GENETICA BACTERIANA

BACTERIOFAGUL
VARIABILITATEA GENETICA LA BACTERII

1
 GENETICA BACTERIANĂ
Ereditatea: însuşirea tuturor vieţuitoarelor de a transmite caracterele
specifice speciei la urmaşi

Variabilitatea: apariţia unor caractere diferite de cele ale genitorilor.

Suportul material al eredităţii: ADN.

Structura şi replicarea acestuia este similiară cu cea de la celulele
eucariote.
Totalitatea determinantilor genei bacteriene reprezinta genomul
bacterian
Genomul asigura ereditatea bacteriei, avand capacitatea de a
transmite descendentilor caracterele de specie
Totalitatea acestor caractere reprezinta informatia genetica, adica
genotipul
2
Caracterele exprimate formeaza fenotipul
 Organizarea materialului genetic la bacterii

Repliconi = formaţiuni genetice ce se replică independent

A. celula bacteriana are un singur cromozom, format dintr-un

singur lant de AND dublu catenar, elicoidal
– in general, bacteriile au un singur replicon, reprezentat de
intregul cromozom
exceptii: Rhodobacter sphaeroides, Vibrio cholerae - au mai multi repliconi

B. elementele genetice extracromozomiale

 plasmidele
 genomul bacteriofagilor

C. elementele genetice transpozabile

 fragmentele de inserţie
 transpozonii).
3
Cromozomul bacterian haploid = echivalent nuclear

codifică informaţiile absolut necesare supravieţuirii speciei în condiţii normale

 organizarea “supercoil” sau “supertwist” a ADN (dublu spiralată spre dreapta şi

suprahelicată spre stânga) asigură “împachetarea” economică a ADN şi o
configuraţie optimă activităţii funcţinale a ADN (replicare, transcripţie,
recombinare).

4
 O
C N
HN C Guanina ADN = poli-deoxiribonucleotid
5’ terminal CH
H2N-C C
OH N N
5’
O P O CH2 NH2
O C
OH 4’ 1’
N CH 5’
Citozina
3’ 2’
C CH
O O N
O P O CH2 O
O
O C CH3 3’
HN C Timina
C CH
O O N
O P O CH2 NH2
legături fosfat O
O C N
diesterice N C
Adenina
CH
3’ – 5’ HC C
O N N
O P O CH2
O
O
3’
5
3’ terminal OH
• Cele 2 lanţuri sunt ANTIPARALELE,
adică au sensuri opuse: - un lanţ se răsuceşte de la 5’ la 3’
- al doilea lanţ se răsuceşte de la 3’ la 5’
5’ 3’

• Datorită complementarităţii
structurale raportul molecular
A+G=C+T → (A + G) / (C + T) = 1
Curbura mare
A+C=G+T → (A + C) / (G + T) = 1

această caracteristică asigură

menținerea moleculei în conformație de
dublu helix!!
Curbura mică

Proporţia de baze complementare este

constantă în cadrul unei specii. Raportul
adenină-timină/guanină-citozină (AT/GC)
serveşte drept criteriu taxonomic de bază în
clasificarea modernă a bacteriilor. 3’ 5’ 6
 DECI
ADN este constituit din 2 catene polideoxiribonucleotidice asociate prin
punţi de hidrogen, dispuse elicoidal, constituind un dublu helix
H
H N O H N H
C C C C
Citozină
C
N C N H N C-H
N C C N
N H O
Guanină H

H Timină
N N H O CH3
H
C C C C
C
N C N H N C-H

N C C N
H O
Adenină

7
Perechile de baze azotate sunt situate în centrul helix-ului iar
resturile fosfat sunt situate în exterior

~20 Å

8
We have discovered the secret of life!

Proclamation by Francis H. C. Crick to patrons

of The Eagle, a pub in Cambridge, England
(1953)

1962 –Premiul Nobel pentru Medicină

James D. Watson (1928)

Francis Crick ( 1916 – 2004)
Maurice Wilkins (1916 - 2004)

9
 Analiza prin difracţie de raze X a ADN din timus de viţel
Rosalind Franklin şi Raymond Gosling, King’s College London, 1952

Rosalind Franklin
1920–1958

Photo 51
10
 Replicarea ADN
• are ca rezultat dublarea materialului genetic
• Asigură reproducerea fidelă a informaţiei
genetice conţinută în cele două catene de ADN
• Molecula parentală, bicatenară se disociază şi
cele două catene servesc fiecare ca matriţă
pentru biosinteza pe bază de
complementaritate a 2 noi catene => o nouă
moleculă de ADN identică cu cea veche
• Enzimele de replicare: ADN polimeraze (I, II şi
III - au specificitate de acţiune) şi ADN ligaze
• Mononucleotidele se leagă între ele în direcţia
5’ → 3’
• Este nevoie de ADN preformat (“primer”) care
să iniţieze reacţia + Mg2+

