ANALIZE DE SÂNGE - LUCRĂRI PRACTICE DE LABORATOR (1)

1. CLORUL SANGUIN
1.1. Determinarea prin Metoda Argentometrică

Principiul metodei:
Se precipită clorurile cu AgNO 3 sub formă de AgCl. Se distruge materia organică cu KMnO 4 în
prezența HNO3 conc. Excesul de AgNO3 se titrează cu tiocianat de potasiu sau de amoniu, în
prezența alaunului feric amoniacal drept indicator. Se formează complecși colorați în roșu
purpuriu a căror intensitate este proporțională cu numărul grupărilor SCN - legate.

Reacții chimice:

Reactivi:
- Soluție azotat de argint N/50
- Soluție de sulfocianură de potasiu (sau amoniu) N/50
- Indicator alaun feric amoniacal 5%
- Soluție saturată de permanganat de potasiu
- HNO3 conc.
- Perhidrol sau apă oxigenată 30 vol.

Tehnica de lucru:
Într-un vas Erlenmeyer de 100 ml (sau de 50 ml) se pipetează 1 ml de ser (plasmă sau sânge
total), la care se adaugă 10 ml apă distilată, 10 ml soluție de azotat de argint N/50, 10 ml
acid azotic conc. și 2 ml de soluție de permanganat de potasiu. Se fierbe conținutul vasului
agitând cu o baghetă de sticlă până la apariția unui lichid limpede și a unui precipitat de AgCl
de culoare albă, culoare mascată de aspectul brun al oxidului de mangan care se formează în
timpul reacției. Se adaugă 1-2 picături de perhidrol pentru distrugerea excesului de
permanganat de potasiu. Lichidul devine incolor sau alb-galbui. Se răcește conținutul vasului
și se adaugă 2,5 ml indicator si se titrează cu soluția de tiocianat de potasiu sau amoniu până
la apariția primei colorații roșu-cărămiziu care trebuie să persiste minim 30 de secunde.

Calcularea rezultatelor:
1ml AgNO3 N/50 corespunde la 0,71 mg Cl-
1ml AgNO3 N/50 corespunde la 1,17 mg NaCl
mg/100 ml Cl- = (10-V) x 0,71 x 100
mg/100 ml NaCl = (10-V) 1,17 x 100 în care: V = numărul de ml de tiocianat de potasiu
consumat pentru titrarea excesului de AgNO3 N/50.

1.2. Metoda standard

Principiul metodei:
Azotatul mercuric în mediu acid (pH sub 3) în prezența clorurilor din sânge formeaza clorura
mercurică, ionii de Hg2+ în exces formează cu difenilcarbazona un complex colorat în violet.

Reacții chimice:
2 NaCl + Hg(NO3)2 → HgCl2 + 2 NaNO3

Reactivi:
- Soluție de azotat mercuric 0,01N
- Soluție indicator de difenilcarbazonă 0,5 g %
- Soluție standard de Cl- 0,1N

Tehnica de lucru:
Se iau două eprubete de hemoliză (pentru proba de analizat și cea standard) în care se
pipetează următoarele:

Probă de analizat Probă standard

Apă distilată (ml) 1 1
Ser sanguin (ml) 0,1 -
Soluție standard (ml) - 0,1
Indicator (ml) 0,2 0,2

Conținutul celor două eprubete de hemoliză se amestecă prin agitare după care se titrează
cu o soluție de azotat mercuric 0,01N dintr-o microbiuretă până la apariția culorii violete. Se
notează cu n=ml soluție azotat mercuric folosit.

Calcularea rezultatelor:
1ml Hg(NO3)2 0,01 N corespunde la 0,355 mg Cl- (1 ml soluție standard Cl- 0,01)
1 ml soluție standard trebuie să se titreze cu 1 ml soluție azotat mercuric, dacă titrarea
probei standard diferă cu mai mult de +/- 0,03 ml, trebuie să se refacă soluțiile.
mg % Cl- = V x 355 (conc. sol. etalon 0,1N)
 2. DOZAREA CANTITATIVĂ A FOSFORULUI
2.1. Metoda Raabe

Principiul metodei:
Ionul fosfat reacționează cu acidul molibdenic dând un complex fosfomolibdenic care este
redus de acidul ascorbic la albastru de molibden (alcătuit dintr-un amestec de oxizi de
molibden, la stări diferite de oxidare) care se colorimetrează. Adăugarea de metabisulfit
inhibă formarea de complecși nespecifici, iar boratul asigură stabilirea culorii.
Tamponul carbonat-sulfit menține proteinele în soluție la pH=8,7 așa că nu mai este
necesară deproteinizarea.

