Continut Lucrare Rosca

Jianu Teodora - Modificări fiziologice produse de excesul în substanţe nutritive asupra speciei Zea mays
vitrocultivată
1
vitrocultivată
INTRODUCERE
Porumbul este o cereală care se cultivă în toată lumea, el putând fi întâlnit până la
altitudini de 3.900 metri. Boabele de porumb se folosesc la obţinerea spirtului, amidonului,
glucozei şi dextrinei. De asemenea, din germeni de porumb se extrage un ulei de foarte bună
calitate. Din datele cunoscute pâna în prezent 72% din producţia de porumb se foloseşte în hrana
animalelor, 7% în industrie şi 21% în hrana oamenilor. Datorită particularităţilor sale biologice
porumbul rezistă foarte bine la secetă şi căldură, se poate cultiva bine pe tot spectrul de terenuri
în condiţii climatice diferite, suportă destul de bine monocultura, lasă pământul curat de buruieni
şi constituie o bună premergătoare pentru foarte multe culturi, chiar şi pentru grâul de toamnă. În
ţara noastră, porumbul deţine locul cel mai important, cultivându-se pe 50% din suprafaţa
ocupată de cereale. Deşi are puţine boli şi dăunători din datele de control privind incidenţa unui
periculos dăunător numit aflatoxină, porumbul este una dintre cele mai contaminate cereale cu
această micotoxină.
Aflatoxinele sunt micotoxine produse de diferite tipuri de mucegaiuri şi se pot găsi în
alimente sau pe alimente. Aflatoxinele sunt cele mai cunoscute şi studiate micotoxine din lume.
Acest lucru se datorează toxicităţii puternice. Apariţia acestor toxine este influenţată de mai
mulţi factori: localizare geografică, clima, metode de cultivare, metode de depozitare, procesarea
şi depozitarea furajelor etc.
Studiile au arătat că principalii producători de aflatoxine sunt: Aspergillus flavus, A.
parasiticus, A. nominus şi A. niger. Aceste studii au arătat şi că există patru forme de aflatoxine
ce se găsesc în/pe alimente (B1, B2, G1, G2) şi două forme metabolice (M1 şi M2). Aflatoxinele
M1 şi M2 sunt cele care se găsesc, în cantitate mare, în produsele de origine animală (oua, lapte
şi produse din lapte şi din carne), în urma hrănirii animalelor cu furaje infestate cu mucegaiuri
producătoare de aflatoxine, acestea fiind rezultatul metabolizării aflatoxinelor B1 si B2.
Scopul cercetării
Aflatoxinele au devenit un subiect extrem de important în toata mass media romanească,

întrucât în ţara noastră aflatoxina a fost prezentă în laptele de consum şi produsele lactate cât şi
în cereale şi seminţe oleaginoase.
2
vitrocultivată
Având în vedere importanţa alimentară şi furjeră a porumbului, în lucrarea de faţă ne-am

propus să studiem modificările fiziologice în calusul de porumb produse de aflatoxină în condiţii
sterile prin micropropagarea in vitro al celor mai cultivaţi hibrizi din vestul ţării noastre.
Problema este că aflatoxinele au existat în alimente, vor exista şi anul viitor şi peste 100 de ani.
Obiectivele cercetării:
- Obţinerea calusului din hibrizi de porumb;
- Extracţia aflatoxinei B1 şi G1 din Aspergillus parasiticus;
- Testarea aflatoxinei pe calus de porumb;
- Studierea organogenezei porumbului iniţiată din calus;
- Reprezentarea grafică şi interpretarea statistică a rezultatelor;
- Stabilirea concluziilor
CAPITOLUL I. GENERALITĂŢI
1. PORUMBUL – Zea mays L.
1.1. Importanţa furajeră
Centrul de origine al porumbului este America Centrală (Mexic-Guatemala) şi America de

Sud (Peru –Bolivia), de unde a fost adus în Europa la sfârşitul secolului al XV-lea de navigatorul
Cristofor Columb.
În ţara noastră porumbul se cultivă de la sfârşitul secolului al XVII-lea, în Muntenia (pe
timpul domniei lui Şerban Cantacuzino), apoi în Moldova şi Transilvania.
Particularităţile biologice şi alimentare deosebite au determinat cultivarea porumbului în
diverse zone ale lumii, ocupând locul trei ca suprafaţă (peste 130 milioane hectare) după grâu şi
orez. În ţara noastră suprafaţa cultivată cu porumb este de aproximativ 3 milioane hectare.
Importanţa alimentară şi furajeră a porumbului este dată de următoarele însuşiri:
● în alimentaţia omului se foloseşte sub formă de făină de porumb (mălai), fulgi de
porumb, floricele, boabe fierte, etc.;
● în industrie, boabele de porumb constituie materia primă pentru fabricarea spirtului,
amidonului, glucozei şi dextrinei;
3
vitrocultivată
● conţinutul ridicat de grăsimi (peste 6%) în germenii de porumb face din porumb o plantă
din care se extrage ulei de foarte bună calitate, folosit în alimentaţia dietetică;
● în hrana animalelor porumbul se foloseşte sub diferite forme: boabe concentrate, furaj
verde sau însilozat, fân, coceni;
● boabele de porumb conţin între: 11,5-14% apă, 9,5-15% proteine, 5-8% grăsimi, 1,5-2%
săruri minerale, 65-72% amidon; 1 kg de porumb are 70-80 g proteină digestibilă şi 1,20-1,30
unităţi nutritive;
● deoarece în compoziţia proteică a porumbului lipsesc unii aminoacizi esenţiali
(triptofanul, lizina), hibrizii creaţi în ultima perioadă posedă o genă care determină sinteza
acestor aminoacizi (Opaque-2), iar folosirea acestora în hrana animalelor duce la obţinerea unor
rezultate spectaculoase;
● folosirea porumbului pentru siloz, considerat ,,păşunea de iarnă” a animalelor, constituie
modul cel mai eficient de hrănire a animalelor în perioada de stabulaţie, având un grad foarte
ridicat de consumabilitate;
● din punct de vedere tehnologic porumbul se poate cultiva ca şi cultură principală sau în
cultură succesivă (dublă), după plantele ce se recoltează mai devreme;
● folosirea unor hibrizi cu perioade de vegetaţie diferite permite o cultivare eşalonată a
porumbului, asigurându-se, astfel, furaje verzi în tot timpul perioadei de vegetaţie;
● importanţa porumbului se datorează şi următoarelor însuşiri agrobiologice şi agrotehnice:
rezistenţă ridicată la secetă şi cădere, la unele boli şi dăunători, mecanizarea totală a lucrărilor
agrotehnice şi de recoltare, o bună valorificare a îngrăşămintelor organominerale şi a apei de
irigaţie, etc.
1.2. Însuşiri morfologice şi fiziologice
Sistemul radicular este fasciculat, format din rădăcini adventive propriu-zise, provenite din
nodurile subterane ale tulpinii şi din rădăcini adventive aeriene, formate din nodurile de la
suprafaţă. Rădăcinile pătrund până la 3-4 m în adâncimea solului.
4
vitrocultivată
Tulpina, de înălţimi variabile în funcţie de tipul hibridului, prezintă 8-17 internoduri, formele
mai tardive au un număr mai mare
decât cele
precoce.
Frunzele au limbul lanceolat, de
50-80 cm lungime şi 5-12 cm lăţime, cu
marginile ondulate. În epiderma
superioară a limbului se găsesc
numeroase celule buliforme, care au
rolul de a răsuci spre interior limbul
foliar, mărind astfel rezistenţa la secetă
a porumbului.
Porumbul este o plantă
unisexuat-monoică, având florile
mascule aşezate în vârful tulpinii,
într-o inflorescenţă de tip panicul.
Acestea prezintă un ax principal
prevăzut cu numeroase ramificaţii
laterale, pe care se găsesc spiculeţe
biflore, nearistate.
Florile femele sunt grupate în Fig.1. Morfologia plantei Zea mays
inflorescenţe de tip spic, cu axul
îngroşat (spadix). Pe rahisul ştiuletelui sunt aşezate spiculeţe, în rânduri perechi, cu câte două
flori: una superioară fertilă şi una inferioară sterilă.
Ovarul este monocarpelar, cu stigmatul filiform, lung de 20-40 cm, bifurcat la vârf.
Fructul este o cariopsă, de mărimi diferite, în funcţie de hibrid.
5
vitrocultivată
1.3. Sistematică şi hibrizi

Porumbul face parte din familia Graminaceae, specia Zea mays, care cuprinde următoarele
convarietăţi:
● conv. indurata, porumbul cu boabe tari, are endospermul la periferia bobului şi făinos în
partea centrală;
● conv. indentata, porumbul dinte de cal, la care endospermul făinos ocupă partea cea mai
mare a bobului;
● conv. everta, porumbul pentru floricele, cu bobul albicios, lucios, cu endospermul cornos
cu excepţia unei porţiuni în dreptul embrionului;
● conv. amylacea, porumbul amidonos, cu endospermul făinos în întregime;
● conv. saccharata, porumbul zaharat, bogat în hidraţi de carbon şi sărac în amidon,
boabele sunt zbârcite la uscare;
● conv. ceratina, porumbul cerat, cu endospermul cornos în întregime;
● conv. tunicata, porumbul ,,îmbrăcat”, cu boabele acoperite de glume.
În aproape toate zonele ecologice de cultură a porumbului din lume nu se mai cultivă
soiuri, ci hibrizi, rezultaţi din linii consangvinizate prin autofecundare dirijată.
Primii hibrizi de porumb s-au creat în S.U.A, iar introducerea lor în cultură s-a făcut după
anul 1954.
După modul de obţinere, hibrizii se clasifică în:
- hibrizi simpli (HS), realizaţi din hibridarea a două linii consangvinizate;
- hibrizi dubli (HD), din hibridarea a doi hibrizi simpli:
- hibrizi triliniari (HT), hibridarea dintre o linie consangvinizată şi un hibrid simplu;
În funcţie de durata perioadei de vegetaţie, hibrizii de

porumb se clasifică în următoarele grupe:
6
vitrocultivată
HIBRIZI INDICELE DE PRECOCITATE

