BIOFIZICA

Curs 4
Metode in functie de principiul biofizic
• 1. Metode electrokinetice
• 2. Cromatografia
• 3. Centrifugarea si ultracentrifugarea
• 4. Liofilizarea
• 5. Metode kinetice
 Istoric
Liofilizarea Procedeul de liofilizare a fost inventat în 1906 de biofizicianul
francez Arsene Arsonvel şi F. Bordás - asistentul lui - în laboratorul
de Biofizică de la College de France din Paris.

• Uscarea la rece—tehnic cunoscuta sub denumirea de

liofilizare sau criodisecare – este un proces de
deshidratare, utilizat ca si procedeu de conservare a
materialelor perisabile sau pentru a transforma
materialalul intr-o forma mai convenabila pentru
transport si manipulare
• uscarea la rece(Freeze-drying) presupune inghetarea
materialului urmata de reducerea presiunii mediului
inconjurator, ceea ce va duce la sublimarea apei -
trecerea din faza solida direct in faza gazoasa
• 4 etape: pretratarea, inghetarea, uscarea primara, si uscarea
secundara
Pretratarea- tratarea Inghetarea – racirea materialui Uscarea primara, Uscarea secundara,
materialului inainte de sub temperatura punctului scadera presiunii cu pentru indepartarea
inghetare (concentrarea triplu. Racirea se va face rapid cativa mbar (10-20 urmelor de apa care
produsului, adaugarea de pentru a evita formarea mm Hg) va determina nu a inghetat
componente care sa ofere cristalelor de gheata . initierea
stabilitate produsului, sa-i Temperatura de inghetara fenomenului de
mentina calitatile) aceasta va este intre −50 °C si −80 °C sublimare
duce la scaderea presunii (azot lichid- punct de fierbere
vaporilor solventului sau la – 195°C)
cresterea suprafetei active a
acestuia)
Punctul triplu – punctul de temperatura si presiune pentru
care toate cele trei stari de agregare coexista

Punctul triplu al apei este

constanata in baza careia s-a
definit Kelvinul (K) in cadrul SI
Aplicaţii: Medicină şi industrie farmaceutică
 Aplicaţii: Medicină şi industrie farmaceutică
➢ Procedeu de conservare a produselor biologice fragile (fragmente de ţesut sau organe, hormoni, vaccinuri,
enzime, sau a componentelor sanguine, plasmă, ser, gamaglobuline, anticorpi, hormoni ... antibiotice,
medicamente, etc)
➢ În stadiul actual al cunoştinţelor, liofilizarea sângelui integral nu este posibilă, deoarece pentru a nu
distruge celulele roşii din sânge, îngheţarea trebuie să fie efectuată la o temperatură foarte scăzută (în caz
contrar, cristalele de gheaţă distrug celulele), care ar obliga o sublimare la un nivel de vid sub 1 μbar.
➢ Prezervarea RBC :
➢ Utilizarea unor bufferi speciali a putut duce la obtinerea unei rate de supravituire a RBC de 96 % dupa uscarea la rece...dar cu o
rata de 60 % de Hb oxidata. Utilizarea unor susbtante ( pe baza de glicerol- cu rol protectiv ) a putut duce la scaderea ratei de
oxidare sub 15 % dar cu o rata de supravietuire mai scazuta aprox. de 80 %- dar pentru volume mici de sange (Journal of
Trauma and Acute Care Surgery: 2011;70:61-64)\
➢ criodisecare cu ajutorul semnaleor de radiofrecventa – se pare ca a dus la imbunatatirea calitatii sangelui astfel conservat dar
utilizrea acestor produse este limitata la situatii de urgenta imediata/trauma (Biopreserv Biobank. 2012 Aug;10(4):386-94 )
 Alte aplicaţii
• Proprietatile produselor uscate Exemplele cele mai cunoscute în
la rece: alimentaţie sunt: cafeaua instant
• Sigilarea acestora permite (Nescafe) şi supele instant
prevenirea reabsorbtiei umezelii- Prânz liofilizat pentru alpinişti, expediţii,
astfel substanta poate fi depozitata cosmonauţi
la temperatura camerei multi ani.
• Prezervarea este posibila datorita
faptului ca reducerea semnificativa
a cantitaii de apa duce la inhibarea
activitatii microorganismelor .
• Uscarea la rece modifica foarte
putin structura prodiselor
comparativ cu alte metode de
deshidratare (la cald)
Metode in functie de principiul biofizic
• 1. Metode electrokinetice
• 2. Cromatografia
• 3. Centrifugarea si ultracentrifugarea
• 4. Liofilizarea
• 5. Metode kinetice
 Metode kinetice- masuraarea viscozitatii
lichidelor

