LABORATOR NR.

3 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

CONDUITA (ETAPELE) EXAMENULUI MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR

Pentru determinarea calităţii microbiologice a alimentelor , se parcurg următoarele etape

I Recoltarea, transportul şi conservarea probelor;
II Examenul microscopic direct al probelor prelevate.
III Examenul bacteriologic şi micologic propriu-zis prin determinarea prezenţei şi numărului unor
bacterii-indicatori microbiologici de salubritate a alimentelor şi a germenilor patogeni.
Rezultatele obţinute se consemnează în registrele de diagnostic ale laboratorului pe baza cărora se
întocmesc buletinele de analiză.

I Prelevarea (recoltarea), transportul şi conservarea probelor de

alimente;
Noţiuni introductive

Prin noţiunea de probă se înţelege orice produs sau material destinat examenului microbiologic.
Procedura de prelevare presupune alegerea unei probe (sau a mai multor probe) dintr-un lot, inspecţia
şi analiza probelor şi clasificarea lotului ca fiind „acceptabil sau „inacceptabil” pe baza rezultatelor inspecţiei
sau analizei probelor (http://www.ansvsa.ro/documente/admin/PS-
01DGSA%20+%20anexa%201+%20formular%20eticheta%20proba_15100ro.pdf).
Prelevarea oficială a probelor se desfăşoară în cadrul controlului oficial privind siguranţa alimentelor de către
inspectorii ANSVSA (Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentului) din cadrul
Serviciilor/Compartimentelor de Siguranţa Alimentelor aparţinând DSVSA (Direcţia Sanitară Veterinară şi
pentru Siguranţa Alimentelor) judeţene şi a municipiului Bucureşti.
Prelevarea pentru testarea microbiologică poate fi realizată pentru:

- verificarea conformităţii cu criteriile stabilite în Regulamentul (CE) nr. 2073/2005;

- verificarea siguranţei microbiologice a alimentelor pentru care nu sunt stabilite criterii
microbiologice la nivel comunitar;
- obţinerea de informaţii generale despre starea microbiologica a anumitor produse puse pe piaţă;
- monitorizarea atentă a unuia sau mai multor operatori din domeniul alimentar prin verificarea
implementării procedurilor bazate pe principiile HACCP şi/sau sistemul lor de management al
siguranţei alimentelor;
- investigarea apariţiei unor toxiinfecţii alimentare suspecte;
- pentru soluţionarea reclamaţiilor şi sesizărilor;
- identificarea şi obţinerea de informaţii cu privire la pericole microbiologice emergente (noi), generând date
pentru analiza şi evaluarea riscului.

Anterior desfăşurării activităţii de prelevare oficială a probelor în vederea testării lor

microbiologice, inspectorul are în vedere asigurarea următoarelor dotări necesare:

- documentele necesare: Procesul verbal de prelevare, Cererea de analiză, Eticheta probei;

- echipamentul individual de protecţie;
- echipamentele şi instrumentele sterile pentru prelevare;
- recipiente sterile pentru prelevare şi transportul probelor;
- echipamente de măsură şi control – termometru verificat metrologic;
- lăzi frigorifice - ambalaje pentru transportul probelor, care să asigure temperatura de conservare a
1
 LABORATOR NR. 3 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

acestora până la laboratorul de destinaţie, precum şi condiţii de transport pentru ca proba să nu fie
deteriorată, sigiliul să rămână intact.
Prelevarea probelor în cadrul controlului oficial se face în mod obligatoriu de catre inspectorul
oficial (ANSVSA), în prezenţa operatorului sau a unui reprezentant legal al acestuia (un martor).