Hibrizi foarte timpurii (FAO)
Hibrizi timpurii 100-200
Hibrizi semitimpurii 200-300
Hibrizi târzii 300-400
Hibrizi târzii 400-500 ; 500-600
650-700
În funcţie de tipul hibridului şi zona de cultură, durata fenofazelor de dezvoltare la porumb
variază astfel: de la răsărit şi până la înflorit durata este de 50-90 zile, pentru formarea şi
maturarea boabelor de 60-70 zile, revenind în total 110-160 zile pentru condiţiile de câmpie.
Tabelul 1. Hibrizii de porumb cultivaţi în România (după Lista oficială a

soiurilor, 2012).
Denumirea Tipul Precocitatea Zona de Ţara de origine
hibridului hibridului (FAO) cultură
Bucovina HT 100-200 III România
Dana HS 100-200 III România
Doina HT 100-200 III România
Roxana HS 100-200 III România
Turda 167 HT 100-200 III România
Alberta HT 200-300 III USA
Felicia HS 200-300 III USA
Furio HS 200-300 III CH
Helga HS 200-300 III USA
Turda Super HT 200-300 III România
Andreea HS 300-400 II România
Neptun HS 300-400 II România
Evelina HS 400-500 II USA
Fulger HS 400-500 II România
Granit HS 400-500 II România
Partizan HS 400-500 II România
Vasilica HT 400-500 II R – USA
ZP 471 HS 400-500 II YU
Faur HS 500-600 II România
Cocor HS  600 I România
Fundulea 410 HS  600 I România
1.4. Cerinţe faţă de factorii de vegetaţie
7
vitrocultivată
Temperatura optimă de germinare a seminţelor de porumb este de 8-10 0C, iar temperatura de
creştere şi dezvoltare a plantelor este de 15-180C. La temperaturi mai mici de 100C creşterea încetează,
iar dacă temperatura coboară sub –40C, plantele mor.
Din punct de vedere al fotoperioadei, porumbul este o plantă de zi scurtă, adaptată la o
lumină intensă.
În primele faze de creştere, după răsărire, porumbul are o rezistenţă deosebită la secetă,
datorită sistemului radicular profund, consumului specific redus de apă. Lipsa sau insuficienţa
apei în perioada formării paniculului şi a boabelor are efecte negative asupra producţiei.
Deşi nu are cerinţe deosebite faţă de sol, producţiile cele mai mari se realizează pe solurile
cu fertilitate ridicată (cernoziomuri, soluri aluvionare, brun-roşcate), cu pH neutru (6,5-7) şi
capacitate mare de reţinere a apei. Nu se recomandă solurile reci, cu exces de umiditate,
compacte, tasate.
1.5. Zonele de cultivare a hibrizilor de porumb

În zonarea hibrizilor de porumb se ţine seama de constanta termică, rezultată din însumarea
temperaturilor mai mari de 100C, din timpul perioadei de vegetaţie. În funcţie de acest criteriu s-au
stabilit trei zone de cultură pentru porumb, în ţara noastră:
● Zona I, în care suma temperaturilor biologic active este de 1401-1600 0C, cuprinde:
Câmpia din sudul ţării, Dobrogea, Câmpia de Vest, partea de sud a podişului Moldovei;
● Zona II, în care suma temperaturilor biologic active este de 1201-14000C, cuprinde cea
mai mare parte a Podişului Moldovei şi Câmpia de nord-vest;
● Zona III, în care suma temperaturilor biologic active este de 800-12000C, cuprinde:
zonele subcolinare a Carpaţilor Meridionali şi Răsăriteni, Podişul Transilvaniei şi Depresiunea
Maramureşului.
În funcţie de constanta termică a acestor zone, ponderea hibrizilor de porumb este
următoarea:
- pentru zona I, se va cultiva 75-80% din suprafaţă cu hibrizi târzii şi 20-25% cu
hibrizi mijlocii;
- pentru zona II, ponderea este de 20% hibrizi tardivi, 50% hibrizi mijlocii şi 30%
hibrizi timpurii;
8
vitrocultivată
- pentru zona III, se va cultiva 75% din suprafaţă cu hibrizi timpurii şi 25% cu
hibrizi mijlocii.
2. Aflatoxinele.
Aflatoxina este o substanţă toxică produsă de anumite tipuri de mucegaiuri. Prima dată
aflatoxina a fost identificată in 1961 la Aspergillus flavus, mucegai de la care i s-a dat şi denumirea
(A.flavus - aflatoxina).
Aflatoxinele sunt produşi de metabolizare ai mai multor specii de mucegaiuri având ca structură de
bază nucleul cumarinic condensat cu unul furanic. Se cunosc 17 aflatoxine: B 1, B2 ,B2a ,G1, G2, G1a , M1 ,M2 ,
GM1, GM2 ,P1, P2, Q1, Q2, aflatoxicolul, aspertoxina.
Fig.2. Tipuri de aflatoxine

Ea este secretată de Aspergillus parasiticus, şi un numar mare de alte mucegaiuri, diferit penicilinii şi
chiar Rizopus şi au ca principal producator A. flavus. Acesta se dezvoltă în seminţe de oleoginoase, produsele
9
vitrocultivată
secundare de la fabricarea uleiului (srot, tărâţe), arahide, cereale, produse de origine animală (brânzeturi
fermentate, preparate de carne). S-au constatat hepatite acute la copii care au fost alimentaţi cu înlocuitori de
lapte obţinuţi din seminţe oleaginoase atacate de fungi.
Fig.3. Morfologia speciilor din genul Aspergillus care secretă aflatoxine
Nu sunt solubile în apă,ci în solvenţi organici, dar aceştia nu pot fi folosiţi pentru îndepărtarea
micotoxinelor, deoarece prin extracţie se pierde valoarea alimentară a produsului. Prima dată problemele
provocate de aflatoxine au fost depistate în Anglia, unde în anul 1960 au murit în câteva luni peste 2.000 de
curcani. S-au făcut cercetări şi rezultatele au scos la iveală că păsările fuseseră infectate cu o ciupercă
microscopică ce provenea de la hrana animalelor: nişte turte de arahide care fuseseră aduse de la un singur
depozit care, se pare, nu respecta condiţiile de igienă impuse. Ce este mai rău este faptul că, odată ce un animal
a mâncat hrană infectată (porumb sau alte cereale) el poate transmite toxina mai departe la omul care consumă
carnea animalului respectiv. De la acel incident, în toată Europa de vest s-au impus măsuri clare pentru
depozitarea alimentelor, tocmai pentru a preveni astfel de cazuri dramatice.
Conform cercetatorilor americani, cel mai inalt risc de contaminare cu aflatoxină il au cerealele, alunele
si seminţele de bumbac. Şi frunzele de tutun stocate şi prelucrate necorespunzător ar putea conţine aflatoxină,
sporind în acest fel gradul de toxicitate pentru fumători, şi aşa expusi multiplelor riscuri ale viciului lor.
Îmbolnăviri acute la oameni (aflatoxicoze) au fost raportate în ţări ca Taiwan, India, Kenya. Simptomele sunt :
dureri abdominale, vomă, edem pulmonar, convulsii, comă şi uneori chiar moartea prin edem cerebral. Apar
leziuni la nivelul ficatului, rinichilor şi inmii. Expunerile prelungite chiar la doze mici de aflatoxină pot favoriza
10
vitrocultivată
apariţia cancerelor. Unele studii apreciază că potenţialul cancarigen al aflatoxinei este foarte mare. Aflatoxinele
sunt specifice ţărilor cu climă caldă deoarece ele incubează şi au o producţie maximă la temperaturi ridicate.
Aflatoxina B1 prezintă cea mai mare toxicitate.
Fig.4. Aspecte privind morfologia ciupercii Aspergillus parasiticus pe diferite produse
În laptele vacilor care consumă furaje contaminate cu aflatoxine , apar aflatoxine M în două fracţiuni
M1 si M2. În general aflatoxinele au greutăţi moleculare mici, sunt termostabile, dar sensibile la aer şi lumină.
Ele pot fi considerate hepatotoxice, hepatocancerigene şi mutagene; animalele tinere sunt mai sensibile decât
cele vârstnice, cea mai mare sensibilitate o prezintă însa bobocii de raţă.
Aflatoxinele sunt distruse de către radiaţiile UV, acizi, alcalii şi sunt uşor oxidabile.
Efectele cancerigene sunt nu numai la nivelul hepatic, ci şi la stomac, plămâni.
Aflatoxina B1 se poate cupla în vitro cu AND-ul, provocând mutaţii inreversibile.
Intoxicaţiile cu aflatoxine se manifestă prin stare hemoragipară, dizenterie, uneori icter; mediul cel mai
favorabil pentru formarea acestora il constituie porumbul si arahidele. Aflatoxinele se găsesc şi în carne, ouă,
peşte, creveţi, cu predilecţie în diferite organe (la porc în ficat).
11
vitrocultivată
Principalele căi de acces in organism sunt calea aeriană si cea orală, dar calea orala este principala
metodă de acces a acestora. Dupa inhalare, aflatoxinele apar mai repede în sânge decat atunci cand sunt
ingerate, dar dupa patru ore concentraţia din plasma este la fel pentru ambele metode de acces.
După ce sunt ingerate, aflatoxinele sunt absorbite la nivelul tractului intestinal, în special la nivelul
duodenului. Dupa ce pătrund in organism, are loc manifestarea toxicităţii acestora.
Aflatoxinele au beneficiat de atenţie crescută pentru ca în urma cercetărilor s-a dovedit că acestea
produc cancer, alte efecte toxicologice puternice şi chiar moartea daca sunt ingerate în cantitate mare.Mai jos
gasiti cateva evenimente importante ce au fost produse de consumul de alimente contaminate cu aflatoxine şi
un tabel în care sunt prezentate principalele efecte ale acestora asupra organismului uman şi animal.
În 1961, peste 100000 de curcani, fazani şi raţe au murit după ce au consumat arahide cu un conţinut
foarte mare de aflatoxine. Acest eveniment a declanşat o evoluţie rapidă a cercetărilor din acest domeniu şi
astfel s-au identificat peste 300-400 de micotoxine.
Carcinomul hepatocelular (cancerul la ficat) este o problemă majoră de sanatate. În China, aproximativ
110000 de persoane sunt diagnosticate anual şi numărul bolnavilor din aceasta ţară reprezintă aproximativ 45%
din totalul persoanelor diagnosticate, la nivel mondial, cu cancer la ficat.
Rata de mortalitate este de aproximativ 95%, iar cercetatorii au afirmat că rata ridicată a mortalitaţii se
datorează consumului de alimente contaminate cu aflatoxine ca porumbul, produsele din soia şi ulei de
arahide/alune.
Relaţia dintre aflatoxine şi cancerul la ficat a fost îndelung studiată şi s-a ajuns la concluzia că
aflatoxinele B1, M1 si G1 produc diferite tipuri de cancer. Totusi, Agenţia Internaţionala pentru Cercetare în
domeniul Cancerului (AICC), consideră ca există suficiente dovezi doar în cazul aflatoxinei B1, aceasta fiind
clasificată de AICC ca substanţă cancerigenă de clasa I.
Un alt eveniment a avut loc in Kenia, unde din 317 persoane otravite cu aflatoxine, 125 au decedat.
Rata mortalităţii a fost de 39% si s-a datorat consumului de porumb contaminat cu 8 mg aflatoxine per
kilogram. Pe lângă mortalitate au mai fost observate şi afectarea sistemului imunitar, boli infecţioase şi
probleme de creştere în cazul copiilor.
12
vitrocultivată
Tabelul 2- Efectele şi simptomele apărute în urma consumului cu produse infestate cu

