Metode de numărare a microorganismelor

(Saccharomyces ellipsoideus)

Autori: Bană Mihai Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Diana, Udrea Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

INTRODUCERE

Determinarea încărcăturii microbiene dintr-o probă de analizat se realizează pe de o parte pentru

controlul calităţii în ceea ce priveşte prezenţa şi nivelul microorganismelor, iar pe de altă parte,
pentru aprecierea nivelului activităţii unei populaţii microbiene, utilă în industrii(întocmirea curbei
de creştere).
Cuantificarea încărcăturii microbiene a unei probe se poate realiza prin:
- procedee optice cu ajutorul microscopului, determinând numărul total de microorganisme (fără a
departaja celulele moarte de cele vii, capabile să se dezvolte);
- metode biologice care ţin cont de multiplicarea microorganismelor, determinând numărul de
germeni vii prezenţi în probă. (Pag 74. Camelia Filofteia Diguţă, Florentina Matei; Microbiologie
generală, Tehnici de laborator. )

MATERIALE ȘI METODE
Materiale: - H2Od;
- tuburi Eppendorf pentru realizarea diluţiilor;
- plăci Petri ca mediu de însămânţare;
- lamă Thoma;
- Spectrofotometru;
- Colony counter
- Cultură Saccharomyces ellipsoideus 17
Metode:

1. Determinarea numărului total de celule utilizând lama Thoma

Numărul de microorganisme dintr-un mililitru de probă se calculează astfel:
X= (a *4*106*c)/ b; unde : X - nr.de celule dintr-un mililitru de lichid;
a- nr.de celule numărate în pătratele luate în considerare;
b- nr.de pătrățele în care s-a făcut numărarea(5*16=80);
c- inversul diluției făcute în proba de analizat;
4*106- coeficient pentru exprimarea rezultatului la 1 ml.

2. Spectrofotometrie
Determinarea densităţii optice(D.O.) a probei la lungimea de undă λ=450nm.

3. Tehnica determinării unităților formatoare de colonii(UFC)

Formula de calcul: N=m*c*10; unde:

N - U.F.C,nr.celulelor viabile/ml probă;
m - media aritmetică a coloniilor numărate pe 3 plăci însămânțate din aceeași diluție;
10- coeficient pentru raportara rezultatului la 1 ml de probă

Tabelul cu orele de prelevarii si metodele de numarare

Tulpina: Saccharomyces ellipsoideus 17

T(h) Lama Thoma D.O UFC Log Lama Log UFC
Thoma
0 3.5*10^3 0.298 2.5*10^4 3.544068 4.39794

24 2*10^5 1.253 4.5*10^5 5.30103 5.653213

48 3*10^5 2.483 6.2*10^5 5.477121 5.792392

 Saccharomyces ellipsoideus
7
6
5
log 10 UFC/ml

4
3 Thoma
2 UFC
1
0
0 10 20 30 40 50 60
Timp(h)

Fig. 1 – Curba de crestere pt Saccharomyces ellipsoideus (1)

Saccharomyces ellipsoideus
3

2.5

2
D.O.

1.5

1 Spectro

0.5

0
0 10 20 30 40 50 60
Timp(h)

Fig. 2 – Curba de crestere pt Saccharomyces ellipsoideus (2)

Fig. 3 T(h): 0 Fig. 4 T(h): 24

Fig.5 T(h): 48
Concluzii:

Prin intermediul acestui experiment practice, au fost inoculate celulele din cultura pura de
Saccharomyces ellipsoideus intr-un mediu steril, in scopul determinarii vitezei de acumulare a
biomasei pentru tulpina analizata.
Curba de crestere este cea care ne ofera informatii despre viteza de multiplicare a drojdiei,
insa din cauza numarului limitat de determinari, rezultatele nu reflecta cu exactitate viteza de
dezvoltare a tulpinii supuse analizei.
 Articol

Methods
Volume 7, Issue 2, April 1995, Pages 177-186

The Detection and Measurement of Base and Nucleotide Excision Repair in

Cell-Free Extracts of the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autori: WangZhigangWuXiaohuaFriedbergErrol C.

