prostata, maladia Parkinson,
cancer pancreas.
Imagine obtinuta cu PlasmaScan380
Microarray de tip PlasmaScan sunt detectate ca si fisiere tiff 16-Bit

utilizare scanner Innoscan 710 sau alt scanner standard de
fluorescenta pentru microarray
Genetix Ltd
Imagistica
Applied Imaging Ariol
Analizor imagistic pe scara larga, automatizat,

cuantifica lame de microarray de la clinica la cercetare
Domenii: proteomica, genomica, farmaceutica
Adaptabila scanarii in lumina directa sau fluorescenta
In SUA aprobata de FDA pentru clinica: diagnostic in
vitro in analizele HER-2/neu
PathVysion si detectia de micrometastaze in maduva
spinarii
Baze de date
The Human Proteome Atlas
http://www.proteinatlas.org
Mol Cell Proteomics 2008 (10):2019-27.
Expresia proteica a 10118 gene realizata utilizand 13154

tipuri de anticorpi
Utilizatorul gaseste expresia proteica in legatura cu
tesuturi umane normale, tumorale si linii celulare
Localizarea subcelulara
Nivelele de expresie ale transcriptului.
Baze de date
Human Disease Interactome
Platforma de vizualizare si integrare a
informatiei pentru interactiile inter-proteice
asociate maladiilor, si aflata in legatura cu
baza de date a proteomului uman;
Utilizatorul gaseste secventa proteica si i
se prezinta posibilitatile de interactie
proteina-proteina si scorul de legatura al
proteinei cu o anumita boala.
Site-uri importante
The Human Proteome Organization (www.hupo.org)
Ensembl database (www.ensembl.org)
The UniProt Knowledgebase (www.uniprot.org)
CPTC (antibodies.cancer.gov) (antigens.anl.gov).