aflatoxină
Sistemul afectat Efecte/simptome

Gene/exprimarea genelor Efecte teratogene - copii malformati.
Efecte cancerigene - creste riscul de cancer.
Schimbari patologice Schimbarea culorii si dimensiunii organelor interne.
Sistemul circulator Hemoragii, anemii.
Sistemul imunitar Imunosupresie - rezistenta scazuta la factorii de
mediu si microbieni si cresterea incidentei bolilor.
Sistemul nervos Nervozitate excesiva, comportament anormal.
Sistemul urinar Inflamarea rinichilor.
Sistemul digestiv Impiedica absorbtia acizilor grasi, liza proteinelor si
provoaca diaree.
Sistemul reproducator Infertilitate si copii slab dezvoltati si bolnavi.
Alte incidente au fost raportate in Taiwan, Uganda, India, etc. Simptomele/afecţiunile
dezvoltate de aceştia au inclus dureri abdominale, vomă, cancer pulmonar, convulsii, comă, atac
cerebral şi moarte.
Aflatoxinele se distrug foarte greu şi rezistă la fierbere, coacere, prajire, procesarea
alimentelor etc. Prin procesele menţionate anterior, nu se pot distruge integral şi doar se poate
diminua cantitatea prezentă în alimentele respective.
Pentru că nu se poate evita contaminarea cu aflatoxine au fost propuse numeroase
strategii de eliminare a acestora din alimente şi din organismul uman. Aceste metode includ:
inactivarea termică, microbiologică, fermentarea, separarea, iradierea, extracţie cu solveni etc.
Tratarea termică a alimentelor la temperaturi de 60 si 80° C scade foarte puţin cantitatea de
aflatoxine, dar la 100° C se observă o scădere considerabilă. Distrugerea termică este mult mai
eficientă în prezenţa lichidelor şi depinde de durata tratamentului. După două ore la 100° C, s-a
observat o scadere de 80% a conţinutului de aflatoxine. Această metodă nu este foarte eficientă
în cazul seminţelor oleaginoase şi astfel pentru reducerea cantităţii de aflatoxine din seminţe,
acestea trebuie prajite. După prajire, se distruge aproximativ 75% din aflatoxina B1 si 45% din
aflatoxina B2.
13
vitrocultivată
Un sfat important pentru a preveni intoxicarea cu aflatoxine este să nu se consume

alimente învechite sau râncede ca pâine, cereale, alune, arahide, seminţe de floarea soarelui sau
de dovleac etc.
Concluzia este că nu putem preveni 100% consumul de alimente ce conţin aflatoxine dar
putem să îl reducem considerabil urmând câteva metode rudimentare ca prepararea termică a
alimentelor şi eliminarea din alimentaţie a produselor vechi sau râncede.
Extracţia aflatoxinelor
In anu1 1961, s-a reusit extragerea din arahide a unui principiu toxic responsabil de
aparitia unei boli necunoscute (Turkei-x-Disease) care a distrus peste 100 000 pui de curca.
Substanta toxica, s-a dovedit a fi un produs de metabolism al unei tulpini de Aspergillus favus
din care cauza a fost denumita aflatoxina.
Exista peste 20 specii de micete aflatoxinogene dintre care cele mai cunoscute sunt:
Aspergillus flavus Link, A. flavus-Paranuss, A flavus, Pistacia lentiscus, A. favus Anacordium
occidentale, A. flavus Erdnuss, A. flavus tu1pina V 3473, A. flavus parasiticus IMI 15 975, A.
niger var. Tieghem, A. oryzae Wehmer, A. ostianus Wehmer, A. parasiticus Speare, A. ruber
Estienne. A. wentii Wehmer, Penicilliu1citrinum Thom, P. freqventas Estling, P. variabile Sopp,
P. puberum Bainer, P. viridicantum, P. cyclopium, P. roqforti, Rhizopus sp.
Tarile calde ofera cele mai bune conditii de temperatura si umiditate pentru elaborarea
aflatoxinei. Arahidele si produsele derivate din ele au fost primele si cele mai frecvente substrate
in care s-au decelat aflatoxine. Hansen si Jung (1973) considera ca aproape jumatate dintre
semintele de oleaginoase (arahide, nuci, migdale) contin cateva mii ppb de aflatoxina, iar 20%
din cojile de portocale si lamai contin pana la 100 ppb. Autorii citati mai sus arata, in continuare,
ca aflatoxinele difuzeaza din miceliu in profunzimea alimentelor pe o adancime de cativa
centimetri in cateva zile si ca, in unele cazuri, poate fi decelata in alimente care nu prezinta
mucegai vizibil din cauza disparitiei acestuia in timpul proceselor tehnologice de curatire. De
exemplu, in salam nemucegait din punct de vedere organoleptic s-au decelat 5 ppb aflatoxina B1,
iar in sunca chiar 100 ppb. Dupa Hurmeister si Leistner (1970) in conditii experimentale se pot
decela in derivatele de carne contaminate cu A. flavus pana la 26000 ppb aflatoxina B1 si 18 000
ppb de aflatoxina G1.
14
vitrocultivată
Autorii citati arata ca A. flavus si A. parasiticus se intalnesc relativ rar in produsele de

carne sarata insa daca astfel de tulpini toxinogene patrund in complexele alimentare reprezinta
un mare pericol, mai cu seama cand nu se poate respecta tehnologia de conservare. Dupa alti
autori, in produsele de carne contaminate experimental cu A. parasiticus, pot fi decelate pana la
450 000 ppb dupa, 18 zile si 912 000 ppb dupa 30 zile de la insamantare. Laptele si derivatele lui
pot, de asemenea, contine aflatoxina. Dupa date sintetizate de Neuman-Kleinpaul si Terplan
(1973), in anii 1962-63 s-a descoperit, in laptele vacilor furajate cu arahide mucegaite, o
substanta care produce la bobocii de rata modificari similare celor produse de aflatoxinele pure.
Dupa numele englezesc al laptelui, substanta a fost denumita aflatoxina M. Mai tarziu s-a
dovedit ca aflatoxina M este formata din doua fractiuni (M1 si M2), derivate ale aflatoxinei B1 si
ca procesul de transformare a aflatoxinei B1 in M1 are loc in ficat. In lapte, aflatoxina M1 apare
dupa 12-24 ore de la ingerarea furajului care contine aflatoxina B1, impreuna cu, o cantitate mica
din aflatoxina initiala. Rata de conversie a aflatoxinei B1in M1 care se elimina prin lapte este de
circa 0,25%. Dupa 3-4 zile de la incetarea consumului de furaj toxic aflatoxinele nu mai pot fi
decelate in lapte. S-a dovedit ca aflatoxina M1 poate fi sintetizata si direct de catre unele tulpini
de Aspergillus, ba chiar ca poate fi sintetizata "de novo" in organismul animal. Prin pasteurizare
sau prin pulverizare continutul laptelui in aflatoxina M1, nu scade. Aflatoxina M1, a fost
decelata in laptele-praf in cantitate de 0,67-2 μg/kg, avand originea in furajele mucegaite care au
fost consumate de vacile de lapte. In branza, aliment care poate mucegai in perioada de
conservare si de maturizare, se pot sintetiza cantitati suplimentare de aflatoxina, in afara de cele
provenite prin lapte din furajul consumat de animalele producatoare de lapte. In 222 probe de
branza din comert, Kiermeier (1972) a decelat aflatoxina in procent de 7%, folosind ca test
embrionul de gaina. S-a ales acest test pentru a se evita erorile care pot surveni prin folosirea
altor metode mai putin sigure cu ajutorul carora procentul de probe pozitive a fost 12.
Prezenta aflatoxinelor in furaje a devenit o constatare curenta a laboratoarelor utilate in
acest scop, Schultz si Motz (1997), de exemplu, au cercetat 80 nutreturi combinate in ce priveste
continutul in aflatoxina dintre care au gasit 23 probe pozitive, continutul in aflatoxina al unora
dintre nutreturile cercetate si al componentelor acestora in corelatie cu numarul de spori de
micete/g furaj. Aflatoxinele pot fi eliminate nu numai pe arahide, ci si pe mazare, grau, secara, si
sroturi de soia si de rapita. Continutul in aflatoxina B al furajului combinat pentru vacile de lapte
15
vitrocultivată
este de 3 ori mai mare (0,3 ppm) decat limita maxima admisibila (0,1 ppm). Se poate observa ca
este posibil a se stabili originea aflatoxinei in nutretul combinat.
Neconcordanta care se observa, uneori, intre continutul in aflatoxina al nutretului
combinat si al sumei continutului in aflatoxina al sortimentelor din care este compus nutretul
combinat, poate fi explicata prin neomogenizarea perfecta a aflatoxinei in nutretul combinat si in
sortimentele din care este compus acesta. Se mai constata ca aflatoxina G este prezenta intr-o
cantitate mai mica decat aflatoxina B. Aceasta diferenta se poate explica. intre altele, prin
sensibilitatea mai mare a aflatoxinei G fata de razele ultraviolete in prezenta aerului si fata de
substantele alcaline.
Un raport direct intre continutul in aflatoxina si numarul de spori determinat pe gramul de
nutret nu exista. Aceasta neconcordanta se datoreaza faptului ca nu sporii sunt aceia care
elaboreaza aflatoxina, ci miceliile al caror volum nu este proportional cu numarul sporilor.
Datele obtinute in conditii tehnice ireprosabile, demonstreaza ca elaborarea aflatoxinei
este posibila si in conditii de clima temperata in care se incadreaza si tara noastra. Pe aceasta
linie, Taga si col, (1968), ajung la concluzia ca faina de porumb, turtele de floarea-soarelui,
porumbul concentrat, taratele de porumb, de grau si de orz si laptele praf sunt substraturile
propice pentru elaborarea aflatoxinelor. Alte colective conduse de Adamesteanu, Elefterescu,
Stancu Niculina, etc, deceleaza, in mod curent, aflatoxina din diverse produse furajere sau
alimentare in tara noastra.
Proprietaţile fizico-chimice ale aflatoxinelor
Structura chimica a aflatoxinelor (difuronocumarine) a fost stabilita simultan de mai
multi autori citati de Bosenberg (1970). Greutatile moleculare ale aflatoxinelor variaza intre 312
(aflatoxina B1) si 316 (aflatoxina G2a. Greutatile moleculare mici explica lipsa proprietatilor
antigenice ale acestor substante. Intre proprietatile cu importanta practica ale aflatoxinelor se
citeaza termostabilitatea, o inactivare prin caldura fiind de asteptat, numai la temperatura de
peste 1000C intr-un mediu umed si dupa un timp indelungat. Sunt solubile in alcool etilic, alcool
metilic, amestec de acetona cu apa si, cel mai bine, in cloroform. Sunt insolubile in hexan,
heptan, dietileter si eter de petrol. In solutie, in special apoase, sunt sensibile fata de aer, lumina,
inclusiv cea ultravioleta.
16
vitrocultivată
Metode pentru decelarea aflatoxinelor