Abstract

Excision repair of DNA is a major cellular mechanism to correct DNA lesions produced by a variety
of physical and chemical agents. The availability of a cell-free system is expected to provide a
powerful tool with which to study the complex biochemical pathways of excision repair in
eukaryotes. Here we describe such a cell-free system in the yeast Saccharomyces cerevisiae that
supports both nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) in vitro. Detailed
methods and protocols are provided for the preparation of yeast cell-free extracts, damaged DNA
substrates, in vitro NER assays, and in vitro BER assays, with an emphasis on technical aspects.
NER and BER detected in this cell-free system apparently reflect the complete repair pathways.
 Determinarea numărului total de germeni aerobi - carne
(Salam de vară)

Autori: Bană Mihai Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Diana, Udrea Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

INTRODUCERE

Prin aceasta metoda, numarul de drojdii si mucegaiuri se apreciaza indirect, pe baza coloniilor
generate de celulele acestor microorganisme prezente in proba de analizat, care se formeaza cand
proba sau o dilutie a acesteia vine in contact cu un mediu nutritiv gelozat, dupa termostatare la 25°C
timp de 72 de ore.

Salamul de vară, aşa cum ne spune şi denumirea, a fost gândit pentru consum în sezonul cald:
suficient de rezistent la temperatura mai ridicată a verii, suficient de uscat pentru a rămâne ferm şi
elastic, cu structură plăcută, fără grăsime migrată din membrană.
Trebuie consumat la temperatura ambiantă ori uşor prăjit (cum este potrivit să procedăm dacă nu am
avut posibilitate de păstrare la rece).

MATERIALE ŞI METODE

Materiale: - proba de salam;

- bisturiu;
- foarfeca;
- pipeta automata;
- mediu slab agarizat;
- balon Erlemeyer.
Fig.1: Proba in balon Erlemeyer Fig. 2: Proba ambalata
Metoda

Tehnica încorporării:
Proba de analizat este încorporată si dispersată într-un mediu slab agarizat, care se repartizează
steril într-o placă Petri.
Utilizări: izolarea germenilor anaerobi sau microaerofili din probe cu densitate microbiană redusă.
După perioada de incubare, coloniile izolate apar în profunzimea mediului şi se pot distinge prin
formă, dimensiuni, culoare, etc.(Camelia Filofteia Diguţă, Florentina Matei; Microbiologie generală,
Tehnici de laborator. Pag. 69)

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Pe placile Petri utilizate in analiza probei de salam avem un număr prea mare de colonii ce nu
pot fi numărat și vom nota cu : T.N.T.C (too numerous to count);

Fig.2 : Mediu YPG Fig. 3: Mediu Geloza simpla

Solutie: Repetarea metodei dilutiilor zecimale de doua ori pentru a putea obtine rezultate relevante.
Astfel, avem posibilitatea numararii coloniilor germenilor aerobi in scopul declararii produsului ca
fiind CONFORM sau NECONFORM, in functie de standardul impus.
 Determinarea bacteriilor coliforme
(Lapte de la dozator)

Autori: Bană Mihai Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Diana, Udrea Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

INTRODUCERE

Se executa prin metoda titrului prin insamantarea a cate 1 mL din 3 dilutii successive pe 2
placi petri si termostatare la 37C timp de 48 ore. In functie de numarul placi petri pozitive se
stabileste cifra caracteristica si numarul probabil de coliformi.
SR ISO 4832/2009
Acest Standard Internaţional stabileşte directivele generale privind obţinerea numărului de
bacterii coliforme din produsele alimetare destinate consumuluiuman, prin numărarea direct a
coloniilor caracteristice obţinute pe un mediu solidspecific
Se consideră colonii prezumtive de bacterii coliforme, acele colonii care prezintă coloraţie
roz şi au un diametru mai mare de 0,5 mm.Se citesc plăcile cu colonii tipice care conţin între 10 şi
150 de colonii. (https://www.scribd.com/doc/133145240/BACTERII-COLIFORME-ppt)
Laptele este o proba ‘’raw’’, nepasteurizat si neprelucrat luat de de la dozatorul de la intrarea
in campus.

MATERIALE ŞI METODE
Materiale:
-Lapte
-Eprubete cu 9mL apa distilata
-Placi Petri
-Mediu (MacConkey)
-Pipeta automata
Metoda
- se prelevează 1ml probă de lapte, în condiții aseptice;
- se pregătesc două plăci Petri pentru fiecare diluție;
- se relizează două dilutii zecimale din proba luată in analiză
- cu o pipetă sterilă se însămânțează 1 mL din ultimele două diluții pe cele două plăci
Petri;
- în fiecare placă Petri se distribuie mediul MacConkey;
- inoculul se omogenizează în mediu cu mare grijă,lăsându-l să se solidifice;
- se incubează plăcile la 37◦C.

REZULTATE SI DISCUTII

In placa insamantata din a doua dilutie au aparut colonii ce prezinta haoul dar este necesara
confimarea suplimentara pentru a stabili prezenta bacteriilor coliforme .