Viscozitatea = parametru cantitativ ce se refera la rezistenta

la curgere a fluidelor
- Este urmare a fortelor de frecare interioare-
intermoleculare
- reologia studiaza modificarea formei, a fluxului de
materie, a elasticitatii, viscozitatii si plasticitatii fluidelor
- sunt doua tipuri de viscozitate: curgere laminara curgere turbulenta
- Absoluta (dianmica )-η (Pa s)- curgere laminara
- Cinematica (η/ρ)- se mai numeste difuzibilitate de
moment ( m2/s)
Viscositatea lichidelor -Metode
Metode roationale:
- Placi paralele
- Cilindri concentrici
- Con si placa (tensiune in fir)
- de tip mixer
Metode curgere/cadere:
- Tub capilar
- Tub capilar sub presiune
- Tub orizontal
- Cadere bila in coloan lichid
∆ 𝑉 𝜋 𝑅4 𝜌𝑔ℎ
=
∆𝑡 8 𝑙η
Legea Poiseulle-
R- raza tubului capilar
Ρ- densitate lichid
η- viscositate lichid
h- inaltimea
l-lungime tub capilar
V- volum de lichid
t-timp de curgere
Metode in functie de principiul biofizic
• 6. Metode optice (utilizeaza lumina):
a) fotocolorimetrie
b) turbidimetrie
c) nefelometrie
d) fluorimetrie
e) polarimetrie
f) refractometrie
g) flamfotometrie
7. Metode electrice : a) polarografie, b) pH-metrie, c)
conductometrie- PW
8. Difractia cu raze X
Fotocolorimetria
• Se bazeaza pe legea Lambert- Beer
• masoara Extinctia- metoda cantitativa

legea Lambert-Beer
I = I0· e-ε cd; E = ε Cd
E- extinctia
I= intensitate fascicul emergent
Io= intensitate fascicul incident
d= distanta travesata de lumina
c = concentratia probei
ε = coeficient molar de extinctie
 Turbidimetria
Turbidimetria masoara cantitatea de lumina transmisa (diferenta fiind absorbita de catre
particulele dintr-o solutie), in vederea determinarii concentratiei.

Immunoturbidimetria o metoda
utilizata in practica clinica
pentru cuantificarea proteinelor
serice nedetectabile prin alte
metode. In general se utilizeaza
pentru cuantificarea
complexelor antigen-anticorp.
 Nephelometria
se refera la masurarea luminii imprastiate (difuzate)
de catre o solutie colidala foarte diluata.

Utilizarea fasciculelor de lumina care au o alta

directie decat cea a fascicolului initial sau altfel
spus iluminarea din lateral (lumina difuzata) poate
fi considerata o manifestare a efectului Tyndal
Efectul Tyndall
 Fluorimetria
• Se bazeaza pe fenomenul de fluorescenta