AbFrontier participates in the Human Protein Atlas Project as
an antibody partner (www.abfrontier.com)
Epitomics, Inc. participates in the Human Protein Atlas Project
as an antibody partner. (www.epitomics.com)
Sa ne imaginam cum am aborda un protocol
Protocol calitativ
Descriere kit
Panorama Antibody Microarray - Cell Signaling Kit Kitul
contine 224 anticorpi printati in duplicat pe lame de sticla
tratate cu nitroceluloza.
Acesti anticorpi sunt anti-molecule din cai biologice
asociate apoptozei, ciclul celular; neurobiologie;
citoschelet; proteine nucleare.
Expresia unei proteine dintr-un extract celular este
detectata cand aceasta se leaga la anticorpul
corespunzator fixat pe lama.
Cum e configurata o lama?
ASB
marcata
ASB nemarcata
Legarea este vizualizata printr-un semnal fluorescent
generat de marcarea directa a proteinelor din extract cu
un colorant fluorescent.
Array-ul poate fi utilizat pentru compararea profilului de
expresie proteica din doua probe diferite (test versus
referinta).
Fiecare proba este marcata cu un colorant diferit CyTM
(CyTM3 sau CyTM5) iar cele doua probe aduse la
concentratie proteica egala, sunt aplicate simultan pe
array.
Intensitatea semnalului fluorescent a fiecarei probe
(control si test) este inregistrata individual la lungimea de
unda corespunzatoare colorantului de marcare, si apoi
comparate.
Ce ofera kitul
profilare proteica robusta si sensibila in zi
anticorpi imprimati in densitate mare
kitul nu este specie specific, anticorpi printati recunosc
proteine umane, de la soarece si de la sobolan
rezultatele sunt calitative si necesita cuantificare cu alte
metode precum imunobloting sau ELISA
lamele sunt sensibile, nu se atinge suprafata, se poarta
manusi latex-free
lamele se utilizeaza o singura data
La ce sa fim atenti
1. Componente kit
2. Materiale necesare dar procurate de utilizator!
3. Preparare reactivi/solutii de lucru
4. Protocol
Pregatirea probei biologice
Extractie proteine din linii celulare sau tesuturi; ser,
plasma
Celule aderente
Se cresc celulele la confluenta 70-80%, se spala celulele cu PBS
0.01 M, pH 7.4 si un tampon special din Kit; se incubeaza pe
gheata, se desprind si se colecteaza celulele intr-un tub de
microcentrifuga, se centrifugheaza proba la rotatie mare (10000 g)
si se transfera supernatantul intr-un tub nou.
Celule in suspensie
Se cresc celulele in cultura; se colecteaza 107 celule, se spala
celulele cu PBS, apoi cu un tampon special din kit, se incubeaza pe
gheata, se centrifugheaza proba la rotatie mare (10000 g) si se
transfera supernatantul intr-un tub nou
Tesuturi
Se scoate tesutul rapid, se cantareste si inregistreaza greutatea, se
taie in piese mici, se transfera piesele de tesut in tampon special din
kit (0.5g tesut in 2.5 ml); se omogenizeaza tesutul pe gheata cu un
omogenizator, centrifugare la rotatie mare (10 000 g).
Etapa comuna - Se determina concentratia proteica din supernatant
prin metoda Bradford; se dilueaza proba la concentratia de lucru
(1mg/ml) in tampon special din kit. Se utilizeaza 1 ml de extract
(1mg/ml) pentru marcare cu fluorofori (Cy3 sau Cy5).
Probe de ser sau plasma
Se depleteaza proteinele abundente din proba, se aduce proba la
volumul initial (pe lama de array probele se lucreaza in volume
egale) .
Marcare cu probe cu fluorofor
marcarea cu Cy3 sau Cy5 (proba de referinta, proba test), se
determina concentratia proteica cu Bradford post-marcare!
Proteina marcata se pastreaza la 2-8oC, sau se ingheata daca nu se
poate prelucra in continuare
Determinarea raportului molar colorant/proteina (D/P) (> 2)
Incubarea probei pe lama (array)
Mix din probele marcate cu Cy3 si Cy5 la concentratii proteice egale
cu tampon incubare special din kit
Aplicarea pe lama (cu Ac spotati)
Incubare cu agitare pe shaker
Spalare, uscare lama! (se recomanda uscarea in aer
liber, ferit de lumina)
Scanarea lamei (de preferinta imediat, maxim 24-48 ore
de la procesare):
achizitia imaginii,
procesarea imaginii,
obtinerea datelor brute, prelucrarea datelor
validare prin WB, ELISA
Cazul 1 (Cy3) Cazul 2 (Cy5)
Ce imagine
ar trebui sa
obtinem
1 Pregatire
Alegere
lama
suport/liganzi/
(chip)
metoda
2
Incubare
cu proba 3
Detectie fara
marcare (MS,
SPR)
Legare
reactanti
Detectie cu 4
marcare 5
Schema generala experiment tipic de protein microarray

Cretich M et al., Biomolecular Eng., 2006
POVESTEA NU SE TERMINA
AICI .
(dar puteti sa ne spuneti unde, ca deja

nu mai rezistam !!!)
Protein-microarray-ul are o istorie
activa
Chip-urile si array-urile - suprafete plane

Integritatea biologica a determinat
necesitatea aparitiei microarray 3D
Solutia: micro-mediul lichid
Solutia a fost dezvoltarea gelurilor 3D
Polietilenglicol (PEG), poliacrilamida, poli

(vinil alcool) (PVA), poliuretan, dextran
carboximetilat, agaroza
sau structuri supramoleculare de hidrogel
compuse din amino acetat glicozilat
Structuri: godeuri sau canale
three-dimensional
binding substrate for
proteins
Growing pains
Protein microarrays are coming of age, and the development of specialized
technologies is extending their high-throughput capabilities
NATURE|Vol 486|14 December 2010
Microarray 3D
Natura chimica a gelului o selectie mai buna a
posibilitatilor de activarea/imobilizare ligand
Densitatea mai ridicata a situsurilor de imobilizare
Prietenos biologicului
Aplicabil testarilor biomedicale de finete proteine
delicate accommodate de porii hidrofili ai gelului
Sensibilitate crescuta comparativ cu suprafatele
plane
http://www.expert-reviews.com
Some painters transform the sun
into a yellow spot; other
transform a yellow spot into the
sun - Pablo Picasso
Lectiile invatate:
In primul rand, sa nu ne
pierdem firea, exista solutii
pentru orice!
Protein microarray sa-l identificam ca detaliu in