Fig.1: Haloul format de bacteriile prezente in proba de analizat

Confimare
Se prelevează câte 2 colonii minim din fiecare placă încare s-au identificat colonii tipice de
bacterii coliforme şi se inoculează în câte un tub cu câte 10 ml cu tub Durham.
Se considera coliformi - bacteriile care formează gaz în tubuleţele Durham .

Fig.2: Dioxidul de carbon degajat de celulele inoculate

Concluzie
Având în vedere faptul că pe placa noastră au aparut doar 4 colonii, înseamnă că produsul analizat
se încadrează normelor elaborate de Regulamentul(CE) nr.1441/2007 (ISO 21528-1) al Comisiei din
5 decembrie 2007.
 Articol

J Vet Sci. 2005 Mar

Isolation and identification of Escherichia coli O157:H7 using different detection

methods and molecular determination by multiplex PCR and RAPD.

Autori: Kim JY1, Kim SH, Kwon NH, Bae WK, Lim JY, Koo HC, Kim JM, Noh KM, Jung WK,
Park KT, Park YH.

Abstract

Escherichia coli O157:H7 is recognized as a significant food-borne pathogen, so rapid identification

is important for food hygiene management and prompt epidemiological investigations. The limited
prevalence data on Shiga toxin-producing E. coli (STEC) and E. coli O157:H7 in foods and animals
in Korea made an assessment of the risks difficult, and the options for management and control
unclear. The prevalence of the organisms was examined by newly developed kit-E. coli O157:H7
Rapid kit. For the isolation of E. coli O157:H7, conventional culture, immunomagnetic separation,
and E. coli O157:H7 Rapid kit were applied, and multiplex PCR and randomly amplified
polymorphic DNA (RAPD) were performed for the molecular determination. There was high
molecular relatedness among 11 Korean isolates and 17 U.S. strains at 63% level. Additionally,
distinct differentiation between pig and cattle isolates was determined. It implied that RAPD had a
capacity to distinguish strains with different sources, however it could not discriminate among
isolates according to their differences in the degree of virulence. In antimicrobial susceptibility tests,
45.5% of isolates showed antibiotic resistance to two or more antibiotics. Unlike the isolates from
other countries, domestic isolates of E. coli O157:H7 was mainly resistant to ampicillin and
tetracyclines. In summary, the application of E. coli O157:H7 Rapid kit may be useful to detect E.
coli O157:H7 due to its sensitivity and convenience. Moreover, combinational analysis of multiplex
PCR together with RAPD can aid to survey the characteristics of isolates.
 Analiza microbiologica a germenului Staphylococcus
(Branza dulce de oaie)

Autori: Bană Mihai-Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Daniela-Andreea, Udrea
Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

INTRODUCERE

Staphylococcus aureus (sau Stafilococul auriu) este un tip de bacterie frecvent întâlnita pe piele și
păr, precum și în nasul si gatul oamenilor si animaelor. Aceasta bacterieeste prezenta în până la 25%
dintre persoanele sănătoase și sunt chiar mai frecventa printre cei cu infecții ale pielii, ochilor,
nasului sau gâtului.
Stafilococul poate provoca toxiinfectie alimentara atunci când un muncitorul contaminează
alimentele și apoi alimentele nu sunt refrigerate corespunzător. Alte surse de contaminare a
alimentelor includ echipamentele și suprafețele pe care se prepară produsele alimentare. Aceste
bacterii se înmulțesc repede la temperatura camerei pentru a produce o toxină care provoacă boală.
Stafilococul este ucis prin gătire și pasteurizare.
(https://www.foodsafety.gov/poisoning/causes/bacteriaviruses/staphylococcus/index.html)

MATERIALE ŞI METODE

-Lingura
-placa Petri (Mediu:Bacto coagulase agar base dehydrated)
-Eprubete pentru dilutii (9mL apa distilata)
-Pipeta automata

Metode
 Se cantareste 1 g de produs si se omogenizeaza timp de 15min intr-o eprubeta (9mL apa
distilata).Se realizeaza 2 dilutii zecimle iar proba din ultimele 2 dilutii se insamanteaza in 2 placi
petri.

Se incubeaza la 30-37 grade Celsius timp de 24h. Daca dupa 24h nu s-au format colonii,se mai
mareste timpul cu 24h.
Coloniile suspecte sunt cele care au colorat mediul in galben, au un astepect lucios,usor
bombat de culoare alb galbuie sau aurie.