BIOSINTEZĂ REPLICATIVĂ SEMICONSERVATIVĂ 11

 Formaţiunile genetice extracromozomiale
Plasmidele : molecule circulare de ADN autonome, libere în citoplasmă
care se replică independent de cromozom

 conjugative - se pot transfera singure la alte bacterii (plasmidele R)

 neconjugative - care nu pot părăsi ele însele bacteria de origine, ci numai

prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu
plasmidul care codifică secreţia de beta-lactamază la S.aureus)

 episomi, care se pot integra prin recombinare în cromozomul bacterian,

pierzându-şi autonomia de replicare (plasmidul F sau factorul de fertilitate).

12
 determinanţii genetici esenţiali ai plasmidelor codifică
informaţiile legate de replicarea lor autonomă
 determinanţii accesori codifică caractere fenotipice
neesenţiale supravieţuirii celulei bacteriene în condiţii
naturale
• gene de transfer (tra),
• gene de rezistenţă la antibiotice (factorul R),
• gene de secreţie a unor toxine etc.

13
 Plasmide de interes medical
• A. Plasmidele de virulenţă poartă determinanţii genetici ai unor
factori de virulenţă
– secreţia de enterotoxina (termolabilă şi termostabilă)
– factorul de colonizare la Escherichia coli,
– hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis şi
E.coli
– exfoliantina la S. aureus
– gena de invazivitate la Shigella

14
B. Plasmidele R -de rezistenţă (Factorul R) sunt molecule circulare de
ADN care constau în esenţă din două regiuni genetice:

 genele care codifică rezistenţa la antibiotice “R”, unice sau multiple

(prin aglomerarea mai multor gene de rezistenţă R, pe acelaşi
plasmid, prin fenomenul transpoziţiei repetate de material genetic)

 genele “RTF” care conferă

plasmidului capacitatea
de a se transfera RTF

R determinant 15
 Peste 90% din tulpinile de spital prezintă o rezistenţă de tip
plasmidic:
 familia Enterobacteriaceae, genurile:Escherichia, Salmonella,
Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia
 genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella,
Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides,
Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, şi
Corynebacterium.
 Plasmidele prezente la bacilii gram-negativi sunt mai mari decât
cele evidenţiate la bacteriile gram-pozitive.

16
C. Plasmidul F –plasmid de de sex – factor de fertilitate
- conţine genele de transfer”tra”
-se pot transmite prin conjugare-mediază transferul
de gene de la o celulă donor la una receptor
-în funcţie de prezenţa factorului
 bacterii F-, lipsite de factorul F, denumite celule femele şi
care sunt receptoare de material genetic,
 bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca
plasmid în citoplasmă şi care sunt celule donoare,
 bacterii Hfr, care au factorul F+ integrat în cromozom, de
asemenea masculine,
 bacterii F ‘, care au factorul F+ ca plasmid autonom, după
ce acesta a fost integrat în cromozom şi l-a părăsit rupând
un fragment ADN din cromozom.

17
• F- Hfr
F-
• F+ A B
A B
• F’ E D
C
E D C
• Hfr
F’ F+
A BC C D A B
C
D D
E E

18
 Bacteriofagii

“phagein” (gr.) = a manca

Descrisi prima data in 1915

19
 Bacteriofagii

virusuri care pazaritează bacteriile

“mancatori de bacterii”

Morfologie.
 un cap hexagonal alcătuit dintr-un
înveliş proteic caracteristic virusurilor
(capsida) şi adăposteşte ADN
 un gât
 o prelungire numită picior (coadă).
Coada este un cilindru rigid învelit într-
un manşon proteic asemănător
miozinei* şi se termină cu o placă
hexagonală ce conţine o enzimă de
tipul lizozimului**. De placa bazală se
aprind 6 fibre cu rol în fixarea
bacteriofagului pe suprafaţa bacteriei.
*miozina = proteina contractila a fibrei musculare 20
**lizozim = enzima bacteriolitica ce lizeaza peretele bacterian
 Cap, capsidă

Structura
bacteriofagului Manşon Coa
contractil dă

Fibrele

Placa
bazală
21
 Infecţia celulei gazdă cu bacteriofag

 Adsorbţia fagului

 Ataşarea ireveversibilă-prin
existenţa unor receptori de perete
specifici

 Contracţia manşonului

 Injectarea acidului nucleic

22
 Tipuri de bacteriofagi
 Genomul fagic pătruns în celulă duce la sinteza unor bacteriofagi
identici cu cei din care a provenit ADN.
 ADN-ul se replică –ribozomii bacterieni vor sintetiza proteinele
capsidale şi ale cozii
 Asamblarea noilor componente –bacteriofagul părăseşte celula=
 bacteriofagi litici sau virulenţi – fagi care se multiplică în interiorul
celulei -gazdă, lizează celula şi eliberează fagii progeni=ciclu litic;
produc moartea celulei gazda

 lizogeni sau temperaţi: fagi care nu distrug celula-gazda; se

integrează în cromozomul celulei gazdă; ADN-ul viral incorporat se
numeste profag; ori de cate ori celula-gazda se divide, ADN-ul viral
se va copia la celulele-fiice rezultate; la un moment dat, acest tip
de bacteriofagi pot deveni virulenti, intrand intr-un ciclu litic.