Indiferent de natura probelor sau de tipul examenului solicitat recoltarea se efectuează după
următoarele reguli:

- Proba trebuie să fie reprezentativă, să păstreze caracteristicile lotului din care a fost prelevată;
- este indicat să se recolteze cel puţin 100 g/probă;
- instrumentele de lucru reprezentate de linguri, pense, spatule, foarfece din oţel inoxidabil, etc., se
sterilizează prin autoclavare (este periculoasă sterilizarea prin imersie în alcool sau la flacără);
- pentru probele lichide se pot utiliza recipienţi ca: borcane de plastic, căni de metal etanşe, etc. (se
evită folosirea recipientilor de sticlă); probele solide se recoltează în cutii, saci, sticle de plastic sau pachete
sterile;
- după prelevare, fiecare probă se indentifică unic prin etichetare şi se ambalează separat, în
recipiente curate şi intacte, care să confere protecţie adecvată împotriva contaminării externe şi deteriorării
probei în timpul transportului şi să aibă facilitatea de închidere etanşă şi de redeschidere uşoară ,rezistenţă
la şocuri mecanice sau alte deteriorări intenţionate sau accidentale
- . ulterior, probele se sigilează în aşa fel încât deschiderile neautorizate sa fie detectabile (pentru a
nu fi posibilă substituirea produsului sau contaminarea lui).Numărul sigiliului aplicat va fi menţionat în
Procesul verbal de prelevare.
- probele sunt însoţite de un Procesul verbal de prelevare în care se specifică ora şi data recoltării,
precum şi a primirii acestora în laborator;
- trimiterea probelor la laborator trebuie să se facă cât mai rapid, în primele 24 ore de la recoltare,
respectând cât mai mult posibil condiţiile de păstrare originale:
- probele refrigerate se transportă în gheaţă la 2-4 °C ;
- alimentele congelate, trebuie păstrate congelate;
- alimentele proaspete foarte perisabile trebuie păstrate reci , evitatându-se temperaturile
de congelare în timpul transportului şi depozitării;
- alimentele preambalate trebuie să fie depozitate la sau sub temperatura de depozitare
indicată pe eticheta produsului;
- în lipsa unor menţiuni pe eticheta produsului privind condiţiile de transport şi păstrare se
recomandă menţinerea în regim de refrigerare(2-4ºC);
-
Recoltarea probelor de carne:
 carnea în carcase şi semicarcase: se recoltează două cuburi de carne şi grăsime, unul de la suprafaţă şi
altul din profunzime, cu latura de minimum 8-10 cm şi un os lung;
 organele: se recoltează întregi sau porţiuni din acestea în pungi sau recipienţi sterili în cantitate de
minim 200 g;
 carnea preambalată, carnea de pasăre, specialităţi de pasăre: se recoltează 1% din numărul pachetelor
care alcătuiesc lotul, însă nu mai puţin de 5 pachete;
 carnea de lucru (din întreprinderile producătoare): se recoltează o probă de 500-1000 g din fiecare
lot dacă acestea sunt uniforme în privinţa caracterelor organoleptice; în caz contrar lotul se împarte
în 3 subloturi:
o cu caractere organoleptice normale;
2
 LABORATOR NR. 3 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

o cu uşoare modificări organoleptice;

o cu caractere organoleptice evident modificate.
o Din fiecare sublot se recoltează o probă de 500-1000 g.
 carnea tocată: se recoltează 200-300 g din fiecare ambalaj în proporţie de 1% din numărul acestora
(nu mai puţin de 2 şi nu mai mult de 5 ambalaje);
 preparate din carne: batoanele sau calupurile recoltate se secţionează longitudinal realizându-se
examenul organoleptic; cele două jumătăţi constituie proba şi contraproba; dintr-una din jumătăţi se
recoltează (de la mijloc şi de la capete) 300-800 g şi se trimit la laborator;

Recoltarea probelor de conserve: se face în funcţie de mărimea lotului astfel:

Mărimea lotului Numărul de recipienţi recoltaţi

Până la 1.000 2
1.001-5.000 5
5.001-10.000 10
10.001-50.000 20
50.001-150.000 30

Recoltarea semiconservelor: se recoltează pe loturi în funcţie de mărimea acestora, astfel:

- până la 1.000 de recipiente se recoltează 2 recipiente;
- între 1.001-2.000 recipiente se recoltează 4 recipiente;
- între 2.001-3.000 recipiente se recoltează 6 recipiente;
- între 3.001-5.000 recipiente se recoltează 8 recipiente.