REZULTATE SI DISCUTII

Fig.1: Prima dilutie T+24h

 Fig.2: A doua dilutie T+24h

Concluzii

Conform EN/ISO 6888 2 limita maxima pentru Staphylococcus aureus este de 1x105 ufc/g.
Cantitatea de UFC nu a putut fi determinata cu exactitate, fiin necesare dilutii suplimentare. Din
punct de vedere calitativ, analiza microbiologica a relevat insa prezenta microorganismului in proba
noastra.

Articol

Laboratory Medicine, Volume 43, Issue 6, 1 November 2012, Pages 276–280,

Rapid Identification of Staphylococcus aureus: FISH Versus PCR Methods

Autori: Qing Wu, MD Yan Li, MD, PhD Huixia Hu, MS Ming Wang, MD Zegang Wu, MS
Wanzhou Xu, MS

Abstract
Background

Staphylococcus aureus (S aureus) is the most important pathogen in the genus Staphylococcus. The
ability to rapidly and accurately distinguish between S aureus and non–S aureus bacteria (coagulase-
negative Staphylococcus species [CoNS]) is essential for the appropriate therapeutic use of
antibiotics and timely intervention for infection control. Several methods have been reported as
being effective in the rapid identification of S aureus, among which molecular biological methods
have the most potential.

Methods

In this study, 2 molecular techniques, fluorescence in situ hybridization (FISH) and polymerase
chain reaction (PCR), were compared in 1300 clinical specimens. After smear testing, specimens
containing gram-positive cocci in clusters were submitted for investigation. These specimens had
been subjected to FISH analysis and PCR examination. Overall, we gathered statistics on 131
specimens that had been determined to be members of the Staphylococcus genus. We compared the
effectiveness, efficiency, and costliness of the 2 methods.

Results

Comparing the culture determination methods revealed that the identification sensitivity, specificity,
and positive and negative predictive values were 100%, 100%, 100% and 100%, respectively, for
the FISH method and 98.5%, 100%, 100% and 98.5%, respectively, for the PCR method. The FISH
method took approximately 3 hours to complete per sample, whereas PCR took approximately 4
hours. S aureus was differentiated from CoNS via the FISH method 1 hour faster than via PCR
identification.

Conclusion

Although the FISH and PCR methods both allow for the rapid and reliable identification of S aureus
in clinical specimens, FISH is more appropriate for testing a few specimens, whereas PCR is more
appropriate for testing a large number of specimens at a lower cost.
 Identificarea germenumlui Salmonella

Autori: Bană Mihai-Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Daniela-Andreea, Udrea
Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

Introducere
S-ar putea să știți că Salmonella poate contamina păsările de curte și ouăle, dar, de
asemenea, se strecoară în multe alte alimente. Poate contamina carne de vită, ton, carne de porc,
roșii, germeni și chiar unt de arahide, asa ca trebuie sa avem mereu grija ce consumam.
Salmonella este o bacterie care provoacă frecvent boală alimentară, uneori numită
"otrăvire alimentară". CDC estimează că Salmonella provoacă 1 milion de afecțiuni alimentare în
fiecare an în Statele Unite. În ultimii ani, focarele de boli de Salmonella au fost legate de castraveți,
pui, ouă, fistic, ton crud, varză și multe alte alimente contaminate.
S: https://www.cdc.gov/features/salmonella-food/index.html

Materiale :
- Carne tocata
-Lingura
- Balon Erlemeyer.
-Placa Petri (Mediu:Bacto coagulase agar base dehydrated)
-Eprubete pentru dilutii (9mL apa distilata)
-Pipeta automata
 Practic:
-Se cântărește 10 g produs ,,Carne tocata”,se adaugă în 40 mL apă peptonată;
-Se agită timp de 15 minute;
-după agitare se însămânțează prin tehnica inundării,pe mediul : Desoxycholate Citrate Agar;
-incubăm la 37◦C,timp de 24-48 de ore;
-analizăm proba și interpretăm rezultatele.