tabloul proteomic al secolului XXI;
Intelegerea conceptelor de baza in tehnologia protein
microarray;
Ce aplicatii practice curente de protein microarray
exista;
Confort in alegerea unei aplicatii pentru domeniul de
interes;
Poate e atractiva tehnologia, dar cum se poate
implementa?
http://www.youtube.com/watch?v=VmTStd
tykOs&feature=player_detailpage
http://www.youtube.com/watch?v=Kp1AjDr
cQXE&feature=plcp&context=C3db5571U
DOEgsToPDskIV9JL0tw5GpmnL7RMClx0
C
Protein Microarray pentru
specialisti
. Drumul abia acum incepe!

Va multumim ca ati ales Protein Microarray
Company si va uram zbor Proteomic placut!

Protein Microarray

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Protein Microarray

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Fondul Social European Investete n OAMENI!

You have to know the past to understand the present.

"Study the past if you would define the future...."

I-131 (radiatii gama si beta)

Leif Wide si Jerker Porath au fixat Ag sau Ac

Independent de ei Stratis Avrameas si G.B. Pierce au reusit

ELISA sandwich sau directa

Faza solida este un stick de polistiren cu 8-12

Site Number of Biomarkers

Validation of saliva-based assay for oral

The Early Detection Research Network, NIH

1995 Schena publica detectia a mii de mRNA-uri ca

Chip-ul pentru proteine

ELISA e prea prafuita?

Trebuie sa gatim altfel?

Viitorul exuberant creat de

CSIII Dr. Carolina Constantin Expert termen lung

Tehnica microarray in contextul omicii

Multiplexare: numar crescut de probe, numar crescut

Analiza a mii de proteine din domenii cheie (ex.,

Cu o prietenie statornica a tehnicii ELISA!

Schema generala experiment tipic de protein microarray

Tehnica microarray in contextul omicii

B. In functie de parametrul determinat:

Analitic molecule de anticorpi (AMA)*

De faza inversa lizat celular integral sau fractionat (RPPM)

RPMM = Reverse phase protein microarray

Faza directa standard, analitic, lectinic

Faza inversa lizat celular

PMA AMA RPPM

Tipuri de protein microarray in functie de structura

Hultschig C et al., Curr Op Chem Biol 2006

Diferentiere tip de cancer pe baza abundentei proteice

+ Screening rapid probe numeroase

- Reactivitate incrucisata rezultate false

LaBaer J et al., Curr Op Chem Biol, 2005

Cu Pro si Contra format aplicat cu succes in biomedicina

Consecinta unor provocari continue:

NAPPA Nucleic Acids Programmable Protein

Protein in situ arrays (PISA) expresie in situ a proteinelor de interes

Limitare fixarea pe suprafata array a unui agent de imobilizare, capabil sa

Post translatie, proteinele sunt atasate specific de array sinteza la locul

Hibridul ARNm este imobilizat pe suprafata cu streptavidina si translatia proteica in situ

Puromicina atasata la ADN capteaza si imobilizeaza proteina noua pe suprafata array-

Tao S-C, Zhu H (2006) Nat Biotechnol, 24:12531254

O dorinta arzatoare 2 in 1 a tehnologiei pe chip: conversia ADN array la

Plasmide biotinilate care codifica pentru proteine de fuziune GST sunt

Sistemul este incubat cu un extract celular pentru expresia proteinei de

1. Evaluare imunitate in maladii autoimune

Anderson KS, (2011). J Proteome Res 10:8596

4988 antigene proteice

761 antigene selectate Pre-screening de

Ramirez AB, et al (2010), Mol Cell Proteomics, 9:14491460

Ce aduce nou tehnologia microarray?

Suportul solid, plan, pentru reactia antigen anticorp

Echipament disponibil (printere robotizate, scanner) adaptat din

1. Furnizarea unei capacitati optime de legare a

Mecanisme uzuale de atasare a biomoleculelor la suport

Interactii hidrofobe (nitroceluloza sau membrane

Dezavantaje adsorbtie de suprafata

Grupari functionale introduse pe suport prin modificarea

Inglobarea proteinei intr-un matrix special gel de poliacrilamida

Hall DA et al., Mech. Ageing Dev, 2007

Ce aduce nou tehnologia microarray?