Recoltarea probelor de lapte: dacă recoltarea se face în fermă se va ţine cont şi de igiena
adăpostului a mulgătorului şi a animalului; recoltarea se face în recipienţi sterili din fiecare sfert în parte
eliminând primele jeturi; pentru depistarea mamitelor streptococice recoltarea se va realiza de la începutul
mulsului; pentru tuberculoză de la sfârşitul mulsorii, iar pentru bruceloză de mijlocul mulsului.
In cazul produselor în ambalaje sub un kilogram proba va fi constituită din ambalajul original, iar în
cazul celor peste un kilogram se recoltează aseptic 250-500 ml de lapte.
• recoltarea probelor de lapte concentrat: se realizează din 5% din numărul ambalajelor care
formează lotul; acesta este format din maximum 2.000 l de lapte concentrat pentru ambalajele mari (bidoane,
butoaie) şi maximum 3.000 l pentru cutii; recipienţii se sterilizează prin flambare şi se deschid cu un
perforator steril; se recoltează 25 g din care se cântăresc aseptic 10 g; prima diluţie se face cu citrat de sodiu
1,25%;
• recoltarea probelor de smântână: lotul este format din maximum 500 kg (în cazul ambalajelor de
desfacere) şi maximum 3.000 kg (la ambalajele de transport); în cazul smântânii ambalate în bidoane se
deschid 5% din numărul acestora şi se recoltează 250 g; în cazul ambalajelor de transport se recoltează 1%
din unităţile de ambalaj;
• recoltarea produselor lactate acide: din ambalajele mici se recoltează 1%, iar din cele mari 10%
(circa 500 ml), în recipienţi sterili adecvaţi;
• recoltarea probelor de unt: se face cu ajutorul unei sonde speciale atât de la suprafaţă cât şi din
profunzime, recoltându-se câte 200 g din care se face o probă medie;

3
 LABORATOR NR. 3 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

• recoltarea probelor de îngheţată: se realizează pe loturi; lotul reprezintă o şarjă de fabricaţie din
acest sortiment; examenul bacteriologic se realizează pe ; minimum 3 ambalaje;
•recoltarea probelor de brânzeturi: se realizează cu cuţitul, sonda sau se pot recolta bucăţi întregi;
-brânza telemea ambalată în butoaie: se recoltează o bucată de la suprafaţă şi o bucată din
profunzime, precum şi 200-300 ml de saramură;
-brânza proaspătă de vaci se recoltează prin deschiderea a 10% din ambalajele care formează
lotul; dacă ambalajele sunt mari (bidoane, tăvi) se iau probe de la suprafaţă şi din profunzime şi se formează
o probă medie din care se recoltează 200-300 g, care se şi trimit la laborator; dacă ambalajele sunt mici
(pachete de 300 g) se recoltează 2% din numărul unităţilor de ambalaj;

Probele de peşte: se recoltează de la mijlocul şi din partea inferioară a ambalajului cel puţin câte 2
peşti sau două bucăţi de peşte; în cazul peştilor peste un kg, se recoltează o fâşie transversală de carne (200-
500 g), care se ambalează în hârtie cerată, se etichetează şi se sigilează păstrându-se în loc uscat, întunecos şi
rece d (maximum 8°C); probele se supun analizei în maxim 12 ore de la recoltare; peştele 2 afumat (lot
maxim 500 kg) se prelucrează în acelaşi mod.

Primirea şi prelucrarea probelor în laborator

 probele se înregistrează, se verifică şi se stabileşte conduita de lucru;

 se controlează recipienţii de recoltare, cum ar fi sacii sau sticlele de plastic, care trebuie să fie
intacte;
 se etichetează corect fiecare probă şi se individualizează;
 este de dorit ca examinarea să se realizeze în cel mult 24 ore de la primirea probelor (48 ore
de la recoltare); dacă acest lucru nu este posibil probele se păstrează la frigider (probe
perisabile, necongelate) sau la congelator (-20°C) în cazul probelor congelate.

A. EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT

Acest examen urmăreşte depistarea bacteriilor prezente într-o probă cu ajutorul microscopului
fotonic şi identificarea preliminară a acestora pe baza caracterelor morfologice. În acest scop, din materialele
de examinat se efectuează frotiuri (preparate uscate, fixate şi colorate.

