LABORATOR NR.

8 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

DETERMINAREA PREZENEI BACTERIILOR DIN GENUL SALMONELLA

Salmonelele constituie un indicator microbiologic esenial deoarece toxiinfeciile

alimentare produse de de aceti germeni sunt cele mai frecvente n majoritatea rilor. Ele apar mai
frecvent n anotimpurile calde (mai-octombrie), temperatura fiind factorul favorabil pentru
dezvoltarea i multiplicarea germenilor n alimente.

Salmonelele sunt bacterii ncadrate n genul Salmonella, care cuprinde 2 specii(Salmonella

enterica i Salmonella bongori) cu peste 2700 de serotipuri (majoritatea patogene pentru om) i
care, mpreun cu alte 43 de genuri, este inclus n familia Enterobacteriaceae.
Caracterele morfologice i aspectele culturale pe medii uzuale ale enterobacteriaceelor sunt
foarte asemntoare, nct identificarea salmonelelor se bazeaz pe teste biochimice (teste care
evideniaz enzimele de care dispun) i examene serologice (reacii cu seruri imune care conin
anticorpi antisalmonelici).
Caractere morfologice: bacilli i cocobacili, dimensiuni mijlocii (2-3/0,5 micrometri), Gram
negativi, necapsulai, nesporulai, mobili (cu excepia serotipului S. galinarum- pullorum)(fig. 8.1)
Condiii de cultivare i caractere culturale
Toate salmonelele sunt aerobe/facultativ anaerobe, dezvoltndu-se la temperaturi cuprinse
ntre 2 C- 540C, aspect care, uneori, ridic ndoieli asupra eficienei pstrrii alimentelor n condiii
0

de refrigerare. Aceste bacterii suport limite largi de pH (4 i 9,5), pH-ul optim fiind 6,5-7,5.
n laborator se dezvolt n 18-24 ore, la 370C
n medii lichide salmonelele determin turbiditate uniform iar pe mediile solide formeaz
colonii rotunde, lucioase, cu margini regulate (fig.8.2).

Fig.8.1 Salmonella spp., frotiu col. Gram (X100) Fig.8.2 Salmonella spp., cultur pe
geloz nutritiv

Decelarea salmonelelor n alimente este dificil din dou motive:

1. n alimentele contaminate salmonelele se gsesc n numr redus i mpreun cu germeni
din alte genuri ale familiei Enterobacteriaceae, care au proprieti comune cu salmonelele
i , de obicei, se gsesc n numr mai mare;

1
 LABORATOR NR. 8 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

2. procesele de prelucrare a alimentelor i aditivii determin stresarea i inhibarea

multiplicrii salmonelelor.
Prin urmare, metodologia de izolare a salmonelelor din alimente trebuie s asigure condiii
de mediu care s le permit reluarea normal a proceselor de cretere i n acelai timp s inhibe
bacteriile concurente.
Metoda de izolare i identificare
Standardul S.R. E.N. ISO 6579/AC/2006, impune identificarea microorganismelor din genul
Salmonella spp. din 25 grame prob. Conform acestui standard, salmonelele .trebuie s fie absente n
toate sortimentele de alimente.

PROTOCOLUL DE LUCRU prevede urmtoarele 4 etape (diagrama 8.1):