Excitarea unor grupari cromofore (prin absorbtie energetica)

cu fascicule de energie ridicata (UV) vor determina trecerea
electronilor din stratul de valenata pe pe un nivel energetic
superior (excitat- strat de conducere) ; aici are loc o
pierdere energetica (cel ma adesea termica), restul de
energie absorbita va fi emisa – lumina fluorescenta – dar
avand un nivel energetic mai scazut – va avea o lungime de
unda mai mare.
Diferenta dintre lungimea de unda excitatorie si ce
fluorescenta se numeste deplasare Stokes
Spectrosopia fluorescentei- analiza luminii
florescente
• FCS –(Fluorescence correlation spectroscopy)
• FRAP – (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
• FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
• Single particle tracking (SPT) şi Single dye tracing (SDT)
FCS – (Fluorescence correlation spectroscopy)
• apreciaza cinetica reactiilor chimice si a coeficientilor de
difuzie prin masurarea variatiilor fluorescentei pe volume
mici.
FRAP – (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
• studiaza recuperarea mobilitatii proteinelor la nivel
celular
FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
• apreciaza modificarile induse la nivel membranar in
stransa legatura cu mobilitatea moleculelor-fluiditatea
membranei
Single particle tracking (SPT) şi Single dye
tracing (SDT)-
• Vizualizarea
directa a
moleculelor
fluorescente
• necesita camere
video de inalta
rezolutie (CCD-
charge coupled
device)
 Polarimetria
• Utilizeaza lumina polarizata ,se bazeaza pe legea lui Biot si permite
masurarea concentratiei solutiilor optic active -metoda cantitativa
𝐷
Legea lui BIOT 𝛼 = 𝛼 20 cd

α- unghiul de rotatie al
planului de polarizare
αD 20 – constanta
C- concentratia substantei
optic active
D- grosimea probei
(parcursa de lumina)
Lumina polarizata
Lumina polarizata

Reflexie sub unghi Brewster

Dubla refractie- birefringenta

Dubla refractie- birefringenta-

prisma Nicol
Substanta optic activa
Substanta care poate roti planul luminii polarizate- datorita
asimetriei moleculare

in sens orar- dextrogir

In sens antiorar- levogir

Orice obiect are o imagine in onglinda (cu exceptia vampirilor de la

TV), daca aceasta imagine este superpozabila cu obiectul atunci
molecula nu este optic activa
Refractometria
• Se bazeaza pe fenomenul de reflexie/refractia a luminii-
masoara unghiul limita (reflexie totala)
n2n1
Legea refractiei
n1 sin(i) = n2 sin(r’),
n1 – indice de refractie mediu incident
i r n2 – indice de refractie al mediul emergent
n1 i- unghi de incidenta
r’- unghi de refractie

n2 Legea reflexiei
r’ i=r
i- unghi de incidenta
r- unghi de reflexie
Refractometria Reflexie totala
n1 sin(i) = n2 sin(r’)
i=l (unghi limita)
n2n1
n2n1
n2n1
r’ = 90⁰

sin l = n1/n2

i r
REFLEXIE
n1

n2
REFRACTIE
r’
Flam-fotometrie Metoda de anliza calitativa si cantitativa

Aducerea in stare ionizata (excitatata)a

probei cu ajutorul flacarii si analiza
luminii emise- Lucrare practica Analiza
Spectrala
 Dispersia optica – separarea fasciculelor de lumina de
Analiza spectrala diferite culori (lungimi de unda) pe baza fenomenului de
refractie
• Analiza lungimii/frecventei
radiatiilor electomagnetice = • Indice de refractie; marime relativa
𝑐
spectroscopie n= ;
𝑣

• Analiza radiatiilor electromagnetice c- viteza luminii in vid (300.000m/s)

in domeniul vizibil- analiza spectrala v- viteza luminii in mediu respectiv

in vizibil- fenomenul de dispersie

n1 sin(i) = n2 sin(r’),
n1 – indice de refractie mediu incident
n2 – indice de refractie al mediul emergent
i- unghi de incidenta
r’- unghi de refractie
Metode in functie de principiul biofizic
6. Metode optice (utilizeaza lumina):
a) fotocolorimetrie
b) turbidimetrie
c) nefelometrie
d) fluorimetrie
e) polarimetrie
f) refractometrie
g) flamfotometrie
7. Metode electrice : conductometrie-Lucrare practica- Dializa
8. Difractia cu raze X ( a se vedea cursul 2)
 Conductometrie

