Universitatea de Medicină şi Farmacie

“Grigore T. Popa” Iaşi

Facultatea de Medicină

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

MODULATORI AI NEUROPATIEI
CHIMIOTERAPIC-INDUSE. ASPECTE ŞI
CARACTERISITICI

Conducător ştiinţific
Prof. dr. Magda BĂDESCU

Doctorand
Teodora ALEXA-STRATULAT

2016
 STADIUL CUNOAȘTERII
I. DUREREA NEUROPATĂ ...............................................................3
I.1 INTRODUCERE .....................................................................3
I.2 CLASIFICĂRI ALE DURERII ...............................................3
I.3 DUREREA NEUROPATĂ: DEFINIŢIE, INCIDENŢĂ,
CLASIFICARE ......................................................................................4
I.4 DEFINIȚII UTILIZATE ÎN CARACTERIZAREA DURERII
NEUROPATE ........................................................................................7
II. MECANISMELE TRANSMITERII DUREROASE ....................8
II.1 TRANSMITEREA DUREROASĂ - NOȚIUNI
ANATOMICE ........................................................................................8
II.2 MODULAREA TRANSMISIEI DUREROASE..................15
II.3 PARTICULARITĂȚILE ŞI MODIFICĂRILE INDUSE DE
DUREREA NEUROPATĂ CRONICĂ ...............................................17
III DUREREA NEUROPATĂ POST-CHIMIOTERAPIE .............21
III.1 INTRODUCERE ................................................................21
III.2 DUREREA NEUROPATĂ INDUSĂ DE DERIVAȚI DE
PLATINĂ .............................................................................................22
III.3 DUREREA NEUROPATĂ INDUSĂ DE TAXANI ..........24
III.4 DUREREA NEUROPATĂ INDUSĂ DE ALCALOIZI DE
VINKA .................................................................................................25
IV MODULATORI MITOCONDRIALI..........................................28
IV.1 ALBASTRUL DE METILEN ............................................28
IV.2 CLORURA DE COBALT ..................................................30
IV.3 NITROGLICERINA ...........................................................33
IV.4 CURCUMINA ....................................................................34
IV.5 ACIDUL ASCORBIC ........................................................36
IV.6 VITAMINA B2 ...................................................................38
IV.7 ZINC ...................................................................................40
IV.8 MAGNEZIU .......................................................................42

PARTEA PERSONALĂ
I. MOTIVAŢIA ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL ...45
I.1 MOTIVAŢIA STUDIULUI DOCTORAL ............................45
I.2 OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL .........................46
II. ANALIZĂ PRELIMINARĂ – IDENTIFICAREA
MODULATORILOR MITOCONDRIALI CU POTENŢIAL
ANALGEZIC ...............................................................................................47
II.1 OBIECTIVE SPECIFICE ....................................................47
II.2 MATERIAL ŞI METODĂ ...................................................47
II.3 REZULTATE .......................................................................49
II.4 DISCUŢII .............................................................................56
 II.5 CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI ................................58
III. EVALUAREA EFECTULUI MODULATORILOR
MITOCONDRIALI ÎN CADRUL TESTELOR DE ALLODINIE,
HIPERALGEZIE ŞI DURERE INFLAMATORIE ..................................59
III.1 OBIECTIVE SPECIFICE ...................................................59
III.2 MATERIAL SI METODĂ..................................................59
III.3 REZULTATE......................................................................62
III.4 DISCUŢII............................................................................78
III.5 CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI ...............................81
IV. VALIDAREA UNUI MODEL MURIN DE DURERE
NEUROPATĂ POST-PACLITAXEL ÎN CADRUL LCTM ....................83
IV.1 OBIECTIV SPECIFIC ........................................................83
IV.2 MATERIAL ŞI METODĂ .................................................83
IV.3 REZULTATE .....................................................................84
IV.4 DISCUŢII ...........................................................................91
IV.5 CONCLUZII .......................................................................92
V. EVALUAREA PRELIMINARĂ A EFECTULUI COCL2 ÎN
NEUROPATIA DUREROASĂ INDUSĂ DE PACLITAXEL .................93
V.1 OBIECTIVE SPECIFICE ....................................................93
V.2 MATERIAL ŞI METODĂ ...................................................93
V.3 REZULTATE .......................................................................94
V.4 DISCUŢII.............................................................................99
V.5 CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI ..............................100
VI. EVALUAREA PRELIMINARĂ A EFECTULUI MB ÎN
NEUROPATIA DUREROASĂ INDUSĂ DE PACLITAXEL ...............101
VI.1 OBIECTIVE SPECIFICE .................................................101
VI.2 MATERIAL ŞI METODĂ ...............................................101
VI.3 REZULTATE ...................................................................102
VI.4 DISCUŢII .........................................................................106
VI.5 CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI ............................107
VII. STUDII COMPLEXE ALE EFECTULUI MB ÎN DUREREA
NEUROPATĂ POST-PACLITAXEL .....................................................108
VII.1 OBIECTIVE SPECIFICE ................................................108
VII.2 MATERIAL ŞI METODĂ ..............................................108
VII.4 DISCUŢII ........................................................................120
VII.5 CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI ...........................120
VIII. EVALUAREA IN VITRO A ALBASTRULUI DE
METILEN ..................................................................................................121
VIII.1 OBIECTIVE SPECIFICE ..............................................121
VIII.2 MATERIAL ŞI METODĂ .............................................121
VIII.3 REZULTATE .................................................................124
VIII.4 DISCUŢII .......................................................................129
 VIII.5 CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI ..........................129
IX. DISCUŢII ....................................................................................131
IX.1 CURCUMINA ..................................................................131
IX.2 NITROGLICERINA .........................................................133
IX.3 VITAMINA B2 .................................................................134
IX.4 ACIDUL ASCORBIC ......................................................136
IX.5 CO-ADMINISTRAREA CU ANALGEZICELE .............137
IX.6 CLORURA DE COBALT ................................................139
IX.7 ALBASTRUL DE METILEN ..........................................141
X. CONCLUZII ................................................................................146