1. Etapa de prembogire const n nsmnarea a 25g/ml produs, cntrit/msurat n

condiii aseptice, n 225ml mediu lichid neselectiv (bulion-manit, ap peptonat tamponat)
i incubarea la 37C, timp de 18 h. Prembogirea se aplic produselor congelate,
deshidratate, tratate termic sau chimic i are ca scop destresarea germenilor.
2. Etapa de mbogire selectiv se aplic ca prim faz de lucru pentru alimentele proaspete,
refrigerate, tocate, lapte crud i ou proaspete i const n nsmnarea probelor pe dou
medii lichide de mbogire selectiv (conin substane inhibitoare pentru flora de asociaie:
sruri biliare, verde briliant).
Se cntresc/msoar 25g/ml produs i se introduc ntr-un flacon cu 100 ml bulion Rapaport
Vassiliadis cu soia (bulion RVS) i 25g/ml n alt flacon cu 100 ml bulion Muller-Kauffmann
tetrationat cu novobiocin (bulion MKTTn).
mbogirea selectiv este etapa a doua pentru produsele supuse prembogirii. Din
bulionul-manit sau apa peptonat tamponat se trec 0,1 ml cultur ntr-un tub cu 10 ml bulion RVS
i 1 ml cultur ntr-un tub cu 10 ml bulion MKTTn.
Mediile de mbogire selectiv se incubeaz astfel:
- mediul Rapaport Vassiliadis cu soia, la 40,5-42,5C, timp de 24 h
- mediul Muller-Kauffmann tetrationat cu novobiocin, la la 37C timp de 24 ore.
3. Etapa de izolare selectiv i identificare
Din cele dou medii de mbogire se striaz cte o ans pe dou agaruri selective:
- obligatoriu, mediul XLD (agar xiloz-lizin-dezoxicolat) i
- la alegere un alt mediu selectiv pentru salmonele: agar Hektoen enteric, mediul
cromogen Rambach, agar Istrati-Meitert (agar bil-verde brilliant), agar Wilson-
Blaire

coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar XLD au un centru negru i o zon

transparent luminoas de culoare roiatic.
colonii tipice pe mediul Agar Hektoen enteric sunt albastre verziu sau bleu, cu sau fr
centru negru

2
 LABORATOR NR. 8 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

pe mediul Istrati-Meitert coloniile de Salmonella sunt verzi sau verzi-albstrui, uor

transparente, cu sau fr centru albastru nchis sau negru (denot prezena hidrogenului
sulfurat pe care salmonenele l produc din catabolismul aminoacizilor cu sulf).

4. Etapa de confirmare
Pentru confirmare, se iau din fiecare plac cu medii selective cel puin o colonie considerat
tipic i alte patru colonii dac prima se dovedete a fi negativ.
A. Confirmarea biochimic se realizeaz pe mediile politrope TSI i MIU (permit
efectuarea concomitent a mai multor teste de identificare a bacteriilor), mediul
Simmons sau cu ajutorul sistemelor microtest (ex., galeriile API).

1. Mediul TSI (triple sugar iron)

Mediul conine trei glucide (glucoz, lactoz i zaharoz) i rou fenol (indicator de pH).
Se ajusteaz pH-ul la 7,4; se repartizeaz cte 5-6 ml n tuburi Wassermann i se autoclaveaz 20
minute. Se solidific n coloan 2,5 cm i n pant, 4 cm. Mediul are culoare roz nchis.
nsmnarea se face prin nepare n poriunea dreapt i prin striere pe suprafaa nclinat
Tuburile nsmnate se incubeaz la 37C, timp de 24 ore.
Interpretare - fementarea glucozei se consider pozitiv dac n poriunea dreapt a
mediului culoarea vireaz n galben. Dac fermentarea a avut loc cu producie de gaz, se observ
bule de gaz sau gaz n cantitate mare, care detaeaz mediul de fundul eprubetei.;
- fermentarea lactozei/ zaharozei se manifest prin virarea n galben a poriunii
nclinate a mediului.
- producia de H2S este pozitiv dac mediul se nnegrete n zona de trecere ntre
poriunea dreapt i cea nclinat.

n cazul prezenei salmonelelor se observ:

- coloana mediului este galben i sunt prezente bule de gaze(fermenteaz glucoza
cu formare de gaze);
- panta mediului este roie (nu fermenteaz lactoza i zaharoza;
- zone de culoare neagr n masa mediului (producie de hidrogen sulfurat)
2. Mediul MIU (mobilitate, indol, uree), nsmnat prin nepare pe toat lungimea
coloanei.
Mediul este un agar cu rou fenol,glucoz (1 g), KH2PO4 (2 g) PH-ul se ajusteaz la 6,8
(slab acid)
Dup sterilizarea mediului se adaug, nainte de solidificare, 20 ml dintr-o soluie de uree 20%,
sterilizat prin filtrare. Datorit reaciei slab acide, mediul are o culoare glbuie (rou fenol este
galben n mediu acid i devine rou n mediu alcalin).
n urma nsmnrii unei bacterii care hidrolizeaz ureea transformnd-o n dou molecule
de amoniac alcalin, mediul, iniial galben, se coloreaz n rou.