Pentru decelarea aflatoxinelor in furaje si in alimente sau in culturi de micete se folosesc
metode fizico-chimice si metode biologice. Primele au avantajul rapiditatii de executare si al
sensibilitatii insa si dezavantajul unor eventuale confuzii in cazul nerespectarii intocmai a
tehnicilor de lucru. Metodele biologice sunt mai lente, mai putin selective relevarea uneia sau
alteia dintre aflatoxine, dar mai sigure in ceea ce priveste punerea in evidenta a efectelor toxice,
chiar daca necesita cantitati mai mari de aflatoxina si o perioada de observatie mai lunga.
Metodele fizicochimice includ pregatirea probei, extragerea, purificarea, separarea
cromatografica a aflatoxinelor, identificarea si interpretarea.
In principiu, prelucrarea o oricarei probe incepe cu maruntirea si amestecarea uniforma a
materialului de cercetat. Mai departe, se face extragerea in aparatul Soxhlet - sau in vase agitate
mecanic (la rece) cu diferite substante extractante: cloroform, alcool etilic, acetona etc.
Purificarea extractului obtinut la cald sau la rece se face prin diferite procedee chimice sau pe
coloana cromatografica.
Aflatoxinele aplicate pe placile cromatografice se separa intre ele, cat si fata de alte
substante: in cauza vitezei diferite de difuziune in chiselgel. Dupa developarea placilor, se
observa in lumina ultravioleta niste pete fluorescente la diferite distante Rf. Determinarea
semicantitativa se face prin aprecierea intensitatii fluorescentei aflatoxinei standard aplicata pe
aceeasi placa intr-o concentratie cunoscuta.
In cele ce urmeaza, se redau cateva procedee pentru decelarea aflatoxinelor.
a) Pentru decelarea aflatoxinei in alimente si furaje, Frank (1998) amesteca (timp de 1
minut) o cantitate de 5-10 g proba uscata si bine macinata cu 50 ml acetona-apa (30/15 v/v) intr-
un aparat de omogenizare. Dupa aceea, se adauga 5 ml acetat de plumb 20%, se omogenizeaza
din nou si centrifugheaza. Apoi se preia supernatantul, iar depozitul este supus unei noi
omogenizari cu 50 ml acetona-apa, tot timp de 1 minut.
Dupa o noua centrifugare, se colecteaza supernatantul, se amesteca cu primul supernatant
si se toarna intr-un filtru printr-o palnie de separare in care se agita bine cu 20 ml cloroform.
Aceasta operatie se repeta de trei ori. Fazele cloroformice se colecteaza prin manevrarea
robinetului palniei si se trec printr-un filtru cu sulfat de sodiu. In lichidul astfel filtrat, se introduc
perle de sticla si se supune distilarii la o baie de apa clocotita. Produsul ramas se preia cu putin
17
vitrocultivată
cloroform si se usuca la o baie de nisip cu temperatura de 90-100°C. Inainte de a se incepe

extragerea aflatoxinelor, produsele care contin grasimi se degreseaza cu eter de petrol in aparatul
Soxhlet.
Intrucat in produsle granulate (cereale, furaje grosiere etc.) aflatoxinele nu sunt
repartizate uniform, se macina circa 1 kg din acestea, se amesteca foarte bine si din acest amestec
se preia proba de 5-10 g din care se extrage aflatoxina. Produselor lichide li se adauga acetona, in
asa fel incat volumul final de acetona-apa (35/15) sa includa si apa initiala. Urmeaza
cromatografia in strat subtire de placi de chiselgel cu grosimea de 0,25 mm, pregatite dupa Stahl
(1967) sau gata cumparate (DC-Fertigplatten Merck, Kieselgel - 0,25 mm). Proba se cerceteaza
in prezenta a doua standarde (unul intern si altul extern) la lumina ultravioleta de 366 nm,
folosindu-se pentru o proba 8 metode pentru developare. Proba care in toate cele 8 cazuri a dat
un rezultat asemanator cu standardul se considera pozitiva- pentru aflatoxina.
b) Pentru examinarea laptelui-praf in ce priveste continutul de aflatoxina M1, se
procedeaza, dupa Neumann-Kleinpaul (1972) astfel: se introduc 50 g produs de produs intr-un
balon Erlenmmeyer cu slif, se adauga 25ml apa distilata, 25 g chiselgur si 250 ml cloroform si se
agita mecanic timp de 30 minute.
Dupa aceea se filtreaza amestecul (la nevoie cu ajutorul pompei de vid) in palnie Buchner
prin hartie de filtru acoperita cu un strat de chiselgur cu grosime de 5 mm. Urmeaza
cromatografierea unei cantitati de 30 ml filtrat printr-o coloana cu dimensiunile de 22x300 mm,
prevazuta jos cu un robinet. Initial, se introduc in coloana 5 g sulfat de sodiu anhidru si se umple
pe jumatate cu cloroform. Apoi se introduc 10 g chiselgel inactivat 2 ore la 105 0C caldura uscata
si cu granulele de 0,05-0,2 mm si se spala peretii coloanei cu cloroform. Se amesteca cu o
bagheta de sticla si se lasa sa se depuna. Dupa aceea se adauga inca 15 g sulfat de sodiu anhidru
si se scurge cloroformul pana ce inca mai acopera continutul superior al coloanei. In acest
moment, se da drumul extractului cloroformic sa se scurga repede. Aflatoxinele nu se extrag cu
acest cloroform, ci raman inca pe coloana.
Mai departe, se face o spalare cu 150 ml n-hexan, si cu 150 ml dietileter inca o spalare. In
timpul acestor operatiuni, este necesar sa ramana inca acoperit continutul superior al coloanei.
In cele din urma, se elueaza aflatoxinele cu 150 ml metanol-cloroform (3/97), lasandu-se
sa se scurga complet intr-un vas cu capacitatea de 250 ml. Eluatul se evapora aproape complet pe
18
vitrocultivată
o baie de apa, apoi se preia cu cloroform, intr-un vas de 100 ml si se supune evaporarii pana la
uscare. Rezidul se preia cu 1 ml benzol acetonitril 98/2 prin agitare puternica. Din aceasta ultima
solutie, se iau 25 ml cu o seringa Hamilton si se aplica intr-un punct pe o placa de sticla acoperita
cu un strat de chiselgel cu grosimea de 25 microni si inactivata timp de 1 ora la 1050C.
Placa se developeaza intr-un vas de sticla cu cloroform-acetona 90/10. Pentru o extinctie
de 12 cm este necesar un timp de expunere de 30 minute. Dupa aceea se evapora lichidul si placa
se examineaza in lumina ultravioleta. Fluorescenta se apreciaza comparativ un standard extern de
aflatoxina pura si cu un standard intern din aflatoxina pura si extractul de cercetat. Pentru
relevarea culorii, placa se stropste cu acid sulfuric semiconcentrat.
c) Pentru examinarea laptelui prospat, Jacobson si col. (1971) indeparteaza in prealabil
caseina cu metanol. Filtratul prin chiselgur se aduce cu solutie 4% de clorura de sodiu la o
concentratie de 5% metanol si se degreseaza cu hexan. Aflatoxinele se pot, dupa aceea, extrage
cu cloroform. Extractul se usuca, se dizolva in benzol-hexan 1/1 si prin cromatografie pe coloana
se separa aflatoxina M1 de B1 cu o solutie apoasa de clorura de calciu.
Mai departe, aflatoxina B1 se elueaza cu benzol-acetona 98/2, iar M1 cu benzol-
cloroform 70/30. In cele din urma, eluatele se usuca, se supun cromatografiei, iar placile se
apreciaza semnificativ (vizual) in ultraviolete comparativ cu standarde.
d) Pentru analizei aflatoxinei din produsele de origine vegetala sau animala, Preda (1972)
propune doua variante tehnice in functie de gradul de dotare a laboratorului destinat.
1) Se introduc 50 g proba, bine maruntita, intru-un flacon conic impreuna cu 5 g chiselgur
si cu 150 eter de petrol. Dupa o agitare, de 15-30 minute, se filtreaza la trompa printr-un filtru
G5 si se spala de doua ori, cu cate 50 ml eter de petrol. Se aspira la uscare completa. Rezidul se
trece intr-un cilindru, cu slif de 250 ml si se extrage prin filtare puternica timp de 15 minute cu
un amestec de cloroform/metanol 1:1. Extractia se face la temperatura camerei sau dupa
incalzirea cilindrului, pana la 400 C. Extractul metanol-cloroformic se filtreaza si se reia cu 100
ml dintr-un amestec de eter de petrol-metanol (1:1) si se introduce intr-o palnie de separatie, in
care se pun in prealabil 5 ml apa distilata, care este necesara separarii fazelor.
Mai departe, faza etanolica se trece intr-o alta palnie de separatie, in care se face o noua
extractie cu 50 ml eter de petrol. Faza metanolica se trece intr-o a treia palnie de separatie si se
19
vitrocultivată
adauga 70 ml apa si circa 2 g clorura de sodiu (spargator de emulsie), solutia obtinuta este tratata
cu cloroform si se extrage, de 4 ori, cu cate 25 ml de fiecare data.
Extractul cloroformic contine aflatoxinele care, in faza urmatoare, se concentreaza sec,
iar pentru cromatografiere se dizolva rezidul in 1 ml cloroform.
2) Se marunteste bine o cantitate de 50 g de material de analizat, se introduce intr-un
flacon conic cu dop slefuit sau intr-un cilindru gradat de 250 ml, peste care se adauga un amestec
compus din 30% acetona si 70% apa si se agita foarte bine 30 de minute. Se filtreaza dilutia
acetonica si se supune purificarii si extractiei. In filtrat, se adauga 10-15 g chiselgur sau celita
545 si se agita bine pentru dispersare pe o coloana cromatografica, prevazuta la partea inferioara
cu un robinet, se introduce un fragment de vata, peste care se lasa filtratul. Vasul in care a fost
filtratul se spala cu hexan, si se adauga lichidul de spalare peste fractiunea filtrata, fara a se lasa
sa se usuce chiselgurul.
In continuare, se adauga circa 200 ml hexan pentru indepartarea impuritatilor. Dupa
eluarea celor 200 ml hexan, se adauga un amestec de hexan-cloroform (1:1) care antreneaza
aflatoxinele. In tot timpul lucrului, se are grija ca chiselgurul sau celita sa nu se usuce, iar
fractiunea hexan-cloroform sa fie culeasa imediat dupa adaugarea solventului. Eluarea se face cu
150-200 ml solvent care, in cele din urma, se concentreaza pana la obtinerea unui rezidu.
Acesta se dizolva in 1 sau 2 ml cloroform si este folosit pentru cromatografiere, in
vederea careia se folosesc placi cu strat de silicagel "G" in grosime de 250 microni si activate
timp de 30 minute la 1100C. Din rezidul dizolvat in cloroform (in cazul ambelor metode) se
aplica spoturi sub forma circulara sau liniara la 4 cm de baza placii si in cantitati bine
determinate. Alaturi, se aplica solutiile standard de comparare. Developarea se face cu unul
dintre sistemele:
- cloroform - metanol (9:1);
- cloroform - metanol (9:2);
- cloroform - acetona (9:1).
Este de recomandat ca placa sa fie de peste 12 cm inaltime pentru nivelul de irigare sa fie
peste 10 cm. In timpul cromatografierii, placa trebuie sa fie expusa luminii cat mai putin, la
temperatura camerei fie de 23-250C. Relevarea spoturilor se face cu ajutorul luminii ultraviolete,
filtrata prin filtru Wodd. Dupa aspectul fluorescentei si al Rf-ului, se face interpretarea
20
vitrocultivată
cromatografica in functie de cantitatea aplicata de standard si de cantitatea de material luat in