REFERINŢE BIBLIOGRAFICE.................................................................148
ANEXA 1 – APROBAREA COMISIEI DE ETICĂ UMF IAŞI
ANEXA 2 – LISTA SUBSTANŢELOR ŞI FIRMELOR PRODUCĂTOARE
ANEXA 3 – APROBAREA COMISIEI DE ETICA MILANO-BICOCCA
ANEXA 4 – PROTOCOL DETALIAT IMUNHISTOCHIMIE
ANEXA 5 – ARTICOLE PUBLICARE IN EXTENSO
MOTIVAŢIA ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL
Cancerul tinde să devină din ce în ce mai mult o boală
cronică – progresele înregistrate în terapia antineoplazică combinată în
ultimii 20 de ani au crescut semnificativ numărul supravieţuitorilor de
cancer. Progresele înregistrate în identificarea noilor agenţi
antineoplazici şi a combinaţiilor terapeutice optime nu se regăsesc şi
în domeniul terapiei efectelor secundare ale medicaţiei antineoplazice.
În prezent, incidenţa durerii persistente post-tratament (durere cronică)
este de aproximativ 40% la supravieţuitorii de cancer.
Neuropatia poate apărea ca efect advers la administrarea
oricărui chimioterapic. Am ales să îmi concentrez studiul doctoral pe
efectul taxanilor asupra neuropatiei deoarece în prezent taxanii fac
parte din standardul neoadjuvant al chimioterapiei cancerului mamar,
ceea ce înseamnă că un număr din ce în ce mai mare de femei vor trăi
o perioadă lungă de timp după tratamentul cu taxani, care este asociat
cu o incidenţă a neuropatiei cronice de 25%.
Cercetări efectuate în ultimii ani au sugerat că paclitaxelul
determină neuropatie prin disfuncţie mitocondrială, inducând un
blocaj mitocondrial care afectează celula nervoasă. Din acest motiv,
am decis investigarea efectului modulatorilor mitocondriali asupra
neuropatiei induse de tratamentul cu paclitaxel prin reproducerea
neuropatiei post-chimioterapie la şoareci.
În acest context, obiectivele studiului doctoral au fost:
1. Identificarea modulatorilor mitocondriali cu potenţial analgezic prin
evaluarea efectului antinociceptiv
2. Evaluarea efectelor modulatorilor mitocondriali selectaţi în urma
testelor preliminarii asupra hiperalgeziei, allodiniei şi durerii
inflamatorii (echivalente ale durerii neuropate)
3. Reproducerea unui model experimental de neuropatie indusă de
paclitaxel în cadrul „Centrului pentru Studiul şi Terapia Durerii”
4. Evaluarea efectului protector al unor modulatori mitocondriali
selectaţi în durerea neuropată indusă de paclitaxel
MATERIAL ŞI METODĂ
Studiile au fost realizate în cadrul UMF Iaşi, în laboratorul
CTSD (“Centrul pentru studiul şi terapia durerii”) şi în departamentul
de cercetare al Universităţii de Medicină Milano-Bicocca (DCTM).
1
Studiile au fost finanţate de către proiectul PN-II-ID-PCE-2011-3-
0875 cu titlul “Studii experimentale asupra relaţiei dintre disfuncţia
mitocondrială şi durere; noi perspective în terapia durerii” şi de către
proiectul “Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării
științifice din universitățile medicale prin acordarea de burse doctorale
și postdoctorale – DocMed.Net 2.0”. Protocolul de studiu a fost
aprobat de Comitetul de Etică al UMF Iaşi şi al UMF Milano-Bicocca.
Procedurile au fost realizate pe şoareci adulţi din rasa BALB/c
şi/sau Swiss Weber. Experimentele s-au desfăşurat în conformitate cu
directivele Consiliului Comunității Europene 86/609/EEC şi au
respectat ghidurile în vigoare pentru îngrijirea şi manipularea
animalelor de laborator.
Principalele metode de evaluare utilizate au fost:
 teste comportamentale: testul Hot Plate (evaluarea nocicepţiei),
testul Tail Flick (evaluarea nocicepţiei), testul Cold Plate
(sensibilitatea la rece), testul Hargreaves (allodinie termică), testul
von Frey (allodinie mecanică), testul la formalină (durere
inflamatorie/neuropată)
 evaluarea imunhistochimică: c-fos, ATP3
 evaluarea morfometrică şi morfologică a nervului sciatic
 evaluarea vitezei de conducere nervoasă
 evaluarea in vitro a citotoxicităţii şi capacităţii de neuroprotecţie
Evaluarea statistică a fost realizată cu ajutorul SPSS v. 20 şi
GraphPad v.6. Pentru a evalua efectul substanței asupra animalelor, s-
a efectuat two-way ANOVA pentru fiecare lot tratat comparativ cu
controlul, urmat de teste post-hoc în care timpul a fost măsura care se
repetă şi substanța a fost variabila independentă. Pragul de
semnificație statistică a fost definit ca p<0.05. Graficele au fost
realizate cu ajutorul software-ului GraphPad v6 sau Origin. Valorile
sunt exprimate ca medie ± eroare standard. Efectul antinociceptiv este
exprimat ca procent din efectul maxim posibil (%MPE) sau inhibiție
procentuală a comportamentului nociceptiv (%INB).
IDENTIFICAREA MODULATORILOR MITOCONDRIALI CU
POTENŢIAL ANALGEZIC (ANALIZĂ PRELIMINARĂ)
În cadrul experimentului au fost evaluate următoarele
substanţe şi combinaţii: albastru de metilen (MB), clorura de cobalt
2
(CoCl2), curcumină (CC), vitamina B2 (B2), vitamina C (acid
ascorbic – AA), nitroglicerina (NTG), Zn + Tramadol (Zn - T), Mg +
Tramadol (Mg - T) şi Tramadol (T).
Şoareci BALB/c au fost împărțiți aleator în funcție de
substanța de administrat astfel: grup MB - 5 mg/kgc i.p., grup CoCl2 -
25 mg/kgc i.p., grup CC - 120 mg/kgc gavaj, grup B2 100 mg/kgc i.p.,
grup AA – 500 mg/kgc i.p., grup NTG – 10 mg/kgc i.p., grup SF -
grup control i.p. şi grup U - grup control gavaj. Pentru evaluarea
efectelor co-administrării tramadolului şi Zn, Mg, şoareci din rasa
Swiss Weber au fost împărţiţi în: grup Zn-T (0.6 mg/kgc Zn + 50
mg/kgc T), grup Mg-T (75 mg/kgc Mg + 50 mg/kgc T), grup T (50
mg/kgc T) şi grup SFT - grup control i.p. pentru Zn, Mg, T.
Fiecare grup a fost alcătuit din câte 8 şoareci. Pentru şoarecii
din grupurile MB, CoCl2, CC, B2, AA, NTG, SF şi U, testele de
durere (HP şi TF) au fost efectuate înainte de administrarea substanţei
de cercetat şi la 30, 60, 120, 180 şi 240 minute după. Deoarece efectul
tramadolului i.p. se instaurează foarte rapid, grupurile T, Zn-T, Mg-T
şi SFT au fost evaluate la baseline şi 15,30, 45 şi 60 de minute după.
Grupul U a servit drept grup control pentru grupul CC, iar grupul SF a
servit drept grup control pentru restul substanţelor de cercetat.
REZULTATE
Efectul MB, CoCl2 şi NTG asupra nocicepţiei
La testul Hot Plate (fig. 1), administrarea acută de MB a fost
asociată cu un efect analgezic statistic semnificativ progresiv
crescător, cu valori de 27.8% la 30 de minute şi 38.6% la 240 de
minute. CoCl2 nu a influenţat latenţa de răspuns la testul HP, iar
efectul maxim analgezic al CoCl2 a fost de 18.42%, înregistrat la o oră
de la administrare. NTG a determinat un efect semnificativ în timp, cu
un MPE între 11.33% la 30 de minute şi 47.09% la 180 de minute.
La testul Tail Flick, nici MB, nici NTG nu au influenţat
latenţa de răspuns evaluată de testul TF la nici un moment al
experimentului, în timp ce administrarea de CoCl2 a fost asociată cu
un efect hiperalgic, cu un MPE constant negativ.
Efectul CC asupra nocicepţiei
La testul Hot Plate, administrarea de curcumină a fost
asociată cu un efect analgezic statistic semnificativ în timp. CC a
indus un efect analgezic progresiv crescător, cu valori de 18.11% la 60
3
de minute până la 54.70% la 240 de minute. În ceea ce priveşte testul
Tail Flick, diferenţa între grupuri a atins un prag statistic semnificativ
doar la 30 şi 60 de minute (p = 0.0193) conform analizei ANOVA.
MPE-ul a fost maxim la 60 de minute, cu o valoare medie de 27.50%.