n cazul prezenei salmonelelor se observ:

- opacifierea mediului n jurul liniei de nsmnare (bacterie mobil);
- culoarea mediului nemodificat (lipsa ureazei, - enzim care descompune ureea
3
 LABORATOR NR. 8 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

din mediu n 2 molecule de amoniac);

- dup adugarea pe suprafaa culturii a reactivului Kovacs, culoarea acestuia nu se
modific deoarece salmonelele nu au enzimele necesare pentru a utiliza
triptofanul din mediul de cultur , aminoacid din catabolismul cruia rezult indol.
n prezena indolului reactivul vireaz din galben n rou crmiziu.
3. Mediul Simmons
Mediul conine citrat de sodiu sau amoniu i albastru de bromtimol (substan indicatoare de
pH) i are pH neutru. La preparare mediul are culoarea verde. Bacteriile capabile s metabolizeze
citratul de amoniu sau sodiu, dau culturi care alcalinizeaz mediul virnd culoarea din verde, n
albastru intens. Bacteriile care nu utilizeaz citraii, nu modific culoarea mediului .
n cazul prezenei salmonelelor se observ virarea culorii mediului din verde n albastru,
modificare care indic capacitatea acestor bacteria de a utiliza citraii ca unic surs de
carbon.
4. Sistemele microtest
Pentru a reduce volumul considerabil de munc, materiale i timp pe care la reclam
deseori testele utilizate n vederea ncadrrii taxonomice a unei tulpini nou izolate, n
ultimi ani se recurge tot mai mult la miniaturizarea metodelor convenionale de lucru,
mai ales n cadrul examinrii caracterelor metabolice ale bacteriilor. Iniial propuse
pentru identificarea enterobacteriaceelor, ele au fost extinse ulterior i pentru alte
grupri taxonomice. n aceste sisteme, testele sunt selectate ntr-o anumit formul care
s permit identificarea unui grup de microorganisme.
n ultimii ani au fost propuse numeroase sisteme microtest, cunoscute sub diverse
denumiri comerciale (API; Enterotub II, ID32 etc.).
Sistemele API , de exemplu, permit efectuarea comcomitent a 20 de teste biochimice i
o bun identificare a celor mai importante bacterii de interes medical.
Acest sistem utilizeaz stripuri din material plastic, cu 20 de microtuburi n care se gsesc
medii speciale deshidratate. Se efctueaz o suspensie n ser fiziologic a 1-2 colonii de pe
agar a bacteriei de identificat, care se distribuie apoi n godeurile (microtuburile)
stripului. Pentru realizarea condiiilor de anaerobioz n unele godeuri (menionate n
prospect), se adaug ulei mineral steril. Dup o incubare de 24 de ore la 370 C, se citesc i
se noteaz reaciile pozitive pe baza modificrilor de culoare din fiecare godeu (fig 9.3).
Identificarea bacteriei testate poate fi fcut pe baza unor tabele de identificare sau
computerizat.

B. Confirmarea serologic se realizeaz cu seruri anti-Salmonella O polivalent

prin reacia de aglutinare rapid pe lam sau folosind teste rapide tip
Singlepath Salmonella.
Se depune pe o lam degresat o pictur de ser aglutinant n care se omogenizeaz o
ans de cultur bacterian. Reacia este considerat pozitiv cnd n pictur se formeaz
nite grunji cu aspect granular. Reacia pozitiv demonstreaz c bacteria testat
aparine genului Salmonella.

4
 LABORATOR NR. 8 [MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA, ANUL II]

8.1 Diagrama modului de lucru pentru izolarea i identificarea salmonelelor din alimente

Bulion MKTTn
Bulion RVS

Cultura de Salmonella pe mediile

Cultura de Salmonella pe Hektoen i Rambach
Mediul XLD

Mediile:TSI,MIU, Simmons
(citrate)

(Glu+, H2S+, Lac-, Mobilitate+, Indol-, Uree-,

Cit+)

Galerie API 10 S