lucru.
Metodele biologice pentru decelarea aflatoxinelor folosesc embrionul de gaina, bobocul
de rata, culturile celulare, unele animale inferioare, bacterii, ciuperci, alge, etc.
Utilizarea bobocului de rata consta in punerea in evidenta a gradului de proliferare a
canaliculelor biliare, dupa administrarea materialului suspect de a contine aflatoxine la bobocii
de rata in varsta de o zi. In cea de a 8-a zi, se sacrifica bobocii de rata ramasi in viata si se noteza
gradul de proliferare a celulelor canaliculelor biliare in preparatele histologice din ficat. Tot pe
bobocul de rata se poate cerceta gradul de toxicitate al aflatoxinelor prin administrarea orala a
materialului suspect si stabilirea numarului de morti dupa 7 zile. Printr-o alta metoda, materialul
de cercetat se apreciaza ca foarte toxic daca bobocii de rata, care au consumat 80 grame furaj
suspect, mor in interval de 7 zile cu leziuni caracteristice. Daca bobocii de rata supravietuiesc
dupa 7 zile, insa prezinta la autopsie leziuni hepatice, produsul furajer testat este apreciat ca usor
toxic. In felul acesta, aflatoxina b1 poate fi decelata pana la o concentratie de 1/1 000 000.
CAPITOLUL 2. SCURT ISTORIC AL CERCETĂRILOR CULTURILOR DE

ŢESUTURI ŞI CELULE VEGETALE ÎN DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI
VEGETALE ÎN ŢARA NOASTRĂ
Cultura de ţesuturi şi celule vegetale ca problematică nouă îşi are începutul în ţara noastră
la Fundulea, în 1976. După o perioadă de cercetări metodologice, au fost obţinute cu succes
culturi de calus şi regenerarea plantelor din celule somatice la principalele specii de cereale,
plante tehnice şi furajere. Cercetările privind extinderea capacităţii de fixare a azotului
atmosferic la plante neleguminoase (cereale şi plante tehnice) au debutat în anul 1977, cu studiul
unor asociaţii fixatoare de azot, între rădăcinile plantelor şi microorganismele diazotrofe,
capabile să furnizeze partenerului vegetal azot asimilabil şi fitohormoni. Ca rezultat al unui
număr mare de experienţe, a fost elaborat un mediu original de cultură şi s-au obţinut culturi
stabile de calus la mai multe specii de cereale şi graminee furajere (grâu, triticale, orz, porumb,
21
vitrocultivată
Elymus sp., raigras), atât din ţesuturi somatice, cât şi din polen. S-a reuşit, de asemenea,
inducerea şi menţinerea de culturi stabile de calus la floarea-soarelui, lucernă şi soia.
Un interes deosebit a fost acordat simbiozelor asociative la porumb, grâu şi graminee cu
bacteriile din genul Azospirillum, demonstrându-se faptul că aceste sisteme plastice sunt
condiţionate în special de genotipul plantei şi agrofond. În scopul ameliorării acestor simbioze
asociative naturale (rizogeneze diazotrofe) a fost urmărită reacţia diferitelor genotipuri de
porumb şi de grâu la inocularea experimentală cu mai multe tulpini bacteriene. Concomitent, s-a
studiat modul în care asociaţiile bacteriene au asigurat parţial necesarul de azot prin procesul de
fixare biologică, precum şi aportul la creşterea producţiei (Popescu şi colab., 1981). Paralel cu
aceste cercetări au fost iniţiate din anul 1981 şi lucrări de transfer de informaţie genetică nif la
plante neleguminoase (Popa şi Popescu, 1983).
Regenerarea plantelor din ţesuturi cultivate s-a realizat cu randament satisfă-cator atât pe
calea embriogenezei somatice, cât şi prin organogeneză somatică, la urmatoarele specii: Triticum
aestivum, Triticum durum, Triticale, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Zea mays şi Lolium
multiflorum, selecţionându-se dintrun inocul iniţial linii din calus embriogen din care s-au regerat
ulterior un număr mare de plante la grâu şi raigras (Palada, 1984 b).
Cercetările de androgeneză la forme hexaploide de triticale (Badea şi colab., 1992) au
avut drept scop stabilirea influenţei mediilor de cultură şi a genotipului asupra abilităţii
androgenetice. S-au folosit cinci forme de triticale şi 20 hibrizi F1 obtinuţi din încrucişarea lor.
Rezultatele obţinute au evidenţiat faptul că încrucişarea unor linii şi soiuri care posedă capacitate
androgenetică ridicatăconduce la obţinerea de hibrizi la care se manifestă efectul heterozis pentru
acest caracter. Cealâcu şi colaboratorii (1992) au efectuat studii referitoare la controlul biochimic
al embriogenezei somatice la lucernă şi au evidenţiat specificitatea de soi şi de tip de explant a
peroxidazei la trei soiuri cu potenţial embriogen diferit. Din ţesuturile cultivate in vitro au fost
identificate două tipuri de zimograme caracteristice pentru calusul embriogen, respectiv
neembriogen. Primele informaţii privind rezistenţa la nivel celular la stresul salin, la lucernă, au
fost furnizate de către Cealâcu şi Varga (1994), care au raportat obţinerea de linii celulare
tolerante la salinitate. Studii ulterioare efectuate la nivel biochimic (activitatea peroxidazei,
chitinazei şi conţinut în prolină) au evidenţiat o creştere a toleranţei la salinitate a plantelor
generaţiei R1.
22
vitrocultivată
Prin metode biotehnologice (utilizând selecţia in vitro la nivel celular) şi metode clasice
de ameliorare, a fost creat soiul Sigma, soi cu însuşiri superioare de producţie şi calitate
superioară a furajului (distinctivitate, stabilitate, omogenitate) faţă de soiurile martor Adonis şi
Selena (Varga şi colab., 1994).
De asemenea, au fost identificate genotipuri de porumb cu capacitate mare de regenerare
in vitro. Aceiaşi autori au efectuat studii privind toleranţa la ioni de Al3+ a calusului
neembriogen/embriogen de orz şi orzoaică. S-a constatat că variaţia greutăţii calusului după
perioada de selecţie a fost corelată cu tipul de calus utilizat, calusul neembriogen înregistrând
modificări minime, deoarece situsul activ de fixare a ionilor de Al3+ este reprezentat de
membranele celulare şi nucleele celulelor în diviziune activă. Rezultate ale unui studiu privind
potenţialul embriogen la unele genotipuri de grâu comun, linii şi soiuri româneşti şi străine, în
care s-a urmarit identificarea tipurilor de calus embriogen şi stabilirea unor parametri cantitativi,
precum şi expresia izoenzimelor peroxidaza şi esteraza în timpul embriogenezei somatice au fost
raportate de Cealâcu şi colaboratorii (1996). Autorii au observat că tipul de calus embriogen,
prezent cu frecvenţa cea mai mare, pe parcursul embriogenezei somatice, a fost calusul de tip II
cf. nomenclaturii TCA, iar în urma analizei electroforetice a peroxidazei şi esterazei, s-a
constatat că acestea sunt carateristce fiecărui genotip. Calusurile embriogene au exprimat un
număr mai mare de izoperoxidaze iar esteraza a prezentat un polimorfism mai accentuat
comparativ cu peroxidaza. Variabilitatea manifestată de către peroxidazăsugerează faptul că
această enzimă poate fi considerată drept marker al capacităţii embriogenetice în cultura in vitro,
la grâul comun.
Marian Verzea şi colaboratorii La I.N.C.D.A. Fundulea s-au iniţiat în 1991 cercetări
privind aplicarea sistemelor biotehnologice Zea şi Bulbosum pentru inducerea de haploizi şi
obţinere de linii DH la grâul comun, grâul durum şi triticale, respectiv la orzul şi orzoaica de
toamnă şi primavară şi la orzul golaş (Giura şi Mihăilescu, 2000). Stabilirea protocolului de lucru
pentru utilizarea celor două sisteme în condi-ţii experimentale suboptime (seră) s-a realizat pe
durata mai multor cicluri de hibridare şi a determinat creşteri semnificative ale ratelor de succes
pentru fiecare din cele 12 faze de lucru ale protocolului (Giura, 1993, 1998, 2006; Mihăilescu şi
colab., 1993, 1994, 1995). La grâul comun (Triticum aestivum L.), îmbunătăţirile aduse
protocolului de lucru au condus la creşterea valorilor componentelor ce definesc eficienţa
23
vitrocultivată
producerii de haploizi prin sistemul Zea. Astfel, numărul de cariopse formate per spic lucrat s-a
dublat, ajungând de la o valoare medie de 9,2 în 1991 la 18,8 în 2002 şi 16,5 in 2005, iar
valoarea medie de embrioni la 100 flori polenizate a crescut de la 8,0 în 1991 la 24,7 în 2002 şi,
respectiv, 24,1 în 2005. În perioada 1991-2005 în programul producerii de haploizi pentru
ameliorarea grâului comun au fost cuprinse 265 combinaţii hibride F1 de la care s-au obţinut
58339 embioni haploizi, din care s-au cultivat in vitro peste 50.000 embrioni. În medie, la grâul
comun s-au produs în ultimii ani între 1500 şi 2000 linii dublu haploide într-un singur ciclu anual
de hibridare grâu x porumb, de 30-40 zile. La grâul durum (Triticum durum L.)şi triticale
încercările de aplicare a sistemului Zea au fost pentru început relativ neconcludente din cauza
răspusurilor genotipice foarte diferenţiate, cele două specii fiind considerate uneori refractare la
aplicarea sistemului Zea.
Materialul genetic astfel obţinut a fost introdus în programele de ameliorare al speciilor
studiate. Au fost obţinute noi tehnologii de cultură şi au fost îmbunătăţite cele deja existente în
vederea creşterii randamentului de regenerare şi aclimatizare a plantelor la transferul de la
condiţii de cultură in vitro la cele in vivo.
Calusul este o formaţiune particulară constituită dintr-o masă nedeterminată de celule
deţinând o structură histologică uniformă. De regulă, când este tânăr, posedă celule
nediferenţiate, care se divid activ. Un anumit tip de calus se produce şi în mod natural, fie la
nivelul zonelor traumatizate, având rol în cicatrizarea rănilor, fie se formează la baza butaşilor
plantaţi pentru înrădăcinare, constituind zona de geneză a rădăcinilor adventive. În funcţie de
obiectivul urmărit, obţinerea de calus poate constitui un scop în sine, alteori apariţia şi
dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formării de calus cât mai friabil constituie
scopul principal atunci când se urmăreşte iniţierea unei culturi de celule, iar din acestea a unei
culturi de protoplaşti. Instabilitatea genetică a celulelor sale şi poliploidizarea facilă a lor, în
anumite condiţii de cultură, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros asupra
căruia agenţii mutageni şi factorii stresanţi pot opera modificări, selectându-se linii cu calităţi
speciale. Multiplicarea clonală, via calus nu este posibilă tocmai din cauza facilei poliploidizări a
celulelor sale. Pe această cale se practică însă înmulţirea regenerativă, rapidă a unei specii, fără a
avea siguranţa conservării genotipului. La unele specii: morcov, tutun, crizanteme din calus se
24
vitrocultivată
pot obţine uşor plante. La specii ierboase (bumbac) sau la plante lemnoase (stejar), geneza de
plante din calus este extrem de dificilă.
Fig.5. Diferite forme de calus şi organogeneza iniţiată la nivelul calusului