H o t P la t e MB

A C o C l2
NTG
15
C o n tro l
T im e ( s e c o n d s )

*
*
* *
10
*
*

0
B a s e lin e 3 0 m in 6 0 m in 1 2 0 m in 1 8 0 m in 2 4 0 m in

B
60
M P E (% )

40

20

-2 0 3 0 m in 6 0 m in 1 2 0 m in 1 8 0 m in 2 4 0 m in

Fig. 1. Latenţa de răspuns la grupurile experimentale. A – latenţa medie (s) in timp;

B - efectul maxim posibil (%). * = p<0.05

Efectul vitaminei B2 şi AA asupra nocicepţiei

Administrarea acidului ascorbic a determinat un uşor efect
analgezic asupra testului Hot Plate, cu un efect al interacţiunii timp-
substanţă statistic semnificativ. Vitamina B2 a indus un efect analgezic
persistent şi semnificativ de la prima evaluare şi până la finalul
experimentului, cu un MPE care a variat între 31.38% şi 65.23%.
AA nu a influenţat latenţa de răspuns evaluată de testul Tail
Flick la nici un moment al experimentului. Administrarea vitaminei
B2 a fost asociată cu un efect analgezic cu tendinţă la semnificaţie
statistică (p = 0.0531).

4
Efectul co-administrării Mg-T şi Zn-T asupra nocicepţiei
La testul Hot Plate, administrarea de tramadol a fost asociată
cu un efect analgezic robust (p < 0.0001) încă de la prima evaluare.
Co-administrarea de Zn şi Tramadol şi cea de Mg - Tramadol au avut
un efect analgezic mai intens decât cel al tramadolului singur. MPE-ul
tramadolului a înregistrat un maxim de 66.69%, în timp ce al
combinaţiei Zn-T a variat între 95.59% (la 60 de minute) şi 100% (la
15 minute), iar cel al Mg între 84.1% (la 15 min) şi 99.40% (la 60 de
minute). Grupul control a înregistrat un MPE de maxim 0.55%.
Rezultate similare au fost înregistrate şi la testul Tail Flick -
tramadolul a indus o analgezie semnificativă în comparaţie cu grupul
control, însă co-administrarea de Zn şi Tramadol sau Mg şi Tramadol
au fost mai eficiente.
CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI
Evaluarea preliminară a modulatorilor mitocondriali a
demonstrat că toţi influenţează nocicepţia, fie în sensul descreşterii
percepţiei şi/sau transmisiei dureroase, fie în sensul stimulării
acesteia. Faptul că toate substanţele testate au demonstrat un efect
modulator susţine ipoteza centrală a tezei, şi anume că mitocondria
reprezintă un element cheie în durere. Deşi rezultatele co-administrării
de Zn/Mg şi Tramadol au indus o analgezie persistentă, am decis să nu
continuăm investigarea acestei asociaţii în studierea durerii neuropate
deoarece nu am reuşit să identificăm dacă mecanismul principal este
sinergic sau aditiv, şi, drept urmare, am decis să continuăm
experimentele studiului doctoral doar pe substanţe în asociere unică şi
nu în asociere combinată prin teste de allodinie, hiperalgezie şi durere
inflamatorie.
EVALUAREA MODULATORILOR MITOCONDRIALI ÎN
CADRUL TESTELOR DE ALLODINIE, HIPERALGEZIE ŞI
DURERE INFLAMATORIE
Fiecare grup acut sau cronic a fost alcătuit din câte 16 şoareci.
După injectare/gavaj, animalele au fost monitorizate periodic prin
testele Hargreaves şi von Frey pentru a identifica momentul în care
substanța administrată are cel mai mare efect; acest moment a fost
ulterior folosit pentru a administra injecția intraplantară sau orofacială
de formalină. Din cei 16 şoareci din fiecare grup, 8 au fost alocați
5
administrării intraplantare de formalină, iar ceilalți 8 au fost alocați
administrării orofaciale de formalină.
Experiment acut Dozele modulatorilor mitocondriali au fost alese în
funcție de studii tip dose-dependent efectuate anterior în cadrul
LCTM. Şoarecii au fost împărțiți în 8 grupuri în funcție de substanța
de administrat, după cum urmează: grup MBa - 5 mg/kgc i.p., grup
CoCl2a - 25 mg/kgc i.p., grup NTGa – 10 mg/kgc i.p., grup CCa -
120 mg/kgc gavaj, grup B2a – 100 mg/kgc i.p., grup AAa – 500
mg/kgc i.p., grup SFa - grup control i.p., grup Ua - grup control gavaj.
Toate dozele au fost cu administrare unică.
Experiment cronic Şoarecii au fost împărțiți în 8 grupuri, după cum
urmează: grup MBc - 5 mg/kgc i.p., 14 zile, grup CoCl2c - 12,5
mg/kgc i.p., 21 zile, grup NTGc – 10 mg/kgc, 14 zile, grup CCc - 120
mg/kgc gavaj, 14 zile, grup B2c – 50 mg/kgc, 28 zile, grup AAc – 500
mg/kgc i.p., 21 zile, grup SFc - grup control i.p. 28 zile, grup Uc -
grup control gavaj 14 zile.
REZULTATE
Datorită multitudinii datelor prezentate, am decis să
prezentăm rezultatele experimentului în cadrul tabelelor de mai jos
(tabel I şi tabel II). Valorile îngroşate reprezintă diferenţe statistic
semnificative între lotul tratat cu modulatorul mitocondrial şi lotul
martor. Pentru testările repetate evaluate prin RM ANOVA am
raportat doar p-ul din interacţiunea substanţă timp, nu şi rezultatele
pentru analiza post-hoc individualizată. P-ul raportat pentru testele
FOF şi FP este calculat prin analiza unpaired student t test.
Tabel I. Sumarizarea rezultatelor experimentului acut (FOF = testarea
administrării orofaciale de formalină, FP = testarea administrării
intraplantare de formalină)

Hg acut Vf acut FOF acut faza II FP acut faza II

MB 0.98 0.69 0.33 0.11
CoCl2 0.0002 0.46 0.052 0.27
NTG 0.07 0.8 0.33 0.001
CC 0.005 0.004 0.0001 0.98
AA 0.97 < 0.0001 0.15 0.02
B2 0.33 0.82 0.001 < 0.0001

6
 Tabel II. Sumarizarea rezultatelor experimentului acut (FOF = testarea
administrării orofaciale de formalină, FP = testarea administrării
intraplantare de formalină)

Hg cronic vF cronic FOF cronic faza II FP cronic faza II

MB 0.01 0.82 0.01 0.02
CoCl2 0.49 0.004 0.02 0.005
NTG 0.10 0.07 0.11 0.13
CC 0.0002 0.001 0.005 0.01
AA 0.58 0.72 0.46 0.04
B2 0.001 0.33 0.42 0.86
CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI
Testelele Hg şi vF evaluează latenţa de răspuns la stimuli non-
nociceptivi – nici stimulul termic şi nici cel mecanic nu au avut iniţial
o intensitate percepută ca dureroasă. Acest aspect permite evaluarea
răspunsului fibrelor C la stimulare, fibre care sunt implicate în
procesarea durerii în neuropatie (1), iar durerea generată de
administrarea de formalină este asemănătoare cu durerea întâlnită în
practica clinică şi poate fi considerată un echivalent al durerii
neuropate (2). În urma acestui experiment, am observat că în
administrare cronică, MB a avut un efect semnificativ pe latenţă la
stimuli termici şi pe ambele teste de durere la formalină. Relaţia dintre
MB şi mitocondrie, precum şi neurotropismul substanţei, combinate
cu experienţa clinică existentă deja în utilizarea MB la pacienţii
oncologici, sunt argumente în favoarea investigării MB în cadrul unui
model animal de DN post-PXT.
Administrarea de CoCl2 a avut efecte mixte asupra testelor de
hiperalgezie şi allodinie. În grupul care a beneficiat de administrare
cronică de CoCl2, s-a înregistrat o scădere progresivă a latenţei pentru
stimuli mecanici, însă nu s-au înregistrat modificări persistente în
latenţa de răspuns la stimuli termici. Aparent paradoxal,
comportamentul la durere a fost semnificativ redus în grupul CoCl 2c
în testele FOF şi FP, cel mai probabil datorită efectului hipoxiei
asupra sistemului nervos, cu modularea duală a receptorilor implicaţi
în trransmisia dureroasă de către adenozină şi scăderea ATP-ului (3).
NTG nu a influenţat decât faza a doua a testului la formalină
intraplantară în administrare acută. Curcumina a avut un efect
analgezic pe testele de durere inflamatorie în administrare acută şi
7
cronică. Efectul AA depinde mult de doză şi de condiţiile
organismului căruia îi este administrat. Lipsa de efect pe FOF ne face
să credem ca acţiunea AA în acest tip de durere nu este mitocondrială,
ci există alt mecanism responsabil. Vitamina B2 pare a fi eficientă în
administrare acută pentru scăderea intensităţii comportamentului
dureros la formalină, însă mecanismul esenţial pare a fi anti-
inflamator şi antioxidant şi nu stimulator mitocondrial.
După testarea preliminară a modulatorilor mitocondriali anterior
menționați, albastrul de metilen a fost considerat ca fiind cel mai
promițător potențial medicament şi a fost testat in vitro şi in vivo
pentru efectul asupra neuropatiei dureroase induse de paclitaxel.
VALIDAREA UNUI MODEL MURIN DE DURERE
NEUROPATĂ POST-PACLITAXEL
În funcție de dozele utilizate în literatură, s-au realizat 4 loturi
experimentale cu administrare intraperitoneală: grupul 1 (PXT1):
administrare de paclitaxel 1 mg/kgc, zilnic, o săptămână, grupul 2
(PXT2): administrare de paclitaxel 2 mg/kgc, zilnic, o săptămână,
grupul 5 (PXT5): administrare de paclitaxel 5 mg/kgc, zilnic, o
săptămână, grupul SF: administrarea unui volum echivalent de ser
fiziologic , zilnic, o săptămână. Pentru a evalua instaurarea DN la
animalele de experiență, au fost utilizate testele: Hot Plate, Tail Flick,
Hargreaves, şi Von Frey. După testarea inițială, animalele au fost
evaluate în ziua 3 şi ziua 7 de administrare a CHT, iar apoi o dată la 4
zile până la 23 de zile după ultima administrare a CHT (durată totală
experiment = 30 zile). Pe parcursul administrării de CHT/SF,
determinările au fost efectuate înainte de administrarea dozei zilnice.
REZULTATE
Lotul PXT 1 a avut comportament sugestiv pentru allodinie
mecanică mai târziu faţă de datele din literatură (la 2 săptămâni după
încheierea CHT). De asemenea, doza nu a modificat latenţa la TF, iar
la testările HP şi Hg a indus o scădere a latenţei la1-2 săptămâni după
CHT, cu tendinţa de recuperare la finalul experimentului. Grupul
PXT5 a înregistrat o scădere semnificativă a latenţei de răspuns la
testul von Frey, cu modificări încă din a 4-a zi de CHT şi cu scăderi
ale latenţei răspunsului la stimuli termici (testele Hg şi HP)
semnificativ diferite faţă de baseline.
8
 Sensibilitatea la stimulare termică prin Hot Plate a fost
statistic semnificativ mai mare în grupul PXT2 comparativ cu
controlul în ziua 3 post-CHT, ziua 7 post-CHT, şi ziua 23 post-CHT.
Comparativ cu valorile inițiale înregistrate pre-tratament (paired
student t test), pragul dureros a fost semnificativ mai scăzut începând
cu a 3-a zi după încheierea chimioterapiei şi până în a 15-a zi post-
CHT Efectul administrării de Paclitaxel 2 mg/kgc asupra testului Tail
Flick nu a fost semnificativ statistic - variația lotului PXT2 față de
valorile de bază nu a fost statistic semnificativă.
La testul Hargreaves, însă, analiza a relevat diferențe
semnificative între lotul PXT2 şi lotul martor începând din ziua 3
post-CHT. Din ziua 7 post-CHT, diferențele între loturi au fost
semnificative pentru toate determinările. Scăderea toleranței la durere
s-a menținut până la finalul experimentului (ziua 23) (fig.2).