Reacție chimică:

HPO42- + 12 MoO4 2- +23H+ + 3NH4 + = (NH4)3PMo12O40 + 35 H2O

Reactivi:
-soluție de borat metabisulfit
-soluție de acid molibdenic
-soluție reducătoare
-soluție tampon carbonat-sulfit
-soluție standard de PO4 3-

Tehnica de lucru:
În 3 aprubete se pregătesc următoarele probe:

Proba de analizat Proba standard Proba in alb

Soluție de borat-metabisulfit (ml) 1 1 1
Ser sanguin (ml) 0,1 - -
Soluție standard (ml) - 0,1 -
Apă distilată (ml) - - 0,1
Soluție de acid molibdenic (ml) 0,2 0,2 0,2
Soluție reducătoare (ml) 0,2 0,2 0,2

Conținutul fiecărei eprubete se agită și se lasă timp e 15 min la temperatura camerei, după
care se adaugă în fiecare eprubetă câte 2 ml soluție tampon carbonat-sulfit. Se amestecă și
după 5 min. se măsoară extincțiile la proba de analizat și la proba standard, în raport cu
proba în alb. Citirea se face la 700 nm, în cuve de 1 cm diametru. Citirile trebuie să se facă în
maxim 30 de minute de la adăugarea soluției tampon.
Calcularea rezultatelor:
EP/ES x 5 = mg P/100 ml ser, în care:
EP = valoarea extincțiilor citite pentru proba de analizat
ES = valoarea extincțiilor citite pentru solutia standard
5 = concentratia în P/100 ml a soluției etalon.

2.2. Metoda Briggs

Principiul metodei:
Se precipită proteinele cu acid tricloracetic, apoi în filtrat, fosfatul anorganic împreună cu
molibdatul de amoniu, în mediu acid, formează fosfomolibdatul de amoniu (un precipitat de
culoare galbenă). Acesta este redus la albastru de molibden solubil în apă, care se determină
spectrofotometric la 660 nm.

Reactivi:
- Soluție de acid tricloracetic 20%
- Soluție de molibdat de amoniu
- Soluție de hidrochinonă 1%
- Soluție de sulfit de sodiu 20%
- Soluție standard stoc de PO43- = 1mg P/ml
- Soluție standard de lucru (10 mg P/ml).

Tehnica de lucru:
La 2 ml ser sau plasmă, se adaugă 4ml apă distilată și 4 ml soluție de acid tricloracetic. Se
agită pentru amestecare, se lasă în repaus 20 de minute după care se centrifughează sau se
filtrează. După această operațiune, se pregătesc 3 eprubete conform tabelului care urmează:

Probă de analizat Probă standard Probă în alb

Superanatant (sau filtrat) 5 - -
Standard de luru (10mg/ml) - 3 -
Apă distilată - 2 5
Soluție molibdat de amoniu, se
1 1 1
adaugă la interval de 2 minute
Soluție de sulfit de sodiu 1 1 1
Soluție de hidrochinonă 1 1 1
Apă distilată 2 2 2

Conținutul fiecărei aprubete se agită pentru omogenizare și după 30 de minute în repaus se

fac citirile extincțiilor pentru proba de analizat și pentru proba standard, în raport cu proba
în alb. Citirile se fac la 660 nm, folosind filtru roșu.
Calcularea rezultatelor:
Rezultatelor se calculează după următoarea formulă:
mg P/100 ml ser = EP/ES x 0,03 x 100, în care: 0,03 = conc. sol. etalon de lucru (s-au luat în
lucru 3 ml).

3. DOZAREA FIERULUI SANGUIN (SIDEREMIE)

3.1. Metoda Heilmeyer - modificată

Principiul metodei:
Proba de ser sanguin se tratează cu acid clorhidric pentru eliberarea Fe 3+ din transferină.
Proteinele se precipită cu acid tricloracetic. În soluție se regăsește Fe 3+care este redus la
Fe2+cu hidrochinonă. În prezență de o-fenantrolină se formează un complex colorat în roșu.

Reacție chimică

Reactivi:
- Soluție de acid clorhidric 1N
- Soluție acid tricloracetic 20%
- Soluție de hidrochinonă 2 %
- Soluție o-fenantrolină clorhidrică 1%
- Soluție semisaturată de acetat de sodiu
- Soluție standard de fier 10μg%.
- Soluție standard de lucru de fier 100μg%.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete de analizat se prelucrează conform tabelului:
Probă de analizat Standard Blanc
Soluție HCl 1N (mL) 1 1 1
Ser nehemolizat(mL) 2 - -
Apă distilată (mL) - - 2
Soluție standard lucru Fe (mL) - 2 -
Agitare. Repaus 10 minute.
 Soluție acid tricloracetic 20%(mL) 2 2 2
Agitare. Repaus 10 minute.
Centrifugare 4000 rpm, timp de 5 minute.
Se ia în lucru supernatantul corespunzător:
Supernatant probe 2 2 2
Soluție hidrochinonă 2% 0,2 0,2 0,2
Soluție de o-fenantrolină 1% 0,1 0,1 0,1
Soluție de acetat de sodiu 2 2 2
Agitare. Repaus 5 minute.
Citire la spectrofotometru la 510 nm.

Calcularea rezultatelor:
Fier μg/100mL ser = EP/ES x 100
EP = extincție probă de analizat
ES = extincție standard