Tehnica realizării unui frotiu

În executarea unui frotiu din alimente sau culturi bacteriene se parcurg următoarele etape: 1)
etalarea materialului în strat cât mai subțire pe o lamă de sticlă curată, degresată și sterlizată prin flambare,
2) uscarea, 3) fixarea şi 4) colorarea.
I. Etalarea materialului de examinat se execută diferit, în funcţie de natura și consistenţa acestuia
şi se poate realiza cu pipeta Pasteur sau ansa de însămânțare
II. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei (de preferat) sau deasupra flăcării becului de
gaz, evitând supraîncălzirea pentru a nu distruge peretele celular al bacteriilor, deoarece acesta le menţine
forma, - un criteriu taxonomic important. .
III. Fixarea frotiului se realizează prin procedee fizice sau chimice, în funcţie de metoda de colorare.
Mai frecvent se practică:
- fixarea prin flambare, care se execută trecând lama de trei ori prin flacăra becului de gaz, cu
4
 LABORATOR NR. 3 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

fața opusă aceleia pe care a fost etalată proba;

- fixarea prin alcool-flambare, care constă în depunerea pe frotiul uscat a 1-2 picături de alcool
metilic, etilic, sau alcool -acetonă care se aprind pentru câteva secunde.
Prin fixarea frotiurilor se urmărește:
- omorârea bacteriilor;
- o aderență mai bună la suprafața lamei a materialului etalat;
- creșterea permeabilității peretelui celulelor bacteriene față de coloranți.
IV. Colorarea frotiului se face prin diferite tehnici, în funcţie de afinităţile tinctoriale ale bacteriilor
a căror prezență în frotiu o suspectăm pe baza datelor anamnetice și a leziunilor şi în funcție de structurile
morfologice a căror evidenţiere este necesară pentru o identificare preliminară (capsulă, cili, spor).

Clasificarea metodelor de colorare.

1. După numărul de coloranţi utilizaţi:
 coloraţii simple - folosesc un singur agent colorant (ex. coloraţia cu albastrun de metilen);
 coloraţii complexe – folosesc mai mulţi coloranţi succesiv (ex. coloraţia Gram, coloraţia Ziehl-
Neelsen);
2. După frecvenţa şi scopul utilizării:
 coloraţii uzuale – se utilizează frecvent deoarece colorează majoritatea bacteriilor (ex. coloraţia
Gram);
 coloraţii speciale - prin care se colorează anumite bacterii sau servesc la evidenţierea anumitor
structuri bacteriene:
 Coloraţia cu verde de malachit pentru spori
 coloraţia Giemsa pentru capsulă
 coloraţia Casares –Gill pentru cili
 colorația Ziehl-Neelsen pentru a pune în evidență acido-alcalo-alcoolo rezistența.

În mod curent, frotiurile se colorează prin metoda Gram sau cu albastru de metilen.

În urma examenului bacterioscopic direct se poate stabili în primul rând prezenţa sau absenţa
bacteriilor în materialul de examinat.
În cazul prezenţei, pot fi observate următoarele caractere, pe baza cărora se încearcă identificarea
preliminară a germenilor :
 forma, dimensiunile şi modul de grupare a celulelor bacteriene
 afinitatea lor tinctorială (gram pozivitatea sau gram negativitatea; acidorezistenţa).

Metoda de colorare cu albastru de metilen

Colorarea frotiurilor se face cu soluţie de albastru de metilen Loffler, care se prepară din: albastru de
metilen cristalizat (1 g), fenol pur cristalizat lichefiat (2 ml), alcool 96º (10 ml), apă distilată (100 ml).
Tehnica de lucru: frotiul fixat şi răcit se acoperă cu soluţia de colorant timp de 2-5 minute; se spală cu
apă, se usucă.
Rezultatul colorării: formele vegetative ale bacteriilor apar colorate uniform în albastru.

5
 LABORATOR NR. 3 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

LUCRAREA PRACTICĂ