Atunci când se urmăreşte multiplicarea clonală rapidă, formarea de calus în porţiunea
bazală a explantului sau transformarea întregului inocul într-o masă de calus constituie un
fenomen care perturbă dirijarea proceselor de morfogeneză. Astfel, administrarea unei balanţe
hormonale neechilibrate, face ca la baza explantului să se genereze calus, cauzând dezvoltarea
preponderentă a rădăcinilor, în defavoarea diferenţierii muguraşilor sau invers, se formează unul
sau mai mulţi muguraşi, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare muguraş trebuie detaşat şi
subcultivat pe un mediu cu sau fără auxină. Această metodă se practică cu succes, atunci când se
procedează la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia şi Gerbera), constând
în desprinderea de propaguli, de pe un ţesut calusal comun de dimensiuni minime generat din
inoculul iniţial, situat în porţiunea bazală a coloniei de propaguli.
Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită, întrucât el poate fi înmulţit şi
cultivat la nesfârşit, atunci când, periodic, se procedează la repicarea, respectiv la fragmentarea
lui. Fiecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspăt. Calusul crescut la 25 oC se
recomandă a fi repicat la un interval de 4-6 săptămâni, în dependenţă de natura ţesuturilor din
25
vitrocultivată
care a provenit şi de condiţiile în care a fost cultivat. Numai prin subcultivări repetate poate fi
conservată vitalitatea celulelor sale. Dacă calusul nu este subcultivat în timp util, se produce o
îmbătrânire a celulelor sale, masa tisulară îşi schimbă culoarea, din gălbui, galben-verzui ori
verde, devenind cenuşie sau galben-brună; uneori culoarea calusului devine roşiatică sau vişinie,
datorită formării şi acumulării de antociani în sucul vacuolar. Provenienţa calusului şi natura
inoculului iniţial influenţează sinteza antocianilor. Street (1973) precizează că trecerea calusului
în suspensie celulară duce la scăderea substanţială a cantităţii de antociani. De altfel, s-a
constatat că anaerobioza inhibă formarea antocianilor (Gautheret, 1959, citat de Cachiţă, 1984).
În general, prezenţa luminii şi natura acesteia intensifică acumularea în celule a antocianilor.
Antocianii sunt sintetizaţi însă şi la întuneric. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultură de celule
de Haplopappus cu raze UV, a izolat o linie celulară cu un conţinut foarte ridicat de antociani.
Fitohormonii de creştere şi natura acestora influenţează şi ei sinteza antocianilor. Astfel, auxina
inhibă, iar citochininele stimulează formarea antocianilor (Street, 1977; Kalinin, 1981).
Temperatura scăzută, carenţa de azot şi conţinutul ridicat al mediului de cultură în glucide
stimulează sinteza de antociani. Se pare că zaharoza intervine prin presiunea osmotică pe care o
creează, întrucât şi un conţinut ridicat de NaCl stimulează formarea acestor pigmenţi.
La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai multă uşurinţă, decât la gimnosperme
sau la monocotiledonate.
Pe măsură ce calusul depăşeşte un număr de zile de cultură, în profunzime se diferenţiază
centri vasculari, ori noduli organoformatori. În morfo şi organogeneza calusului un rol
determinant îl au mediul de cultură şi condiţiile de cultură, natura ţesuturilor din care a provenit
calusul şi vârsta acestora.
Formarea, creşterea şi aspectul calusului sunt dependente de natura şi concentraţia
fitohormonilor de creştere, prezenţi în mediile de cultură. De regulă, concentraţiile ridicate de
auxină conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente auxine în inducerea de calus s-au dovedit
a fi acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) şi acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T), folosite în
concentraţii cuprinse între 1-10 mg/l.
În general, calusul poate fi generat cu uşurinţă din material vegetal de provenienţă
diferită, chiar şi din ţesuturi cu structură definitivă. Astfel, prin inocularea de liber secundar,
26
vitrocultivată
muguri, meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat în 2,4D, se ajunge uşor la
formarea de calus.
Celulele ţesutului calusal pot fi mai compacte, legate între ele, sau pot fi mai laxe,
formând un calus friabil, grunjos, separabil în fragmente granulate, de mărimi diferite, mai greu
dezagregabile, sau spumos, ce se separă în formaţiuni tisulare fine, adecvat pentru iniţierea unei
culturi de celule. Consistenţa şi friabilitatea ţesutului calusal depind de specie, de natura
organelor din care au fost detaşate explantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de
creştere prezenţi în substratul de cultură şi uneori de condiţiile de cultură. Capacitatea
organogenă sau embriogenă a ţesutului calusal este dependentă atât de factorii endogeni şi
exogeni, de numărul repicajelor făcute, de condiţiile de cultură şi de vârsta calusului. Se cunosc
cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar şi după cinci ani, îşi menţin o potenţialitate
ridicată de a regenera plante (la tutun). Calusul provenit din plantele monocotiledonate (cereale)
are o capacitate regenerativă scăzută, evaluată la câteva săptămâni (Conger, 1981).
Dintr-un inocul iniţial se obţine calus de tip primar, ce conţine un număr de aproximativ
50 000 celule. După cca şase săptămâni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a
putea fi subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspăt, se numeşte calus
secundar.
Calusul obţinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna dă naştere la noi plante şi un
calus de tip neregenerativ ce prezintă, de regulă, o creştere luxuriantă, din el diferenţiindu-se
rădăcini, şi uneori muguraşi, dar niciodată plante (Nabors, 1982). Aceste două tipuri de calus au
mai fost denumite calusuri embriogene şi neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid
sau opac de culoare albă-lăptoasă, spre galbenă, ori galbenă-verde. Citologic se remarcă zone
compacte, cu celule nediferenţiate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor
forma plante complet formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o masă cristalină,
transparentă, de culoare albă, brunie sau verde. Acest tip de calus prezintă o consistenţă mai laxă,
fiind mai friabil, desfăcându-se uşor în pachete de celule. Regiunile friabile prezintă celule mari,
mult vacuolizate. Aceste regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi dar niciodată plante.
Nabors a fost primul care a dovedit că cea mai ridicată capacitate regenerativă, menţinută timp
îndelungat o prezintă calusul embriogen, denumit de tip regenerativ. Tot Nabors a observat că
acest calus regenerativ tinde să devină neregenerativ; după producerea acestei reversibilităţi
27
vitrocultivată
procesul este definitiv, întrucât cele două forme sau tipuri de calusuri, diferite funcţional, nu sunt
interconvertibile. De altfel, cele două tipuri de calusuri necesită fitohormoni diferiţi, în doze
variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. De regulă,
calusul neregenerativ creşte abundent, în timp ce calusul regenerativ are o creştere mult mai
lentă, chiar şi pe medii potrivite scopului menţinerii unei creşteri susţinute a acestuia. Pentru a
preîntâmpina dezvoltarea neomogenă a calusului se urmăreşte obţinerea unui calus regenerativ
omogen sau cel puţin predominant ca masă, într-o populaţie de celule calusale. Nabors a
remarcat şi faptul că ceea ce la un anumit moment, într-un anumit stadiu de dezvoltare a
calusului, pare să fie ţesut de tip neregenerativ, poate genera, în continuare, regiuni regenerative,
ce pot fi izolate şi subcultivate (Cachiţă, 1984).
Frecvent, cele mai bune medii de cultură, adecvate creşterii optime a ţesutului calusal, nu
constituie medii corespunzătoare producerii calusului de tip regenerativ. În general, mediul
Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziţie similară, respectiv sărace în azot cu pH-ul 5,5
sunt de preferat. La cereale se recomandă adăugarea în mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic,
având efect pozitiv în susţinerea creşterii calusului. Acest mediu însă nu este cel mai potrivit
pentru inducerea şi menţinerea proceselor regenerative.
În general, calusul care provine din rădăcini de plantule de cereale posedă mai multe
regiuni cu calus de tip regenerativ, în raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. Dar şi la
calusul bogat în zone regenerative acestea reprezintă numai cca 1-10% din totalul masei calusale.
Dacă regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care să impulsioneze şi să
susţină procesele regenerative, celulele lui vor da în final naştere la plante.
Calusul de tip regenerativ poate fi obţinut şi din calusul secundar, prin menţinerea
calusului regenerativ pe mediu potrivit creşterii acestuia şi nefavorabil obţinerii de plante,
intervenindu-se periodic, prin subcultivări de întreţinere. Pe altă cale se pot identifica şi izola
insulele de calus regenerativ, pe măsură ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizându-se
transferarea lor pe un mediu de creştere adecvat.
În decursul timpului s-a constatat că se obţine mai mult calus din inoculii cultivaţi la
întuneric decât din cei crescuţi la lumină. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu
depistabile pe calusurile crescute la întuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ
creşte însă la calusul crescut în condiţii de întuneric. La grâu, calusul trebuie transferat la
28
vitrocultivată
interval de cinci săptămâni, pe mediu potrivit inducţiei diferenţierii de plante. La calusul de grâu,
regenerarea se realizează pe un mediu lipsit de fitohormoni de creştere; astfel din calusul de tip
regenerativ, în cca 2-5 săptămâni după transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are
loc formarea de plante. Pe un astfel de mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai creşte. Dacă
calusul este mixt, componenta neregenerativă continuă să crească mult; concomitent, însă, din
porţiunile de calus de tip regenerativ, în cultură se diferenţiază şi plante. După două subcultivări
ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni de creştere, potrivit inducerii
neoformării de plante, se recomandă transferarea calusului rămas, pe un mediu conţinând auxină,
pentru a favoriza continuarea creşterii acestuia.
Plantele obţinute sunt detaşate de calus şi sunt plasate în vase deschise, conţinând perlit,
care va fi udat cu apă de la robinet, urmând ca după 1-2 săptămâni, plantele bine înrădăcinate, să
fie transferate în ghivece cu pământ în amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit şi în obţinerea unei culturi de celule, cultivându-l pe medii lichide,
obţinând-se astfel suspensiile celulare folosite în diferite scopuri.
Fig.6. Suspensii de celule vegetale pe agitator cu suporturi
În vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape:
29
vitrocultivată
- alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor. Calusul poate
fi obţinut din explante provenite din diverse surse: seminţe, embrioni, rădăcini, ţesut de rezervă,
frunze, ramuri, antere, ovare;
- prepararea mediilor de cultură şi alegerea tipului de mediu se vor face în funcţie de
scopul propus. Atunci când scopul este doar obţinerea de calus se poate utiliza un mediu de
cultură oarecare, conţinând substanţe anorganice (macro şi microelemente) şi substanţe organice
(sursă de carbon organic, vitamine, aminoacizi şi fitohormoni), iar solidificarea mediului se
realizează cu agar;
- sterilizarea recipientelor şi a mediilor de cultură;
- pregătirea materialului vegetal în vederea dimensionării explantelor. Se realizează
curăţirea organelor şi dezinfectarea lor, folosind diverse procedee în funcţie de tipul de explant
utilizat;
- dimensionarea explantelor este diferită în funcţie de specia la care se lucrează şi de tipul
de organ folosit ca sursă de explante;
- inocularea explantelor se realizează în condiţii aseptice, la hota cu flux de aer steril, fie pe
mediu solid fie pe mediu lichid când însă este necesară agitarea în vederea aerării culturii;
- incubarea inoculilor se face fie la întuneric, fie la lumină, de regulă la temperatura de
25oC;
- observarea proceselor de formare a calusului şi urmărirea creşterii acestuia se face
periodic, la diverse intervale de timp;
- subcultivarea periodică se realizează prin fragmentarea calusului şi inocularea
fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectuează la cca 4-6 săptămâni, fiind
obligatorie pentru menţinerea viabilităţii calusului. Este importantă ţinerea unei evidenţe stricte a
numărului de subcultivări suportate de către fiecare fragment de ţesut calusal;
- urmărirea proceselor de organogeneză sau de embriogeneză funcţie de condiţiile în care a
fost cultivat calusul, de provenienţă şi de vârsta acestuia.
Ţesutul calusal are o utilizare variată. El constituie unul din materialele biologice asupra
căruia se pot aplica diferiţi agenţi selectivi, în scopul obţinerii de linii rezistente, pentru
selecţionarea de plante care să fie tolerante la prezenţa în mediul lor de viaţă a unui anumit factor
de stres. Nabors (1982) a reuşit să obţină calus şi apoi plante rezistente la concentraţii ridicate de
30
vitrocultivată
NaCl, substanţă introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură. Astfel, a raportat

