LP5. Tehnici de evaluare structural i funcional a celulelor si organitelor celulare.

Metode de analiz a acizilor nucleici. Principii

Termenul de ADN recombinant se refer la combinaiile noi de ADN, obinute ntre

anumite secvene de ADN uman (sau de la alte organisme) i molecule de ADN bacterian (sau
de la alte specii), capabile s se replice indefinit (formnd clone moleculare) sau s exprime,
ntr-o celul gazd, informaia genetic pe care o conin.
Tehnicile de ADN recombinant au inaugurat era ingineriei moleculare devenind posibil
trecerea de la observarea proceselor genetice la manipulare genic. Au fost nregistrate
succese remarcabile n descifrarea structurii i funciei genelor cu aplicaii n medicin
(diagnosticul i tratamentul unor maladii), industria farmaceutic (obinerea unor proteine
terapeutice i noi vaccinuri), agricultur i zootehnie (utilizarea unor biotehnologii n
ameliorarea plantelor i animalelor).
Tehnicile ADN recombinant se pot grupa n dou mari categorii:
A. Clonarea ADN sau amplificarea selectiv a unei gene/secvene de ADN, bazat n esen
pe mai multe runde de replicare a ADN care vor produce un numr mare de copii ale
fragmentului respectiv:
a) celular, in vivo, cnd se folosete mecanismul natural al replicrii ADN.
Implic patru etape majore:
I. formarea ADN recombinant prin ataarea in vitro a fragmentelor de ADN uman la un
vector sau replicon capabil de replicare independent;
II. transformarea: transferarea moleculelor n celule-gazd n care vectorul recombinant se
replic independent de cromozomul celulei gazd;
III. Amplificarea sau producerea de clone celulare multiple;
IV. Izolarea clonelor de ADN recombinant prin oprirea culturilor i izolarea selectiv a ADN
recombinant.
b) acelular, in vitro, bazat pe reacia de polimerizare n lan (PCR);
Cu aceast metod se poate amplifica selectiv o secven scurt de ADN sau ARN a crei
structur nucleotidic este parial cunoscut. Amplificarea este considerabil (de miliarde de
ori) i rapid (cteva ore), permind obinerea unei cantiti suficiente de material genetic
necesar pentru analiz. Amplificarea selectiv in vitro se bazeaz pe principiul extensiei unei
amorse ce declaneaz sinteza ADN dup matria fragmentului ADN iniial (de amplificat).

1
Avantajele clonrii acelulare a ADN prin PCR sunt determinate n primul rnd de simplitatea
sa (nu necesit nici o alt manipulare n afara variaiilor termice necesare diferitelor etape ale
reaciei, pretndu-se astfel la automatizare) i rapiditatea cu care se obine multiplicarea
secvenelor de interes. Prin acest tip de clonare, plecnd de la o cantitate infim de ADN
(chiar de la o singur celul) se poate obine, prin PCR, o cantitate suficient de ADN int
care poate fi vizualizat prin fluorescen n UV (dup o colorare cu bromur de etidium)
i/sau analizat direct.
B. Analiza sau detecia specific a unei secvene de ADN sau ARN
B1. Hibridizarea molecular (prin complementaritate) cu o sond de acid nucleic
marcat. Metodele se bazeaz pe capacitatea unor molecule monocatenare de acid nucleic de
a forma, pe baz de complementaritate, molecule bicatenare. Tehnicile standard folosesc o
sond monocatenar de acid nucleic (cu o structur cunoscut), pentru a identifica o structur
similar ntr-un amestec complex i heterogen de molecule de acid nucleic int (de obicei
imobilizat pe un suport solid). Sonda este marcat cu un trasor radioactiv sau cu un compus
florescent. Marcarea permite detectarea secvenei/genei ce posed o secven omoloag
sondei folosite.
a) Analiza ADN genomic prin metoda de transfer Southern.
Obiectivul principal al metodei este de a evidenia, cu ajutorul unei sonde specifice, prezena
sau absena unui fragment de ADN omolog (int), obinut din ADN genomic, cu o anumit
enzim de restricie. Pentru aceasta, ADN extras din nucleii celulari este digerat cu una sau
mai multe enzime de restricie, fragmentele separate dup marime prin electroforez n gel de
agaroz, denaturate i apoi transferate (prin sugere/blotting) i imobilizate pe o membran
solid de nitroceluloz pentru a fi hibridizate cu o sond monocatenar specific, marcat
radioactiv. Sonda se va fixa numai pe secvena omoloag de ADN (dac este prezent) iar
poziia sa pe membran va permite evaluarea mrimii sale;

b) Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice unei alele (ASO)

Metoda folosete sonde ce corespund unei secvene mici (20pb) din structura genei, permind
depistarea unor mutaii specifice, cunoscute deja ntr-o anumit boal genetic.

c) Analiza ARN mesager prin Northern blot

Obiectivul principal al metodei este obinerea de informaii privind profilurile de expresie
(tipul celular, abundena transcriptului) a unei gene deja clonat. Punerea n eviden a unui

2
anumit ARNm se bazeaz pe hibridizarea molecular a ARN cu o sond complementar
monocatenar.

d) Hibridizarea in situ a ADN/ARN

- pe preparate cromozomice n pro-metafaz folosind sonde marcate (radioactiv sau
molecule fluorescente - FISH) alese n funcie de obiectivul urmrit;
- pe seciuni histologice pentru evidenierea unui anumit ARNm folosind ribosonde
marcate;

e) Identificarea ADN/ARN al organismelor exogene

Permite depistarea oricrei infectri sau infestri printr-un microorganism bacterian, viral,
fungic sau parazitar prin folosirea unor sonde corespunztoare genomului acelui organism.

B2. Analiza secvenei nucleotidelor din ADN secvenierea ADN

Dup izolarea i amplificarea unui fragment ADN principala etap de analiz genotipic este
determinarea secvenei nucleotidice, deci a informaiei genetice a fragmentului respectiv.
Aceast aciune poate stabili structura genei precum i a secvenei de aminoacizi a proteinei
codificat de gen. Metodele de secveniere sunt:
- tehnica de degradare chimic descoperit de Walter Gilbert;
- tehnica de sintez enzimatic elaborat de Fred Sanger;