Fig. 2. A= variația sensibilității la stimulul termic generat de Hargreaves pe parcursul

experimentului; B=variația sensibilității grupului tratat cu Paclitaxel exprimată în
PCB. Semnificația statistică - * neagră = statistic semnificativ diferit față de baseline;
* gri = statistic semnificativ diferit față de lotul martor.

La testul von Frey, animalele din lotul PXT2 au avut latențe

semnificativ diferite față de lotul martor. Lotul PXT2 a prezentat
sensibilitate mai mare la stimuli mecanici pe parcursul
experimentului.
CONCLUZII
În urma acestui studiu, am decis că modelul optim de DN
indusă de paclitaxel este cel obținut prin administrarea a 2 mg/kgc
9
zilnic timp de 7 zile. Au fost luate în considerare în vederea evaluării
efectului modulatorilor mitocondriali asupra ND testele Hot Plate,
von Frey şi Hargreaves.
EVALUAREA PRELIMINARĂ A EFECTULUI MB ÎN
NEUROPATIA DUREROASĂ INDUSĂ DE PACLITAXEL
Efectul precondiționării cu MB asupra ND post-PXT
Şoarecii au fost împărțiți în 2 loturi: grupul MB-PXT şi
grupul SF-PXT. După determinarea valorilor pre-tratament (baseline)
prin testele Hargreaves, Hot Plate şi von Frey, grupului MB-PXT i s-a
administrat i.p. MB 5 mg/kgc, zilnic, timp de două săptămâni, iar
grupul SF-PXT a primit ser fiziologic. După precondiționare, au fost
repetate testele comportamentale în ziua 14 a experimentului. Ulterior,
s-a inițiat administrarea de Paclitaxel 2 mg/kgc în ambele grupuri,
zilnic, timp de 7 zile, iar după încheierea administrării, animalele au
fost evaluate o dată la 4 zile începând cu ziua 4 şi până la ziua 24.
Efectul administrării concomitente de PXT şi MB asupra ND
Şoarecii au fost împărțiți în 2 loturi: grupul MB-c-PXT şi
grupul SF-PXT. După determinarea valorilor pre-tratament, ambele
grupuri au primit injecții i.p. zilnice de paclitaxel 2 mg/kgc timp de 7
zile. Concomitent, în grupul MB-c-PXT s-a administrat MB 5 mg/kgc
i.p., iar grupul SF-c-PXT a primit timp de o săptămână volum
echivalent de ser fiziologic. După încheierea administrărilor (ziua 7
experiment), au fost repetate testele comportamentale efectuate la
baseline. Ulterior, animalele au fost evaluate o dată la patru zile până
la ziua 23 post-CHT (ziua 30 experiment).
REZULTATE
În lotul de precondiţionare, la evaluarea allodiniei mecanice
(testul von Frey), analiza statistică a relevat diferențe semnificative
între loturi în ziua 12 post-CHT, efect care s-a menținut constant până
aproape de finalul experimentului. Sensibilitatea la stimulare termică
prin Hargreaves a fost statistic semnificativ mai mare în grupul SF-
PXT comparativ cu grupul MB-PXT în ziua 29 a experimentului,
diferență care s-a menținut semnificativă aproape pe tot parcursul
experimentului. În ceea ce priveşte efectul administrării de MB asupra
latenței la testul Hot Plate MB a avut un rol protectiv începând din
ziua 37 a experimentului.
10
 În lotul cu administrare concomitentă, la evaluarea
allodiniei mecanice (testul von Frey), analiza prin unpaired student t
test a relevat diferențe statistic semnificative între lotul MB-PXT şi
lotul SF-PXT în ziua 22 a experimentului (z 15 post-CHT), şi în ziua
26 (z 19 post-CHT). Pentru allodinia termică, în timp ce lotul tratat cu
paclitaxel a manifestat scăderea toleranței la stimulare, lotul MB-c-
PXT a prezentat o uşoară tendință analgezică, iar diferențele dintre
cele două grupuri au fost statistic semnificative începând cu ziua 7
post-CHT şi până la finalul experimentului, cu diferențe statistic
semnificative în zilele 7, 11, 15 şi 23 post-CHT. Pentru evaluarea prin
testul Hot Plate, analiza prin unpaired student t test a relevat diferențe
statistic semnificative între lotul MB-PXT şi lotul SF-PXT în ziua 26
a experimentului. S-a înregistrat o tendință de creştere a latenței de
răspuns la stimuli termici.
CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI
Ambele modele de administrare a MB au dovedit o oarecare
eficienţă în prevenţia ND post-PXT. Cu toate acestea, tratamentul
concomitent cu MB şi PXT s-a dovedit mult mai eficient decât
administrarea MB-ului înainte chimioterapiei, aspect sugerat de
existența unei scăderi statistic semnificative în timpul de răspuns la
stimulii mecanici în ziua 8 post-CHT la modelul de precondiționare cu
MB care nu se regăseşte şi la modelul de administrare concomitentă.
Rezultatele acestui experiment au fost prezentate echipei de
cercetare condusă de prof. dr. Guido Cavaletti din cadrul Universităţii
Milano-Bicocca. Analiza rezultatelor de către aceştia a dus la
propunerea de colaborare în vederea testării complexe a efectului MB
în DN post-PXT. Experimentele desfăşurate în cadrul DCTM sunt
prezentate şi discutate în următoarele două subcapitole ale tezei.
STUDII COMPLEXE ALE EFECTULUI MB ÎN DUREREA
NEUROPATĂ POST-PACLITAXEL
Şoarecii au fost împărțiți în 5 loturi şi au fost trataţi după cum
urmează: lot PXT – fără tratament primele două săptămâni, apoi 70
mg/kgc PXT i.v. o dată pe săptămână, timp de 4 săptămâni, lot MB
apoi PXT – MB 5 mg/kgc i.p. zilnic primele două săptămâni, apoi 70
mg/kgc PXT i.v. o dată pe săptămână, timp de 4 săptămâni, lot MB +
PXT – fără tratament primele două săptămâni, apoi 70 mg/kgc PXT
11
i.v. o dată pe săptămână şi MB 5 mg/kgc i.p. zilnic, timp de 4
săptămâni, lot MB – fără tratament primele două săptămâni, apoi 5
mg/kgc MB i.p.zilnic, timp de 4 săptămâni şi lot control – şoareci
naivi, fără tratament. Grupurile au fost evaluate din punct de vedere
comportamental (testul Hargreaves şi evaluarea sensibilităţii la rece –
testul Cold Plate - CP) şi electrofiziologic (viteza de conducere
nervoasă – NCV a nervului digital cu ajutorul elctromiografului) la
baseline şi după încheierea CHT. La finalul experimentului, toate
animalele au fost sacrificate pentru recoltarea de ţesuturi în vederea
evaluării următorilor parametri:
1. Morfometria şi morfologia nervului sciatic - prin disecţie, nervul
sciatic a fost izolat, şi s-a prelevat un segment de aproximativ 1
cm de la acelaşi nivel la animale din toate grupurile. Preparatele
au fost ulterior analizate cu ajutorul fotomicroscopului optic. Pe
scurt, toate fibrele mielinizate evaluabile într-o secţiune dată au
fost numărate, apoi diametrele acestor fibre (şi cel intern, şi cel
extern) au fost măsurate. Cu ajutorul diametrului axonal şi a
diametrului total, s-a realizat o histogramă a distribuţiei fibrelor şi
s-a calculat raportul dintre cele două diametre (aşa-numitul g
ratio, o măsură consacrată a demielinizării).
2. Studii imunhistochimice - prin disecţie, măduva lombară şi
ganglionii DRG ai animalelor de studiu au fost izolaţi şi incluşi în
parafină. Ulterior, probele au fost secţionate cu ajutorul unui
microtom în secţiuni de aproximativ 8 µm în vederea realizării
IHC pentru ATF3 şi c-fos.
3. Microscopie electronică - secţiuni ultrafine au fost obţinute din
probe selectate (DRG) cu ajutorul unui ultramicrotom,
contracolorate cu acetat de uranil şi citrat de plumb şi examinate
cu ajutorul microscopului electronic cu transmisie Philips CM-10.
REZULTATE
La evaluarea allodiniei mecanice, după încheierea CHT
(săptămâna 6 de experiment), grupurile PXT şi MB apoi PXT aveau
latenţe mai mici faţă de latenţele grupului control; grupul co-tratat cu
MB şi PXT (MB-c-PXT) a avut valori similare valorilor grupului
control. Pentru evaluarea sensibilităţii la rece, la 6 săptămâni de la
testarea iniţială, după administrarea de chimioterapie, sensibilitatea