• Modul in care un conductor poate conduce curentul electric

Conductor de ordin I Conductor de ordin II

Conductometrie- marimi implicate
Rezistenta electrica- Rezistivitatea electrica-
𝐿
R=ρ , 𝑅 SI =Ω ρ SI = Ω.m
𝑆
ρ- rezistivitatate- proprietate ρ- rezistivitatate-
specifica materialului
L- lungimea conductorului,
Conductibilitatea electrica
1
S – Suprafata de sectiune λ= , λ – conductibilitate;
ρ
Conductivitatea
1 λ SI = S/m
S= , S – conductivitate;
𝑅
𝑆 SI = S (simens)
Metode in functie de principiul biofizic
9. Microscoape optice:
• Microscopul optic obisnuit
• Microsopul cu imersie
• Microscopul in contrast de faza
• Microscopul fluorescent
• Ultramicroscopul- microscopul pe fond intunecat
• Microscopul polarizant
Microscopul optic
Putere de
rezolutie

Apertura numerica
Microscopul optic
• Cu imersie 𝜀=
1,22λ
2 𝑛 sin 𝑢

1
𝑃𝑟 =
𝜀
crestera valorii n de la 1
la 1,55 prin introducerea
unei picaturi de ulei de
cerdu, va duce la scaderea
ε, si deci la cresterea
rezolutiei microscopului
(Pr)
Microscopul optic
• In contrast de faza

Creste contrastul probelor biologice prin recuperarea de

drum optic (interpunerea in calea razelor de lumina dupa ce
au trecu prin proba a unei lame sfert sau jumatate de unda,
care va adduce o parte din razele de lumina defazate (de
trecerea prin medii optice cu densitati diferite) in faza- si
inducerea interferentei constructive
 Are la baza fenomenul de
Microscopul optic fluorescenta a gruparilor
comofore ce se gasesc in probele
de examinat/ Fluorescenta poate
• Cu fluorescenta fi indusa artficial prin marcare cu
molecule fluorescente sau poate
fi naturala
 Microscopul optic
• Ultramicroscop- sau pe fond intunecat

iluminarea preparatului cu ajutorul condensorului

cardioid –si inducerea efectului TYNDALL permite
vizualizarea unor structuri prin iluminare latareala
 Microscopul optic
Cu lumina polarizata
Microscopul optic
confocal
• Microscopie laser de baleaj (confocal
laser scanning microscopy -CLSM)
• crestera rezolutiei optice si a
contrastului prin analiza
computerizata a unor sectiuni din
preparat cu ajutorul unui iluminator
pinhole laser.
• capturarea mai multor imagini 2 D la
diferite adancimi permit reconstructia
3 D a structuri vizualizate (tomografie
optica)
 Microscopie confocala
• Pincipiul imaginilor confocale a fost patentat principle of in
1957 de Marvin Minsky in ideea de a suplini cateva limitari
ale microsopiei prin fluorescenta
In microscopia prin fluorescenta, intreg In microscopia confocala, utilizarea
specimenul este inundat cu semnal sureselor de iluminare punctiforma (laser) si
excitator, astfel toate structurile formarea imaginii intr-un anumit plan focal-
fluorescente sunt excitate in acelasi timp, pe obtinerea de imagini in planuri focale
o suprafata relativ mare cu un background diferite cu ajutorul Computerului permite
nefocusat (ce duce la cresterea zgomotului- obtinerea de imagini 3D si tot odata se
imagine necalara) elimina semnalul nefocalizat din
background.
Doar fluorescenta produsa in planul de
focalizare va fi luata in considerare pentru
formarea imaginii.
Microscopie confocala