Mediul folosit este Desoxycholate Citrate Agar

Rezultate:

Concluzii:
Produsul este neconform, din cauza ca salmonella e prezenta in proba de analizat.
 Articol:

Food Control
Volume 47, January 2015, Pages 264-276

Autors: Kyung-MinLeeaMickRunyonaTimothy
J.HerrmanaRobertPhillipsbJohnHsieha

Review of Salmonella detection and identification methods: Aspects of rapid

emergency response and food safety
Abstract

Salmonella has been recognized as a major and important foodborne pathogen for humans
and animals over more than a century, causing human foodborne illness as well as high medical and
economical cost. Accordingly, the effort to develop efficient and reliable Salmonella detection
methods continues. This paper reviews and describes the development and application of
commercially available Salmonella detection methods. These are categorized into several groups
based on the principle applied: conventional culture methods, immunology-based assays, nucleic
acid-based assays, miniaturized biochemical assays, and biosensors. Conventional culture methods
serve as the basis in food testing laboratories despite rather laborious and time-consuming protocols.
Considerable progress in rapid methods using emerging technologies yield faster answers and higher
throughput of samples. This paper also shows and analyzes Salmonella test results and summarizes
the features and limitations of the studies involving Salmonella detection methods developed for
emergency response, mainly by food emergency response laboratories participating during recent
fiscal years. The emergency response laboratories utilize Salmonella detection methods possessing
properties that include simplicity, versatility, high sensitivity, good specificity, and cost efficiency.
Collaboration of the food emergency response laboratories in the development of these technologies
is important essentially to compare for the purpose of continually improving Salmonella detection
methods.
 Analiza microbiologica a bacteriilor benefice –PenicilliniumCamemberti
(Branza Camembert)

Autori: Bană Mihai-Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Daniela-Andreea, Udrea
Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

Introducere

Penicillinium Camemberti este o specie de fungi din familia Trichocomaceae folosit la

producerea branzeturilor de tip Camembert ,Brie , Langres, Coulommiers si Camboza , unde
coloniile formeaza o crusta alba si tare .Datorita acesteia branzeturile capata o textura
moale/cremoasa
Izolarea are ca scop studiul tulpinilor prin diverse tehnici de izolarea a ADN-ului si PCR

Fig
1:http://www.mycobank.org/TempFiles/20180113/TempF5745_camemberti-1.jpg
Fig 2:http://www.mycobank.org/TempFiles/20180113/TempF5746_camemberti-2.jpg

MATERIALE ŞI METODE

-Lingura
- doua placi Petri (mediul YPG Agar-suplimentat cu cloramfenicol)
-pahar Erlenmyer
-Eprubete pentru dilutii (9mL apa distilata)
-Pipeta automata

Se cantareste 1 g de produs si se omogenizeaza timp de 15min intr-un pahar Erlenmyer(9mL

apa distilata).Se realizeaza 2 dilutii zecimle iar proba din ultimele 2 dilutii se insamanteaza in 2 placi
petri prin metoda inundarii.

Se incubeaza la 30-37 grade Celsius timp de 24h.

Fig 3 : Proba la omogenizat Fig 4 : Placile inoculate

REZULTATE SI DISCUTII
Concluzie: Pe placi se observa doar colonii de Penicillinium Camemberti
Articol

J Dairy Sci. 2013 Jun;96(6)

Dynamics of Penicillium camemberti growth quantified by real-time PCR

on Camembert-type cheeses under different conditions of temperature and
relative humidity.

Autori: Leclercq-Perlat MN1, Picque D, Martin Del Campo Barba ST, Monnet C.

Abstract

Penicillium camemberti plays a major role in the flavor and appearance of Camembert-type cheeses.
However, little is known about its mycelium growth kinetics during ripening. We monitored the
growth of P. camemberti mycelium in Camembert-type cheeses using real-time PCR in 4 ripening
runs, performed at 2 temperatures (8 and 16°C) and 2 relative humidities (88 and 98%). These
findings were compared with P. camemberti quantification by spore concentration. During the first
phase, the mycelium grew but no spores were produced, regardless of the ripening conditions.
During the second phase, which began when lactose was depleted, the concentration of spores
increased, especially in the cheeses ripened at 16°C. Sporulation was associated with a large
decrease in the mycelial concentration in the cheeses ripened at 16°C and 98% relative humidity. It
was hypothesized that lactose is the main energy source for the growth of P. camemberti mycelium
at the beginning of ripening and that its depletion would trigger stress, resulting in sporulation.
 Metode biologice de prevenire si combatere a microorganismelor patogene/
fitopatogene
Autori: Bană Mihai-Sabin, Isac Alexandru-Stefan, Ilie Iuliana, Mercore Daniela-Andreea, Udrea
Diana
Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii,
Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

Introducere:
În marea majoritate a cazurilor, produsele de uz fitosanitar sunt substanţe mai mult sau mai puţin
toxice.

Materiale :
- Penicillium expansum
- Aspergillus Flavus
- Fusarium Oxysporum
- Aspergillus Niger
- Botritys Cinerea
- Aspergillus Carbonalius
-Placa Petri (Mediu: YPD)
- Ansa Drigalski sterilă

Practic:

Rezultate:
Concluzii