12
grupului PXT a crescut semnificativ. Celelalte grupuri au rămas cu o
medie relativ similară celei de la baseline.
Pentru viteza de conducere nervoasă (fig. 3), am observat că
la încheierea CHT, grupul PXT avea o amplitudine a potenţialului
nervos semnificativ scăzută faţă de grupul control. Rezultate similare
au fost obţinute şi de către grupul precondiţionat cu MB, însă
amplitudinea grupului co-tratat cu MB şi PXT a fost similară cu
amplitudinea grupului control.
CTR
NCV
PXT

300 MB
M B apoi PXT
M B+PXT
A m p litu d in e

200

*
100 *

0
C TR P XT MB M B a p o i P XT M B + P XT

Fig. 3. Viteza de conducere nervoasă în grupurile experimentale după încheierea

chimioterapiei

Fig. 4 Modificările în grupul tratat c PXT faţă de modificările din grupul control

Din punct de vedere al morfologiei nervului sciatic, s-au înregistrat

calitativ mai puţine alterări structurale în secţiunile de nerv sciatic
analizate la şoarecii trataţi cu MB + PXT faţă de cei din grupul tratat
doar cu PXT. Deşi şi în grupul MB+PXT s-au observat celule
13
necrozate şi semne de injurie a tecii de mielină, acestea au fost mai
puţin marcante decât cele din grupul PXT (fig. 4).
% F IB R E G R A T IO

40
CTR
PXT
30
M B + PXT
% F IB R E

20

10

0
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

G - R A T IO

Fig. 5 Devierea raportului între diametrul extern şi intern în cazul şoarecilor trataţi
doar cu PXT

Morfometric, după 6 săptămâni de tratament, s-a observat o scădere

statistic semnificativă în grupul tratat cu PXT din punct de vedere al
grosimii fibrelor de mielină – acestea au rămas aproape de normal în
grupul MB + PXT şi au scăzut semnificativ în grupul tratat doar cu
PXT. Similar, raportul între diametrul inter şi cel extern al diametrelor
fibrelor nervoase a fost modificat în grupul tratat doar cu PXT fără a
se înregistra modificări în grupul PXT + MB (fig. 5).
Studiile imunhistochimice au fost doar calitative, deci nu
avem o măsură obiectivă a rezultatelor. Din punct de vedere al
imaginilor, însă, expresia c-fos la nivel medular a fost mult crescută în
grupurile tratate doar cu PXT comparativ cu grupurile care au
beneficiat de PXT + MB (fig. 6). Similar, ganglionii DRG din
grupurile tratate cu PXT au avut o expresie crescută a ATF3
comparativ cu DRG-urile şoarecilor trataţi cu MB + PXT.
Microscopia electronică a identificat leziuni semnificative în grupul
control. Din acest motiv, datele nu au putut fi cuantificate
corespunzător.
Cu toate acestea, se observă o mai mare distrucţie
mitocondrială in lotul tratat cu PXT decât în lotul control, aspect ce

14
confirmă ipoteza acestei teze, şi anume că PXT îşi exercită efectul
prin toxicitate mitocondrială.
CONCLUZIILE
EXPERIMENTULUI
Rezultatele obţinute în
cadrul determinărilor
comporta mentale sunt
similare celor obţinute în
cadrul experimen tului
realizat la LCTM, Iaşi.
Combinaţia cea mai
eficientă este reprezentată de
administra rea concomitentă
a MB şi PXT, iar
precondiţionarea cu MB nu
protejează semnificativ
împo triva ND-post PXT.
Rezultatele prezentate în
studiul de faţă validează
ipoteza conform căreia MB
are rol protector împotriva
ND post-PXT. Evaluarea
comportamen tală,
electrofiziologică, morfolo
gică şi morfometrică susţin
ipoteza de lucru.
Deoarece scopul tezei de
Fig. 6 Activarea neuronilor c-fos in doctorat este de a identifica un
grupurile de tratament – se observă
modulator mitocondrial
activarea importantă în grupurl tratat
neuroprotector utilizabil în
doar cu PXT fată de grupul tratat cu PXT
şi MB practica clinică, următoarea
ipoteză de verificat este cea
conform căreia MB nu interacţionează cu eficacitatea antineoplazică a
PXT. Pentru aceasta, cea mai uşoară metodă este evaluarea in vitro –
realizarea unui model experimental pe celule neoplazice cărora li se
administrează PXT.

15
EVALUAREA IN VITRO A ALBASTRULUI DE METILEN
Evaluarea neurotoxicității
Ganglionii spinali (DRG) au fost recoltați în mediu aseptic de
la șobolani Sprague-Dawley în stadiu embrionar; au fost apoi așezați
(câte 4) în plăci Petri de 35 mm, colagenate şi incubați în mediu AN2,
suplimentat cu 5ng/ml NGF, pentru două ore, pentru a permite
adeziunea ganglionilor la vas (4). După două ore, în mediul de cultură
au fost adăugate substanțe active - Paclitaxel (10 nM sau 100 nM),
MB (1 µM, 10 μM sau 100 µM) sau o combinație între Paclitaxel 100
nM și MB (1, 10 or 100 µM). Un grup de DRG nu a primit nimic
suplimentar mediului de cultură AN2 cu NGF și a fost folosit drept
control. DRG au fost evaluați la 24 și 48 de ore. Scăderea lungimii
neuritelor la 24 și 48h a fost exprimată procentual relativ la lungimea
neuritelor din grupurile control (5).
Evaluarea citotoxicității
Primul pas în evaluarea citotoxicității a fost reprezentat de
determinarea concentrației inhibitorii maximale (IC50) a PXT asupra
culturilor celulare MDAMB231. Fiecărui godeu i s-au adăugat diferite
concentrații de PXT, în intervalul 0.05 - 100µM; a fost evaluat
numărul de celule supraviețuitoare la 24 și 48h cu ajutorul colorării cu
sulforhodamină (SRB). După determinarea IC50 pentru PXT, celulele
au fost tratate cu diferite concentrații de MB (1, 10 sau 100 µM) sau
cu o combinație de MB (1, 10 sau 100 µM) și PXT (în concentrația
determinată ca fiind IC50). Celulele supraviețuitoare au fost evaluate
la 24 și 48h prin colorare cu sulforhodamină B (SRB) şi analizate cu
ajutorul unui spectrofotometru (SPECTROstar Omega, BMG
Labtech).
REZULTATE
Evaluarea neurotoxicității
După 24 de ore, tratamentul cu PXT 100nM a indus o scădere
semnificativă de 48.6% a lungimii medii a neuritelor comparativ cu
grupul control. Adăugarea de MB 10µM la PXT 100 nM a dus la o
creștere statistic semnificativă a lungimii neuritelor în comparație cu
PXT 100nM (p<0.0001). În cazul celorlalte două grupuri în care
tratamentul a fost PXT + MB, concentrațiile de 1 și 100 µM MB nu au
avut un efect protector împotriva neurotoxicității PXT, observându-se
o lungime medie a neuritelor de 162±5.7 uM și, respectiv, 173±5.3
16
uM. Grupurile care au primit exclusiv MB au fost similare cu grupul
control. Efectul protector al concentrației de 10µM MB a fost observat
și la 48h (fig. 7), (p<0.0001). Celelalte concentrații de MB nu au
protejat împotriva neurotoxicității PXT. Nu au fost înregistrate
diferențe statistic semnificative între grupul control și cele trei grupuri
MB (1 µM, 10 µM şi 100 µM).

A B

Fig. 7 – PXT 100 nM - 48 h (A) şi PXT 100 nM + MB 10 µM - 48 h (B)

Evaluarea citotoxicității
Valoarea IC50 pentru Paclitaxel în cazul liniei celulare
MDAMB231 a fost 38±9.1 µM la 24 ore și 12.6±10.4 µM la 48 ore.

