Proiect: FITOCOMP

Programul Operational Competitivitate

Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

ANALIZA COMPUSILOR POLIFENOLICI PRIN

HPLC-MS DIN EXTRACTE VEGETALE
 Proiect: FITOCOMP
Programul Operational Competitivitate
Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

1. SCOP SI APLICATII

Scopul metodei este analiza calitativa si cantitativa a 11 compusi polifeolici

din extracte obtinute din materiale vegetale.

2. DEFINITII

Cromatografia reprezinta separarea unui component intre o faza stationara si

o faza mobila, pe baza afinitatilor diferite ale componentelor de separat pentru
fiecare dintre fazele respective (Craig, 1940).

Versatilitatea tehnicilor de cromatografie de lichide de inalta performanta

(HPLC) le fac mult mai aplicabile pentru caracterizarea principiilor active
antioxidante fata de celelate tipuri de tehnici cromatografice si este sustinuta si de
faptul ca tehnicile HPLC suporta mai multe tipuri de separare (mai multe gradiente
de solvent, de temperatura etc) precum si interfatarea cu mult mai multe sisteme
de detectie.

MS = spectrometru de masa.

3. PRINCIPIUL METODEI

Principiul de analiza al metodei se bazeaza pe afinitatea diferita a

componentelor amestecului de separat fata de coloana cromatografica. Proba test
furnizata de catre beneficiarul analizei, este analizata dupa ce i se realizeaza o

este dizolvata in etanol si componentii polifenolici individuali sunt separaţi prin

HPLC. Continutul in fiecare component din probe este calculat utilizand factori de
calibrare determinati din solutiile de calibrare.
 Proiect: FITOCOMP
Programul Operational Competitivitate
Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

4. ECHIPAMENTE SI CONSUMABILE

Masurarile cromatografice pot fi realizate folosind un sistem complet HPLC echipat

cu 2 pompe, un cuptor termostatat pentru coloana, un degazor si utilizand o coloana
C18 Nucleosil 100-3.5, 100x2.1 mm. Sistemul HPLC trebuie cuplat cu un detector
MS, utilizand o interfata de ionizare de tip electrospray (ESI) si folosind, datorita
specificitatii compusilor de interes, modul de ionizare negativ.

5. REACTIVI SI STANDARDE

Solutiile stoc, 1 mg/mL, de compusi standard de acid cafeic, (-)-catechin,

epicatechin, quercetina, miricetin, acid galic, kemferol, acid sinapic, resveratrol,
isorahmetin si acid p-cumaric sunt preparate prin dizolvarea a 1 mg de substanta in
1 mL de etanol. Din solutile stoc se realizeaza dilutiile corespunzatoare in etanol
pentru obtinerea concentratiilor finale (5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL,
75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL) necesare pentru realizarea curbei de calibrare.
Toti ceilalti reactivi, (acetonitril, acid formic) trebuie sa fie pentru uz cromatografic
si sunt folositi dupa o f
sa fie ultrapura. Pentru a evita degradarea compusilor de interes, avand in vedere
reactivitatea ridicata a acestora la lumina si la oxigenul atmosferic, solutiile stoc
sunt pastrate intre experimente la intuneric si la o temperatura constanta de 4 0C iar
dilutiile sunt preparate proaspat, inainte de a fi utilizate.

6. ETALONAREA SI STANDARDIZAREA

Validarea sistemului HPLC-MS se realizeaza automat cu ajutorul software-ului

LCMS Solution care executa o inspectie a fiecarei componente si furnizează un raport
de validare a hardware-ului conform cerintelor GLP/GMP. Testul de incadrare a
sistemului in parametrii functionali se realizează fie lunar, in cazul aplicarii aceleiasi
metode de incercare, sau ori de cate ori este nevoie in cazul schimbarii coloanelor,
in functie de masurand. Spectrometrul de masa se calibreaza inaintea analizelor prin
 Proiect: FITOCOMP
Programul Operational Competitivitate
Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

injectie directa de solutie de tunning de mase corespunzatoare compusilor de

interes.

7. CARACTERISTICI DE PERFORMANTA ALE METODEI

Cu scopul de a se demonstra selectivitatea acestei metode, se inregistreaza

cromatogramele pentru un amestec de standarde (11 compusi polifenolici),
calculandu-se parametrii de rezolutie in cazul compusilor polifenolici cu aceasi masa
moleculara, respectiv [M-H]-, iar valorile obtinute vor confirma faptul ca picurile
sunt bine separate. In continuare, pentru stabilirea domeniului de liniaritate a
raspunsului se vor realiza calculul curbei de calibrare si al coeficientului de
corelatie. Curbele de calibrare vor fi obtinute pentru 7 puncte diferite, in functie
de domeniul de raspuns necesar beneficiarului analizelor, masuratorile fiind
realizate in triplicat.

Pentru determinarea limitei de detectie (LoD) si determinarea limitei de

determinare (LQ) a fost injectat un volum de faza mobila in sistemul HPLC (cate 3
injectii replicate), LoD si LQ fiind calculate ca de 3 ori raportul semnal/zgomot
respectiv de 10 ori raportul semnal/zgomot. Pentru determinarea limitei de detectie
(LoD) si determinarea limitei de determinare (LQ) va fi injectat un volum de faza
mobila in sistemul HPLC (cate 3 injectii replicate), LoD si LQ fiind calculate ca de 3
ori raportul semnal/zgomot respectiv de 10 ori raportul semnal/zgomot.