obţinerea de plante de Triticum, Orisa şi Pennisetum tolerante la concentraţii ridicate de NaCl
(0,6-0,9%), precum şi la Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la 0,03%. La grâu,
cel mai bun calus, care răspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obţinut din rădăciniţa
embrionară, dezvoltat în condiţiile germinării cariopselor pe medii aseptice.
Atunci când se urmăreşte cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de grâu se
sterilizează, după care, la microscop, se detaşează embrionii, evitându-se lezarea acestora şi
inoculându-i pe mediu de cultură.
Mediul de cultură recomandat pentru grâu (cariopse sau embrioni imaturi) este
Linsmaier-Skoog, conţinând macro şi microelemente, vitamine, sursă de carbon (zaharoză),
fitohormoni (2,4D sau 2,4,5 T) şi agar.
Agenţii selectivi la care dorim să obţinem toleranţă pot fi introduşi fie în mediul de
cultură, preparat pentru inducerea formării de calus, fie se adaugă în substratul de cultură destinat
repicării calusului. În cazul în care se utilizează ca material biologic de iniţiere a culturii de
calus, o varietate în mod natural mai rezistentă la acţiunea dăunătoare a agentului selectiv în
cauză, se realizează o reducere a timpului de obţinere a unei linii rezistente, cu caracterele
dobândite stabilizate, transmisibile descendenţilor. S-a constatat că stabilitatea caracterelor
dobândite este dependentă de durata în care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv
durata de timp în care s-a operat selecţia. Pentru a fi atinsă o stabilă toleranţă, chiar şi în
condiţiile absenţei îndelungate din mediu a agentului selectiv, sunt necesare cel puţin şase luni de
călire şi selecţie, prin subcultivări repetate. Menţionăm că şi în situaţia unor experimente de acest
gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenţierii capacităţii regenerative a calusului, în
calus de tip regenerativ şi neregenerativ. Numai din calusul de tip regenerativ se poate induce
formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este inutilizabil în acest gen de experimente.
Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de cercetare în diferite experimente de fiziologie,
în studierea problemelor de morfogeneză, în urmărirea unor modificări ultrastructurale, în
analize de ordin biochimic, sub acţiunea unor anumiţi factori, administraţi exogen sau în
dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul.
31
vitrocultivată
În acest sens, calusul de Zea mays obţinut de către noi în laborator a fost utilizat ca
monitor al reacţiei celulei vegetale la aflatoxina B1, permiţând efectuarea unor experimente de
fiziologie privind: creşterea, morfo şi organogeneza şi testarea viabilităţii celulare.
CAPITOLUL 3. CERCETĂRI PERSONALE CU PRIVIRE LA MODIFICĂRILE

FIZIOLOGICE ALE HIBRIZILOR DE ZEA MAYS L. PRODUSE DE AFLATOXINA B1
3.1. Materiale şi metode de cercetare utilizate în obţinerea de vitroculturi de Zea mays pe

mediu Murashige&Skoog simplu sau suplimentat cu 2,4-D
Materialul biologic care a stat la baza investigaţiilor noastre a fost unul semincier
reprezentat de 4 tipuri de hibrizi de Zea mays proveniţi din populaţii locale colectate din judeţul
Timiş. Aceşti hibrizi care au fost trataţi chimic sunt: Pako, Cobalt, Symba şi Thermo.
Consultând diferite metode de sterilizare şi cultivare pentru efectuarea experimentelor
noastre am elaborat un protocol de lucru. Astfel, au fost parcurse mai multe etape:
a. Iniţial am determinat capacitatea germinativă a cariopselor de porumb; pentru aceasta am
procedat la germinarea cariopselor pe hârtie de filtru în cutii Petri. În vederea germinării,
cariopsele au fost spălate timp de 24 h la curent de apă, puse într-un săculeţ de tifon atârnat sub
jet de apă rece de la chiuvetă pntru a îndepărta impurităţile de la suprafaţa acestora. Cariopsele
( câte 10 din fiecare tip hibrid) au fost puse în câte o capsulă Petri pe rondelă de hârtie de filtru
umectată cu apă distilată după care au fost închise fiecare cu capacul. La 3 zile, asupra acestora
s-au făcut observaţii ochiometrice. Cariopsele au germinat, atingând un stadiu înalt de dezvoltare
într-un timp scurt. S-a ajuns la concluzia că hibridul Pako prezintă capacitatea germinativă cea
mai mare în timp ce hibridul Cobalt a germinat foarte lent.
b. Bazându-ne pe rezultatele obţinute în urma germinării pe hârtie de filtru, am trecut la
următoarea etapă: cea de inoculare a cariopselor de porumb pe mediu de cultură agarizat simplu
sau îmbogăţit cu regulatori de creştere. Cariopsele au fost mai întâi spălate timp de 24 h la curent
de apă, puse într-un săculeţ de tifon atârnat sub jet de apă rece de la chiuvetă pntru a îndepărta
impurităţile de la suprafaţa acestora. Pentru sterilizarea materialului vegetal prealabil iniţierii
culturilor in vitro au fost testaţi 2 agenţi de sterilizare diferiţi: Domestos şi hipoclorit de Ca în
diferite concentraţii şi durate de acţiune. Astfel, cariopsele ( câte 30 din fiecare tip de hibrid) au
32
vitrocultivată
fost sterilizate cu hipoclorit de Ca timp de 15 min.şi cu Domestos timp de 15 min., ultima