CTR
M DAM B231 P XT 40 µM
PXT + M B 1 µM
100
PXT + M B 10 µM
PXT + M B 100 µM
s u p r a v ie u ir e % d in c o n t r o l

75

* *
*
*
50

25

0
C TR P XT 4 0 µ M P XT + M B 1 µ M P XT + M B 1 0 µ M P XT + M B 1 0 0 µ M

Fig. 8 – Supraviețuirea la 24h

17
 Tratamentul exclusiv cu MB a avut un efect antitumoral
nesemnificativ asupra celulelor canceroase. În cazul evaluării la 24h,
tratamentul cu 40µM PXT a dus la o supraviețuire celulară de 57.9%.
Adăugarea de MB la PXT a dus la scăderea valorii medii de
supraviețuire (fig. 8). La 48h, tratamentul cu 20 µM PXT a condus la
o supraviețuire celulară de 55.8%. Pentru celulele MDAMB231 tratate
cu o combinație de PXT și MB, supraviețuirea medie la 48h a fost
între 48.4% (concentrație 1 µM) și 50.5% (concentrație 100 µM).
CONCLUZIILE EXPERIMENTULUI
Din punct de vedere al neuroprotecţiei, adăugarea de MB în
mediul de cultură cu PXT a dus la o mai bună dezvoltare a neuritelor
ganglionilor DRG comparativ cu ganglionii expuşi exclusiv la PXT.
Doza intermediară de MB a indus un efect neuroprotector statistic
semnificativ; această doză este cea mai apropiată de dozele raportate
în studiile cu administrare MB in vitro şi cea mai apropiată de dozele
utilizate în practica clinică. Din punct de vedere al interacţiunii între
MB şi PXT, co-administrarea de MB şi PXT nu afectează acțiunea
chimioterapicului pe linii celulare de adenocarcinom mamar.
Evaluarea in vitro contribuie la fundamentarea ipotezei
conform căreia MB este util în profilaxia ND post-PXT, iar
administrarea sa la pacienţii neoplazici este sigură şi nu diminuează
eficienţa chimioterapiei.
DISCUŢII
În studiul de analiză preliminară, albastrul de metilen (MB) a
avut un intens efect analgezic în cadrul testului HP şi nici un efect în
cadrul testului TF (6). Acest rezultat se explică prin efectul
predominat supraspinal - inhibitori potenţi ai durerii cronice de tipul
duloxetinei au demonstrat un efect intens analgezic in cadrul durerii
mediată supra-spinal şi nu au fost eficienţi în cadrul testelor la durere
spinală (7). Efectul în platou înregistrat pe testul HP după
administrarea de MB este previzibil, având în vedere faptul că MB
este un neurotropic şi la o oră după administrare se regăseşte într-o
concentraţie de 50 de ori mai mare la nivelul creierului decât în
circulaţie (8).
Testarea efectului MB în allodinia mecanică şi hiperalgezia
termică a relevat că substanţa nu are efect în administrare acută, însă
18
induce o creştere a latenţei la stimuli termici, cu un interval până la
răspuns cu aproximativ 30% mai mare după 14 zile de la administrare.
Efectul preferenţial pe stimuli termici se explică probabil prin
activarea preferenţială de către stimulii termici a unor fibre nervoase
de mici dimensiuni, opioid-sensibile (9). Callaway&colab. au
administrat o doză unică de MB la şobolani şi au raportat că această
creştere a citocrom c oxidazei apare la 24 de ore de la tratament şi nu
este depistabilă la 1-2 ore după MB (10). Deoarece acest proces de
activare durează o perioadă de timp, evaluarea hiperalgeziei, allodiniei
şi durerii inflamatorii la 2 ore după administrarea de MB probabil a
fost înainte de instaurarea efectului MB pe structurile SNC. Rezultate
similare au fost obţinute şi pentru evaluarea efectului MB la durerea
după formalină (în administrarea intraplantară şi orofacială) –
substanţa nu a scăzut durata comportamentului dureros după o singură
doză însă a avut un efect semnificativ după 14 doze, cel mai probabil
datorită efectuării testării la 24 de ore după administrarea MB.
În acest context, am decis să testăm MB în durerea neuropată
post-paclitaxel în două variante de administrare – precondiţonarea
timp de două săptămâni urmată de chimioterapie şi co-administrarea
MB şi PXT. În timp ce ambele modele au demonstrat potenţialul
neuroprotector al MB – loturile ce au beneficiat de MB au avut latenţe
mai apropiate de normal – precondiţionarea s-a dovedit a fi mai puţin
eficientă decât administrarea concomitentă, probabil datorită variaţiei
concentraţiei plasmatice de MB în timp. Precondiţionarea cu MB are
efecte analgezice însă acestea devin nesemnificative după 24-48 ore
deoarece MB nu induce modificări adaptative în mitocondrie sau în
celulă (spre deosebire de CoCl2, pentru care modelul de
precondiţionare s-a dovedit a fi mai eficient).
In practica clinică, există un număr mare de studii care au
utilizat MB în scop analgezic. Astfel, MB a fost investigat în durerea
cronică de spate. Două studii publicate în 2011 şi 2010 au raportat
ameliorarea semnificativă a durerii de spate la pacienții cu modificări
de disc după administrarea intradiscală de MB (11,12). O altă direcţie
clincă de investigare a potenţialului analgezic al MB a fost utilizarea
sa în scăderea durerii după hemoroidectomie. Sim&colab au realizat
un studiu prospectiv în cadrul căruia au înrolat 70 de pacienţi. Autorii
au raportat o scădere statistic semnificativă a intensităţii dureroase şi a

19
necesarului de analgezice în post-operator la pacienţii care au
beneficiat de administrarea de MB (13). Salman&colab. au investigat
rolul analgezic al MB administrat înaintea injecţiei cu propofol -
procedură dureroasă pentru pacienţi în până la 90% din cazuri (14) –
şi au concluzionat că MB este mai eficient decât placebo, scăzând
frecvenţa experienţei dureroase la peste 50% din pacienţi (15). Autorii
au explicat rezultatul prin efectul de inhibare a răspunsului
venodilatator în sistemul circulator. În cadrul experimentelor in vivo,
analiza comportamentală, electrofiziologică, imunhistochimică şi
morfologică au confirmat efectul neuroprotector al MB.
Studii fundamentale preexistente au demonstrat că PXT
induce o scădere statistic semnificativă a vitezei de conducere
nervoasă şi că acest deficit persistă timp de minim 2 săptămâni după
încheierea CHT (16). Testele electrofiziologice permit identificarea
atât a degenerărilor axonale, cât şi a injuriilor cu consecinţe
demielinizante. În studiul nostru, determinarea vitezei de conducere
nervoasă a relevat o scădere statistic semnificativă indusă de PXT, iar
rezultatele obţinute după chimioterapie susţin aceeaşi ipoteză generată
de testele comportamentale – MB administrat o dată cu PXT
protejează nervul pe parcursul chimioterapiei, inclusiv administrată în
doze foarte mari, şi permite menţinerea potenţialului de acţiune şi
funcţionalităţii celulare. Morfometria a relevat o modificare a raţiei g
între grupul PXT şi grupurile control şi PXT + MB, cu modificări
similare în grosimea tecii de mielină. Rezultatele sunt concordante cu
cele din literatură – Benbow&colab. au raportat că PXT în doză de 30
mg/kgc de trei ori pe săptămână, timp de 2 săptămâni scade cu 30%
densitatea axonilor, creşte fragmentarea mielinei şi creşte procentul
modificărilor degenerative axonale în nervul sciatic (17). Modificările
sunt dependente de doză - un alt studiu nu a evidenţiat prezenţa unor
modificări la microscopie electronică la şoarecii trataţi cu o doză de
şapte ori mai mică decât cea utilizată în prezentul studiu (18).
Analiza imunhistochimică a fost doar calitativă şi nu a permis
evaluarea completă a efectului MB. ATF3 (activating transcription
factor 3) este un membru al familiei ATF/CREB de factori de
transcripţie fiind considerat un marker specific pentru injuria
neuronală (19), chiar şi în absenţa modificărilor patologice structurale
(20). In studiul nostru, deşi nu am realizat o evaluare cantitativă, am