In tabelul 1 sunt date exemplu caracteristicile de performanta ale metodei

HPLC-MS obtinute pentru cei 11 compusi polifenolici.
 Proiect: FITOCOMP
Programul Operational Competitivitate
Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

Tabel 1. Unele caracteristici de performanta ale metodei HPLC.

Domeniul de
LoD
- tR Ecuatia curbei de etalonare liniaritate a LQ
Analit [M-H] R
(min) raspunsului
)
Catechin 289 5.33 A=121042.4xC+351189.2 0.9986 5 - 150 0.15 0.50
Ac. galic 169 6.19 A=22585.55xC+363287.9 0.9971 0.26 0.86
10-150
Ac. cafeic 179 18.37 A=35879.23xC+778522.2 0.9961 0.21 0.71
Epicatechin 289 20.44 A=52819.1xC-27858.99 0.9988 0.54 1.77
Ac. p-
163 23.41 A=22447.73xC+217032.9 0.9973 0.23 0.74
cumaric
Ac. sinapic 223 25.06 A=3882.560xC+16555.81 0.9982 5-150 0.16 0.51
Miricetin 317 30.41 A=353586.2xC+55763.83 0.9998 0.08 0.27
Resveratrol 227 33.08 A=2522.203xC+54328.05 0.999 0.62 2.06
Quercetina 301 35.66 A=255242.5xC+ 4439664 0.9961 0.64 2.11
10-150
Kemferol 285 42.45 A=229130.9xC+6578697 0.9936 0.15 0.48
Isorahmetin 315 43.17 A=64703.07xC+2397037 0.9958 5-150 0.16 0.53

8. LIMITARI SI INTERFERENTE

Nu este cazul.

9. PROBA-PRELEVARE, TRATARE(STABILIZARE) SI STOCARE

Dupa prelevare, materiale vegetale sunt supuse unei proceduri de sampling,

metoda de extractie fiind aleasa in functie de scopul analizei. Metoda de extractie
este descisa in alt protocol (vezi capitolul 2: protocoale si tehnologii de extractie si
concentrare selectiva). Probele de extracte din materiale vegetale sunt depozitate
in recipiente de sticla curate si pastrate la intuneric si la o temperatura constanta
de 4°C. Solutiile de proba de material vegetal vor fi diluate 1:10 (v/v) in etanol
inaintea analizei HPLC. Factorul de dilutie va fi utilizat pentru calcularea
concentratiilor de polifenoli din proba. Pentru a putea fi analizate prin HPLC probele
vor fi filtrate prin celule de ultra filtrare Syringe Driven Filter Unit 0.2 µm PTFE.

10. PROTOCOLUL DE ANALIZA DETALIAT

Achizitiile MS vor fi realizate in urmatoarele conditii: debitul gazului de nebulizare

(N2) 1.5 L/min; voltaj CDL 15 V; temperatura CDL 230°C; heat block 200°C,
 Proiect: FITOCOMP
Programul Operational Competitivitate
Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

temperatura interfata 250°C; voltaj detector 1.5 kV, voltaj interfata 4 kV. Modul
pentru monitorizarea ionilor selectati (SIM) va fi folosit pentru determinarea ionilor
specifici.

Faza mobila necesara realizari analizelor este compusa din acid formic in apa (pH=3,
solvent A) si acid formic in acetonitril (pH=3, solvent B) utilizandu-se o elutie in
gradient al acestora, si anume:

Tabel 2. Gradientul fazei mobile necesar pentru analiza cromatografica a

compusilor polifenolici.

Timp
Solvent A Solvent B
(minute)
0 95 % 5%
20 70 % 30 %
40 70 % 30 %
50 50 % 50 %
52 50% 5%
70 95% 5%

Pentru separarea compusilor se va folosi un debit de flux de 0.1 mL/min iar

schema de gradient ce se va aplica este urmatoarea:

Tabel 3. Gradientul debitului de flux necesar pentru realizarea separari

cromatografice a compusilor polifenolici.

Debitul de flux
Timp (minute)
mL/min
0 0.1
5 0.1
5.01 0.2
15 0.2
15.01 0.1
35 0.1
35.01 0.2
60 0.2
60.01 0.1
70 0.1
 Proiect: FITOCOMP
Programul Operational Competitivitate
Contract: 83/2016
Portofoliu cunostinte transferabile-Capitolul 1 protocoale si metode de
determinare principii active si eficacitatea acestora
Data 09.12.2016 - 28.02.2017
Versiunea 1

Faza mobila trebuie filtrata printr-o membrană PTFE 0.20 μm si sonicata cu

ajutorul unei bai de ultrasunete pentru eliminarea aerului dizolvat in solutie.
Coloana cromatografica va fi echilibrata 30 de minute inainte de inceperea
analizelor. Experimentele vor fi realizate la o temperatura constanta a coloanei de
200C iar timpul necesar efectuarii unei analize este de 70 de minute.

Probele vor fi filtrate inainte de injectare in sistemul HPLC prin celule de

ultra filtrare Syringe Driven Filter Unit 0.2 µm (Macherey-Nagel) si apoi 20 μL de
proba vor fi injectati in sistemul HPLC cuplat cu MS.

11. MANAGMENTUL REZIDUURILOR

Reziduurile de substante folosite ca solventi se colecteaza separat in

recipienti etichetati corespunzator, capabili sa previna scurgerea, evaporarea si
corodarea recipientului si se trateaza conform legislatiei locale si normelor interne
ale laboratorului.