23
1 Attachment

24
1 Attachment

2 Entry of phage
DNA and
degradation of
host DNA

25
1 Attachment

2 Entry of phage
DNA and
degradation of
host DNA

3 Synthesis of viral
genomes and
proteins

26
 1 Attachment

2 Entry of phage
DNA and
degradation of
host DNA

Phage assembly

4 Assembly

3 Synthesis of viral
genomes and
proteins

Head Tail Tail fibers 27

 1 Attachment

2 Entry of phage
DNA and
degradation of
5 Release host DNA

Phage assembly

4 Assembly

3 Synthesis of viral
genomes and
proteins

Head Tail Tail fibers 28

 Ciclul litic al unui bacteriofag

6 7
5
3
1 4

29
 Daughter cell
Phage with prophage
The phage injects its DNA.
DNA
Cell divisions
produce
population of
Phage DNA bacteria infected
Phage circularizes. with the prophage.
Bacterial
chromosome Occasionally, a prophage
exits the bacterial
chromosome,
initiating a lytic cycle.

Lytic cycle Lysogenic cycle

The bacterium reproduces,
The cell lyses, releasing phages. copying the prophage and
Lytic cycle Lysogenic cycle transmitting it to daughter cells.
is induced or is entered Prophage

New phage DNA and proteins Phage DNA integrates into

are synthesized and the bacterial chromosome,
assembled into phages. becoming a prophage.

30
 Consecinţele lizogeniei

 profagul codifică el însuşi unele caractere pe care le dobândeşte

bacteria lizogenă.
 toxigeneza la bacilul difteric care este codificată de un profag
ce se află în cromozomul bacterian. Tulpinile de bacili difterici
care nu sunt lizogenizate de acest profag, nu sunt capabile să
secrete toxina şi sunt, deci, nepatogene
 transducţia- transmiterea de material genetic prin intermediul
bacteriofagilor

31
 Variabilitatea la bacterii
Este o latură a geneticii -importantă în medicina
practică si in industria farmaceutica
• Mutaţia
• Transfer de material genetic
– Transformare
– Transducţie
– Conjugare
• Transpoziţie
32
 Mutaţia
• Modificări spontane ale genomului (modificări ale secvenţei de
nucleotide din genă)produse de : raze X, UV, agenţi alchilanţi
– Punctiformă –afectează 1 nucleotid
– Inserţia (adăugare a sute de nucleotide)
– Deleţia (pierdere )
• Asigură:
• rezistenţa la chimioterapice,
• structură antigenică modificată,
• pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi,
• pierderea capacităţii de sinteză a unui metabolit

33
34
 II. Variabilitatea la bacterii
Este o latură a geneticii -importantă în medicina
practică
• Mutaţia
• Transfer de material genetic
– Transformare
– Transducţie
– Conjugare
• Transpoziţie
35
 Transferul de material genetic

Transformarea
– Reprezintă transferul de material genetic
de la o celulă donor la una receptor sub
forma de ADN pur, eliberat fie prin liza
celulei donor, fie prin extracţie chimică
– 1928 - Fred Griffith.
– Streptococcus, Haemophilus, Bacillus,
Neisseria, Salmonella
– se petrece nu numai între tulpinile
aceleiaşi specii, ci şi între specii diferite
– se modifică structura peretelui celular,
care devine mai poros, încărcat
electropozitiv, favorizând legarea ADN-lui
străin
– are loc în medii unde trăiesc mai multe
specii bacteriene(colon) şi sunt puse în
libertate cantităţi mai mari de de ADN
– Se practică azi în tehnici de inginerie
genetică 36
Transformation of Bacillus subtilus

Heteroduplex DNA

37
 Transducţia

Transfer de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta,

mediat de bacteriofagi

Transductia este de 2 tipuri:

Transducţia generalizată – transferul oricarei gene
Transducţia specializată – transferul unei gene specifice