20
observat un număr mai mic de celule ATF3+ în ganglionii şoarecilor
trataţi cu PXT + MB decât în cei ai şoarecilor care au beneficiat doar
de chimioterapie cu PXT. C-fos este, de asemenea, un marker al
activării neuronilor nociceptivi la nivel medular; studiile arată că după
lezarea nervului, chiar şi stimuli non-nociceptivi pot induce activarea
c-fos, semn al neuropatiei (21). Expresia c-fos este crescută după
lezarea nervului sciatic (22) în modele animale de DN, aspect care a
fost relaţionat cu apariţia senzitizării centrale (23). În studiul nostru,
am remarcat o concentraţie crescută de neuroni c-fos pozitivi evaluaţi
prin imunfluorescenţă în grupul tratat doar cu PXT şi o scădere a
acestora în grupul co-tratat cu PXT şi MB. Aceste rezultate sunt în
concordanţă cu literatura existentă, care a identificat o creştere a
expresiei c-fos în laminele 1 şi 2 (24) ale cornului posterior în condiţii
de lezare nervoasă, localizare în care am identificat şi noi creşterea
numărului de neuroni pozitivi pentru acest marker.
A doua etapă a studiului desfăşurat în Italia a presupus
evaluarea in vitro a efectului MB din punct de vedere al
neurotoxicităţii şi citotoxicităţii (interacţiunea între CHT şi MB,
pentru a evalua dacă MB nu scade efectul citostatic al paclitaxelului).
Din punct de vedere al efectului neuroprotector al MB, adăugarea sa
în mediul de cultură a stimulat dezvoltarea neuritelor. Atamna&colab
au realizat un model de senescenţă celulară cu ajutorul fibroblastelor
IMR 90 pe care le-au tratat cu MB timp de 4 zile şi au observat că
suplimentarea mediului de cultură cu MB duce la întârzierea
senescenţei celulare (25). MB a demonstrat activitate protectivă şi în
alte modele celulare. În 2011, Legault&colab. au evaluat efectul MB
asupra celulelor pacienţilor cu sindrom Leigh şi au arătat că MB este
înalt protector în acest context, restaurând activitatea COX, crescând
producţia de ATP şi îmbunătăţind semnificativ supravieţuirea celulară
(26). De asemenea, MB a fost investigată în modele in vitro de boală
Alzheimer, observându-se că substanţa inhibă formarea filamentelor
tau şi fibrelor Abeta (27) şi că induce semnalizarea apoptotică în
celulele anormale, cu expresie tau crescută (28). Din punct de vedere
al citotoxicităţii, supravieţuirea celulelor tumorale la 24 de ore a fost
relativ apropiată între grupurile tratate cu PXT şi MB vs. PXT. Deşi
nu au fost diferenţe semnificative între loturile non-control, procentul
de celule supravieţuitoare în grupurile tratate cu MB şi PXT a fost mai

21
mic decât în grupurile tratate doar cu PXT. Acest efect se poate
explica prin efectul MB exercitat mitocondrial, cu situs diferit faţă de
efectul PXT, la nivelul fusului de diviziune. O altă posibilă explicaţie
constă in teoria relativ recentă conform căreia deficitul mitocondrial ar
putea contribui la rezistenţa celulei neoplazice în faţa chimioterapiei
(29). Celula canceroasă este înalt adaptată metabolic şi probabil
modifică metabolismul mitocondrial astfel încât acesta să nu mai fie
sensibil la stimuli apoptotici (30). Agenţii care restaurează funcţia
mitocondrială par a acţiona sinergic cu terapiile oncologice clasice.
Spre exemplu, dicloracetatul, un modulator mitocondrial ce inhibă
fosforilarea piruvat dehidrogenazei şi stimulează intrarea piruvatului
în ciclul acizilor tricarboxilici (31) este în prezent investigat ca agent
unic sau în combinaţie cu chimioterapia în cancere ale sistemului
nervos (astrocitoame), melanom şi cancer mamar (32).
CONCLUZII
1. Mitocondria reprezintă o ţintă terapeutică inovatoare în terapia
durerii, cu potenţial imediat aplicabil în practica clinică
2. Principalii modulatori mitocondriali (MB, CoCl2, NTG,
curcumina, vitamina C şi vitamina B2) influenţează experienţa
dureroasă şi nocicepţia prin efect spinal sau supra-spinal sau, cel
mai frecvent, mixt. Aceştia au un efect pro- sau anti- nociceptiv
asupra durerii, în funcţie de efectul lor asupra mitocondriei şi de
tipul de durere evaluată (nociceptivă, inflamatorie, neuropată).
3. Reproducerea unui model de durere neuropată indusă de
chimioterapia cu paclitaxel este fezabilă şi relativ facilă la şoarecii
din rasa BALB/c şi se poate realiza în laboratorul nostru
4. Precondiţionarea animalului de experienţă cu CoCl2 a simulat o
expunere hipoxică, ceea ce a dus la mecanisme adaptative şi la un
răspuns diminuat la stimuli dureroşi în testele de hiperalgezie,
allodinie şi durere inflamatorie.
5. Administrarea de MB la pacienţii oncologici cu neuropatie este
sigură şi nu afectează eficacitatea paclitaxelului, fiind observată
chiar o creştere a eficienţei co-administrării MB-PXT pe celulele
neoplazice studiate in vitro
6. MB a demonstrat un efect neuroprotectiv atât in vitro (prin studii
asupra DRG embrionar tratat cu PXT), cât şi in vivo (prin studii

22
 comportamentale, microscopice, electrofiziologice şi imunhisto
chimice) şi are potenţialul de a fi utilizat în practica clinică
7. Experimentele realizate în cadrul prezentului studiu doctoral sunt,
după ştiinţa doctorandului, printre primele evaluări ale relaţiei
dintre mitocondrie şi durere în studii fundamentale in vivo. De
asemenea, efectul precondiţionării hipoxice asupra DN nu a mai
fost până în prezent raportat. Dintre modulatorii mitocondriali,
MB a fost pentru prima dată evaluat ca potenţial agent profilactic
al durerii neuropate indusă de paclitaxel în cadrul studiilor
prezentate în această teză.
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Teza deschide o serie de perspective de cercetare, în principal
relaţionate cu efectul modulatorilor mitocondriali asupra durerii în
general şi a durerii neuropate în special. Astfel, oricare din
modulatorii investigaţi în faza preliminară a experimentelor poate fi în
continuare evaluat în alte tipuri de durere sau chiar în DN indusă de
PXT sau de alte chimioterapice. Mai mult, co-administrarea acestor
modulatori sau a mineralelor esenţiale (Mg, Zn) ar putea constitui
subiecte de cercetare cu aplicabilitate clinică importantă.
MB-ul poate fi testat, cu probabilitate mare de succes, în
durerea neuropată indusă de alcaloizii de vinca (vincristină,
vinblastină) deoarece această clasă de chimioterapice are un mecanism
de acţiune înrudit cu al paclitaxelului şi, cel mai probabil îşi realizează
neurotoxicitatea printr-un mecanism similar.
O altă direcţie de cercetare deschisă de cercetarea doctorală
este utilizarea clinică a MB-ului în profilaxia DN post-PXT – având în
vedere că această substanţă a fost îndelung folosită în terapia umană,
siguranţa administrării sale este deja stabilită, iar studiile prezente au
demonstrat că nu diminuează efectul antineoplazic al chimioterapiei
cu paclitaxel. Mai mult, efectul co-administrării MB şi chimioterapiei
asupra eficienţei antineoplazice merită investigată mai în profunzime.
Experienţa căpătată în cadrul studiului doctoral, alături de
validarea unui model de DN (primul din laboratorul nostru, după
ştiinţa doctorandului) va facilita realizarea altor studii de către echipa
noastră sau alţi doctoranzi interesaţi în studii oncologice pe modele
fundamentale.

23
LISTĂ LUCRĂRI
1. ARTICOLE ISI

 Enhanced analgesic effects of tramadol and common trace

element coadministration in mice. Alexa T, Marza A,
Voloseniuc T, Tamba B. J Neurosci Res. 2015
Oct;93(10):1534-41. doi: 10.1002/jnr.23609.
 Incidence of chemotherapy discontinuation and
characteristics of elderly patients with non-small cell lung
cancer treated with platinum –based doublets. Alexa T, Anti
L, Luca A, Miron L, Alexa ID. Contemporary Oncology
2014;18(5):340-343. doi:10.5114/wo.2014.45293.
 Preconditioning with cobalt chloride modifies pain perception
in mice. Alexa T, Luca A, Dondas A, Bohotin CR. Exp Ther
Med. 2015 Apr;9(4):1465-1469.
2. ISI PROCEEDINGS

 The effect of single-dose intraperitoneal and intrathecal

administration of Cobalt Chloride on three animal pain
models. Alexa T, Dondas A, Bohotin CR, Luca A. 2nd
Annual International Conference on Neuroscience and
Neurobiology Research ISSN 2345-7813. ISI proceedings of
CNN 2014 - pp 18-22.
 The effects of glyceryl trinitrate in different experimental
models of pain. Bohotin CR, Alexa T, Luca A, Dondas A,
Mungiu O. 2nd Annual International Conference on
Pharmacology and Pharmaceutical Sciences (PHARMA 2014
- ISI proceedings ISSN 2345-783X pp: 50-53).
 The effects of the Methylene Blue on Nocifensive Behaviors in
Mice. Dondas A, Luca A, Alexa T, Bohotin CR. International
Conference on Pharmacology and Pharmaceutical Sciences
(PHARMA 2014 - ISI proceedings ISSN 2345-783X pp: 54-
59).
3. ARICOLE INDEXATE ÎN BAZE INTERNAŢIONALE DE
DATE

 The effects of riboflavin and methylene blue on nociception

and visceral pain. Luca A, Alexa T, Dondaş A, Crăcană IM,
Bădescu M, Bohotin C. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi.
2015 Apr-Jun;119(2):466-72.
 The effect of cobalt chloride preconditioning on paclitaxel-
induced peripheral neuropathy. Alexa T, Luca A, Bohotin C,
Lupchian D, Stanciuc I, Bădescu M. Rev Med Chir Soc Med
Nat Iasi. 2015 Apr-Jun;119(2):447-53.
 Pain modulation by curcumin and ascorbic acid in mice. Luca
A, Alexa T, Dondas A, Andron G, Badescu M, Alexa ID,
Bohotin CR. The Medical-Surgical Journal 2014; 118 [2]:
346-351.
 The analgesic effect of vitamin C in different pain models.
Luca A, Alexa T, Dondaş A, Luca G, Crăcană IM, Bădescu
M, Bohotin C. Archives of the Balkan Medical Union 2014;
49:189-192.
4. CAPITOLE CARTE

 Durerea în oncologie. Alexa T, Miron L. In: Maria

Magdalena Leon, Mungiu OC (editori) „Terapie durerii –
aspecte actuale” Editura Gr.T. Popa, UMF Iaşi 2014:148-165.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacol Rev. 2001
Dec;53(4):597–652.
2. Ellis A, Benson N, Machin I, Corradini L. The rat formalin test: Can it predict neuropathic
pain treatments? Proc Meas Behav. 2008;324–5.
3. Burnstock G. Purinergic signalling: pathophysiology and therapeutic potential. Keio J Med.
2013 Jan;62(3):63–73.
4. Rodriguez-Menendez V, Gilardini A, Bossi M, Canta A, Oggioni N, Carozzi V, et al.
Valproate protective effects on cisplatin-induced peripheral neuropathy: an in vitro and in
vivo study. Anticancer Res. Jan;28(1A):335–42.
5. Scuteri A, Nicolini G, Miloso M, Bossi M, Cavaletti G, Windebank AJ, et al. Paclitaxel
toxicity in post-mitotic dorsal root ganglion (DRG) cells. Anticancer Res. Jan;26(2A):1065–
70.
6. Luca A, Alexa T, Dondaş A, Crăcană I-M, Bădescu M, Bohotin C. The Effects Of Riboflavin
And Methylene Blue On Nociception And Visceral Pain. Rev medico-chirurgicală̆ a Soc
Medici ş̧̧̧ i Nat din Iaş̧̧̧ i. Jan;119(2):466–72.
7. Iyengar S, Webster AA, Hemrick-Luecke SK, Xu JY, Simmons RMA. Efficacy of
duloxetine, a potent and balanced serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor in persistent
pain models in rats. J Pharmacol Exp Ther. 2004 Nov;311(2):576–84.
8. Peter C, Hongwan D, Küpfer A, Lauterburg BH. Pharmacokinetics and organ distribution of
intravenous and oral methylene blue. Eur J Clin Pharmacol. 2000 Jun;56(3):247–50.
9. Bian D, Ossipov MH, Zhong C, Malan TP, Porreca F. Tactile allodynia, but not thermal
hyperalgesia, of the hindlimbs is blocked by spinal transection in rats with nerve injury.
Neurosci Lett. 1998 Jan 30;241(2-3):79–82.
10. Callaway NL, Riha PD, Bruchey AK, Munshi Z, Gonzalez-Lima F. Methylene blue
improves brain oxidative metabolism and memory retention in rats. Pharmacol Biochem
Behav. 2004 Jan;77(1):175–81.
11. Peng B, Pang X, Wu Y, Zhao C, Song X. A randomized placebo-controlled trial of intradiscal
methylene blue injection for the treatment of chronic discogenic low back pain. Pain. 2010
Apr;149(1):124–9.
12. Kim S-H, Ahn S-H, Cho Y-W, Lee D-G. Effect of Intradiscal Methylene Blue Injection for
the Chronic Discogenic Low Back Pain: One Year Prospective Follow-up Study. Ann
Rehabil Med. 2012 Oct;36(5):657–64.
13. Sim H-L, Tan K-Y. Randomized single-blind clinical trial of intradermal methylene blue on
pain reduction after open diathermy haemorrhoidectomy. Colorectal Dis. 2014
Aug;16(8):O283–7.
14. Nathanson MH, Gajraj NM, Russell JA. Prevention of pain on injection of propofol: a
comparison of lidocaine with alfentanil. Anesth Analg. 1996 Mar;82(3):469–71.
15. Salman AE, Salman MA, Saricaoglu F, Akinci SB, Aypar Ü. Pain on injection of propofol:
a comparison of methylene blue and lidocaine. J Clin Anesth. 2011 Jun;23(4):270–4.
16. Wozniak KM, Wu Y, Farah MH, Littlefield BA, Nomoto K, Slusher BS. Neuropathy-
inducing effects of eribulin mesylate versus paclitaxel in mice with preexisting neuropathy.
Neurotox Res. 2013 Oct;24(3):338–44.
17. Benbow SJ, Cook BM, Reifert J, et al. Effects of Paclitaxel and Eribulin in Mouse Sciatic
Nerve: A Microtubule-Based Rationale for the Differential Induction of Chemotherapy-
Induced Peripheral Neuropathy. Neurotox Res. 2016 Feb;29(2):299–313.
18. Gilardini A, Avila RL, Oggioni N, Rodriguez-Menendez V, Bossi M, Canta A, et al. Myelin
structure is unaltered in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. Neurotoxicology.
2012 Jan;33(1):1–7.
19. Tsujino H, Kondo E, Fukuoka T, Dai Y, Tokunaga A, Miki K, et al. Activating transcription
factor 3 (ATF3) induction by axotomy in sensory and motoneurons: A novel neuronal marker
of nerve injury. Mol Cell Neurosci. 2000 Feb;15(2):170–82.
20. Xu JJ, Diaz P, Bie B, Astruc-Diaz F, Wu J, Yang H, et al. Spinal gene expression profiling
and pathways analysis of a CB2 agonist (MDA7)-targeted prevention of paclitaxel-induced
neuropathy. Neuroscience. 2014 Feb 28;260:185–94.
21. Gao Y-J, Ji R-R. c-Fos and pERK, which is a better marker for neuronal activation and
central sensitization after noxious stimulation and tissue injury? Open Pain J. 2009 Jan
1;2:11–7.
22. Bester H, Beggs S, Woolf CJ. Changes in tactile stimuli-induced behavior and c-Fos
expression in the superficial dorsal horn and in parabrachial nuclei after sciatic nerve crush.
J Comp Neurol. 2000 Dec 4;428(1):45–61.
23. Salvemini D, Little JW, Doyle T, Neumann WL. Roles of reactive oxygen and nitrogen
species in pain. Free Radic Biol Med. 2011 Sep 1;51(5):951–66.
24. Lee WT, Sohn MK, Park SH, Ahn SK, Lee JE, Park KA. Studies on the changes of c-fos
protein in spinal cord and neurotransmitter in dorsal root ganglion of the rat with an
experimental peripheral neuropathy. Yonsei Med J. 2001 Feb;42(1):30–40.
25. Atamna H, Nguyen A, Schultz C, Boyle K, Newberry J, Kato H, et al. Methylene blue delays
cellular senescence and enhances key mitochondrial biochemical pathways. FASEB J. 2008
Mar;22(3):703–12.
26. Legault J, Larouche P-L, Côté I, Bouchard L, Pichette A, Robinson BH, et al. Low-
concentration methylene blue maintains energy production and strongly improves survival
of Leigh syndrome French Canadian skin fibroblasts. J Pharm Pharm Sci a Publ Can Soc
Pharm Sci Société Can des Sci Pharm. 2011 Jan;14(3):438–49.
27. Taniguchi S, Suzuki N, Masuda M, Hisanaga S, Iwatsubo T, Goedert M, et al. Inhibition of
heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J
Biol Chem. 2005 Mar 4;280(9):7614–23.
28. Congdon EE, Wu JW, Myeku N, Figueroa YH, Herman M, Marinec PS, et al.
Methylthioninium chloride (methylene blue) induces autophagy and attenuates tauopathy in
vitro and in vivo. Autophagy. 2012 Apr;8(4):609–22.
29. Bhat TA, Kumar S, Chaudhary AK, Yadav N, Chandra D. Restoration of mitochondria
function as a target for cancer therapy. Drug Discov Today. 2015 May;20(5):635–43.
30. Dey R, Moraes CT. Lack of oxidative phosphorylation and low mitochondrial membrane
potential decrease susceptibility to apoptosis and do not modulate the protective effect of
Bcl-x(L) in osteosarcoma cells. J Biol Chem. 2000 Mar 10;275(10):7087–94.
31. Haugrud AB, Zhuang Y, Coppock JD, Miskimins WK. Dichloroacetate enhances apoptotic
cell death via oxidative damage and attenuates lactate production in metformin-treated breast
cancer cells. Breast Cancer Res Treat. 2014 Oct;147(3):539–50.
32. Kankotia S, Stacpoole PW. Dichloroacetate and cancer: new home for an orphan drug?
Biochim Biophys Acta. 2014 Dec;1846(2):617–29.