38
Transducţia generalizată – transferul
oricarei gene
 este mediată de fagii virulenţi, litici,
care după pătrunderea în celula
bacteriană se multiplică şi determină liza
celulei gazdă.
 în timpul lizei celulei bacteriene
cromozomul acesteia se fragmentează
 ocazional: un fragment cu o
dimensiune apropiată de cea a
genomului fagic se integrează în capsida
bacteriofagului, în locul genomului fagic.
 aceşti fagi pot pătrunde în alte celule
bacteriene injectîndu-le ADN-ul, ce
provine de fapt din genomul celulei
donoare. ADN-ul se va integra în
cromozomul celulei receptoare prin
recombinare, conferindu-i acesteia
caractere noi:
 rezistenţa la chimioterapice,
proprietăţi ce ţin de patogenitatea
bacteriei etc
39
Transducţia specializată – transferul unei
gene specifice
mediată de fagii temperaţi.
 După pătrunderea în celula bacteriană a

ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta

se inseră în cromozom prin recombinare
sub forma de profag
 În anumite condiţii are loc un proces de
de-represie şi genomul bacteriofagic
părăseşte cromozomul bacterian devenind
din nou autonom si iniţiază un ciclu litic
 când părăseşte cromozomul bacterian
poate detaşa din acesta un fragment de
ADN care va rămâne legat de genomul
bacteriofagic
 bacteriofagul va putea intra în altă celulă
integrându-se în cromozomul acesteia tot
sub forma de profag.
Fragmentul provenit de la prima celulă
bacteriană poate să codifice diferite
caractere
rezistenţa la antibiotice,
secreţia unor enzime, toxine etc., ce
se vor manifesta fenotipic la noua 40
bacterie gazdă.
 Conjugarea

 transferul de material genetic de la o bacterie

donoare la una receptoare printr-un proces de
împerechere, ce se realizează prin contactul
direct dintre cele două celule.
• O celula (“mascul”) doneaza ADN, iar
“perechea” (“femela”) primeste genele
• Se formeaza o punte citoplasmatica intre cele
doua celule, numita “sex pilus”
• “maleness” (“masculinitate”) = proprietatea
unei celule bacteriene de a forma puntea
citoplasmatica si de a dona ADN

 Prin conjugare se pot transmite plasmide,

precum şi gene cromozomiale (prin intermediul
factorului F+) 41
LE 18-17

Sex pilus 5 µm
42
43
 II. Variabilitatea la bacterii
Este o latură a geneticii -importantă în medicina
practică
• Mutaţia
• Transfer de material genetic
– Transformare
– Transducţie
– Conjugare
• Transpoziţie
44
 Transpozitia
Barbara Mc Clintock, 1931, 1952, 1983(“gene săltăreţe”)
•Fragmentele de inserţie (IS)

ABCDEFG Transpozază GFEDCBA

 fragmente mici de ADN (fac parte in mod normal din plasmid/cromozom)

 cu limite structurale bine precizate
 se pot integra repetat în mai multe situsuri dintr-un genom, se pot muta dintr-un loc in
altul in cadrul aceluiasi genom.
Transpozoni (Tn)
Enzima = transpozaza
Constau in 2 IS
conţin şi alte gene decât cele ce codifica transpoziţia

Este unul dintre

IS Gene de rezistenţă IS
mecanismele ce sta la
IS Gene de rezistenţă IS
baza rezistentei
multimedicamentoase 45
46
 IMPORTANTA
variabilitatii genetice a bacteriilor

47
 Ingineria genetică
•Existenţa vectorilor (plasmide, bacteriofagi şi în ultimul timp
descoperirea existenţei unor transpozoni ce se pot transmite de la o
celulă bacteriană la alta) permite transferul de gene celulei bacteriene,
ceea ce consituie baza ingineriei genetice.
•Bacteria preferată a ingineriei genetice este E.coli, care în mod natural
nu este capabilă de transformare, dar căreia prin clonare i s-au introdus
în genom cei mai diverşi determinanţi genetici provenind de la
organisme îndepărtate filogenetic, cum sunt omul şi animalele.
•Prin această tehnică se introduc în genomul bacterian gene care
codifică sinteza unor substanţe ca, de exemplu, interferoni, insulină, STH
etc., a căror obţinere pe cale chimică ar fi fie imposibilă, fie foarte
costisitoare.

MEDICAMENTE BIOLOGICE
48
To tackle the increase in resistance in many common
bacterial pathogens.

Genomic is providing a new strategy by revealing new

molecular targets and peptides that are giving rise to
novel antimicrobial drug.

49
Key steps in the genomics driven antibiotic drug
discovery process

50
 Aplicaţiile biotehnologiei moleculare în
diagnosticul clinic
• Au permis apariţia unei noi
discipline: diagnosticul molecular
– reprezentând utilizarea probelor
de acizi nucleici în diagnosticul
bolilor
– boli infecţioase,
– neoplasme,
– boli ereditare
• O altă aplicaţie : amprenta ADN -
permite diferenţierea indivizilor
prin utilizarea unor fragmente
minuscule de ţesut sau probe de
sânge
51