metodă dovedindu-se a fi cea mai eficientă. Mediul de cultură utilizat în cazul culturilor a constat
din macro şi microelemente ( inclusiv Fe EDTA) Murashige-Skoog ( 1962) la care au fost
adăugaţi compuşi organici după urmează: vitamine ( tiamină HCl, piridoxină HCl şi acid
pantotemic, câte 1mg/l din fiecare), mezo-inozitol 100mg/l, iar ca regulator de creştere am
utilizat acid 2,4-diclorofenoxiacetic, în concentraţie de 2 mg/l. Mediile de cultură porţionate în
recipiente au fost sterilizate prin autoclavare timp de 25 min.la temperatura de 121 0C. Cariopsele
au fost inoculate, respectând poziţia creşterii embrionului ( cu scobitura în jos). Inoculările au
fost făcute în hota cu flux laminar orizontal de aer steril. Recipientele cu inoculi au fost
amplasate pe rafturi cu tuburi fluorescente, emitente de lumină albă, fotoperioada a corespuns la
16 ore lumină/ 24h, regimul termic fiind de 24 0C±2, în perioada de lumină lumină şi de 20 0 C±2
în perioada de întuneric. Durata de urmărire a acestor vitroculturi a fost de 2 saptămâni.
c. În conformitate cu subiectul luat în studiu de către noi, respectiv obţinerea de calus la patru
hibrizi de porumb, într-o primă etapă experimentală ne-am axat cercetările pe următoarele
obiective majore:
- iniţierea de vitroculturi de calus, utilizând ca material vegetal cariopse de porumb
- testarea capacităţii morfogenă a ţesutului calusal provenit din 4 hibrizi de porumb:
Pako, Thermo, Cobalt şi Symba şi anume la prezenţa în substratul lor de cultură a diferite
concentraţii de aflatoxină una din cele mai puternice micotoxine izolate din atacul fungic cu
Aspergillus parasiticus (agent fitopatogen), întâlnit în culturile de porumb.
Pentru realizarea acestor obiective, prima etapă experimentală a constat din:
● asepsizarea cu succes a cariopselor, cu păstrarea integrală a capacităţii lor de
germinaţie. În vederea realizării acestui obiectiv, s-a pus problema testării puterii de germinaţie a
cariopselor nedezinfectate (prin germinarea acestora în capsule Petri), pe hârtie de filtru umectată
cu apă distilată, la cele patru sortimente de hibrizi. Pentru a grăbi germinaţia cariopselor am
procedat la spălarea lor timp de 24 ore în current de apă de robinet în scopul îndepărtării
compuşilor chimici de pe suprafaţa pericarpului, substanţe cu care a fost tratat acest material
semincier. În urma acestor încercări, am constatat după 3 zile de la punerea cariopselor la
încolţit, că acestea au germinat, cel mai ridicat procent de germinaţie şi cel mai avansat procent
de creştere l-a prezentat hibridul Pako, iar cel mai scăzut procent de creştere a fost marcat la
33
vitrocultivată
hibridul Cobalt. În urma acestor teste, am procedat la sterilizarea cariopselor în vederea

germinării lor, în condiţii aseptice în soluţie Domestos ( cu clor activ 5%- 4,8 g/100g soluţie).
Durata de menţinere a boabelor de porumb în soluţia dezinfectantă a fost de 15 minute. Apoi s-a
decantat soluţia dezinfectantă şi cariopse au fost spălate în 5 băi administrate consecutiv de apă
bidistilată sterilă, pentru a fi înlăturat clorul de la nivelul acestora;
● pentru constituirea variantelor martor, a fost preparat mediu de cultură simplu, lipsit de
regulatori de creştere. Mediile de cultură porţionate în recipiente în număr de 25 pe variantă, au
fost sterilizate prin autoclavare timp de 25 min. la temperatura de 121 0C. Mediile au fost
porţionate în recipiente din sticlă cu dimensiunea de 3 cm în diametru, obturate fiind până la
inoculare cu dopuri de vată; sterilizarea flacoanelor cu medii s-a făcut prin autoclavare, timp de
25 minute, la temperatura de 1210C. După răcirea mediilor, în hota cu flux laminar de aer steril,
s-a procedat la amplasarea cariopselor de porumb, deja asepsizate, cu zona embrionară în contact
direct cu suprafaţa mediului de cultură. Recipientele cu cariopse au fost, ulterior, amplasate pe
rafturi illuminate cu tuburi fluorescente emitentă de lumină albă, expuse fiind la o intensitate
luminoasă de 2000 lucşi; fotoperioada a corespuns la 16 ore lumină/24 ore; regimul termic a fost
pe perioada de iluminare de 240C  20C şi de 200C 20C .
● pentru iniţierea de calus de la cei 4 hibrizi Pako, Thermo, Cobalt şi Symba au fost mai
întâi sterlizate cariopsele. Pentru sterilizarea materialului vegetal prealabil iniţierii culturilor de
calus cariopsele au fost sterilizate cu Domestos timp de 15 min., metoda care în prima etapă s-s
dovedit a fi cea mai eficientă. Mediul de cultură utilizat în cazul culturilor a constat din mediu de
bază Murashige-Skoog (1962) (firma Symba) care conţine macro şi microelemente (inclusiv Fe
EDTA), compuşi organici după cum urmează: vitamine ( tiamină HCl, piridoxină HCl şi acid
pantotemic, câte 1mg/l din fiecare), mezo-inozitol 100mg/l, în compoziţia acestuia fiind adăugate
zaharoza 30g/l, agarul 10 g/l şi regulatorul de creştere 2,4- D în concentraţie de 5 mg/l.
Cariopsele au fost inoculate, respectând poziţia creşterii embrionului (cu scobitura în jos).
Inoculările au fost făcute în hota cu flux laminar orizontal de aer steril. Recipientele cu inoculi au
fost amplasate pe rafturi cu tuburi fluorescente, emitente de lumină albă, fotoperioada a
corespuns la 16 ore lumină/ 24h, regimul termic fiind de 240C±2, în perioada de lumină şi de 200
C±2 în perioada de întuneric.
34
vitrocultivată
3.2. Materiale şi metode de cercetare utilizate în obţinerea aflatoxinei B1 din Aspergillus

parasiticus
Hifele ciupercii au fost inoculate pe mediul de cultura lichid YES (2% yeast extract plus
15 % zaharoză). Au fost incubate la intuneric la temperatura de 25 de grade timp de o saptămână.
Am supus proba extracţiei cu cloroform. Am filtrat extractul şi am preluat o porţiune
alicotă care a fost purificată pe coloana cromatografică cu silicagel. Eluatul s-a evaporat şi l-am
redizolvat într-un volum specific de cloroform. O porţiune alicotă din această soluţie am
analizat-o prin cromatografie în strat subţire. Am determinat visual cantitatea de aflatoxină B 1
sub iradierea cu UV a cromatogramei.
A B
C D
Fig.7 A-D. Subcultura ciupercii Aspergillus parasiticus pe mediul de cultură lichid Yes
35
vitrocultivată
A B
C D
E F
Fig.8 A-G. Extracţia aflatoxinei din hifele ciupercii Aspergillus parasiticus şi vizualizarea acesteia
sub iradierea cu UV a cromatogramei
36
vitrocultivată
CAPITOLUL 4. REZULTATE ŞI DISCUŢII CU PRIVIRE LA MODIFICĂRILE

MORFOLOGICE PRODUSE DE AFLATOXINĂ LA NIVELUL HIBRIZILOR DE ZEA
MAYS L. VITROCULTIVAT
4.1.Prima serie de rezultate

În condiţiile de creştere impuse prin biometrizări (număr şi lungime rădăciniţe, număr şi
dimensiune frunzuliţe), s-a putut urmări capacitatea de organogeneză a vitroplantulelor cultivate
pe MS simplu, în comparaţie cu cele cărora li s-a adăugat 2,4- D în mediul de cultură.
Aspectele macroscopice surprinse la nivelul vitroplantulelor provenite din cei 4 hibrizi
care au fost cultivaţi pe mediu V0 (mediu de cultură lipsit de regulatori de creştere) s-au dezvoltat
foarte bine, procentul de supravieţuire atins fiind de 100% în comparaţie cu cele dezvoltate pe
mediul V1 (mediu de cultură suplimentat cu 2,4 D) unde procentul de supravieţuire a fost mai
mic, 80%. Efectuând în paralel, biometrizări asupra vitroplantulelor pe cele 2 variante de mediu,
s-au putut constata următoarele:
Tabelul 3. Evoluţia comparativă a vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 2 săptămâni de la

inocularea cariopselor „in vitro” pe mediu de cultură MS (1962) simplu (V 0) şi pe mediu suplimentat cu 2,4-
D (V1).
Variante V0 ( MS) V1 (MS +2,4-D)
Tip hibrid Pako Thermo Cobalt Symba Pako Thermo Cobalt Symba
Nr. rădăciniţe 10 6 4 6 3 2 1 2
embrionare şi 100% 60% 40% 60% 100% 66,6 33,3 66,6
adventive (cm)
Lungime rădaciniţă 12 8,8 5,5 7 1,8 1 1 1,5
embrionară (cm) 100% 73,3% 45,8% 58,3% 100% 55,5% 55,5% 83,3%
Nr.frunzuliţe (cm) 4 4 3 2 0 0 0 0
100% 100% 75% 50% 100% 0% 0% 0%
Lungime frunzuliţe 9,5 8 6 7,5 0 0 0 0

(cm)
100% 84,2% 63,1% 78,9% 100% 0% 0% 0%
Lungimea plantei 21,5 16,8 11,5 14,5 1,8 1 1 1,3
întregi (cm)
100% 21,5% 53,4% 67,4% 100% 55,5% 55,5% 72,2%
37
vitrocultivată
Pako Thermo Cobalt Symba
26
25 24,5
24
23
22
21
20
19 18
18
Biometrizare V1 (cm)
17
16 15,5
15
14 13
13 12
12
11 10 10
10 9 9
9 8,5
8 8 8
8 7 7
7 6
6 5 5
5 4
4 3,5
3
2
1
0
Rădăciniţe adventive Lungime rădaciniţă Nr.frunzuliţe Lungime frunzuliţe Lungimea întregii
plus radacinita embrionară plantule
embrionara
Tip hibrid
Figura 9. Biometrizări (în cm) efectuate la nivelul vitroplantulelor de Zea mays iniţiate pe mediul de cultură
Murashige-Skoog (1962) lipsit de regulatori de creştere ( V o), unde: VI- varianta experimentală pentru
hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta experimentală pentru
hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
110
100 100 100 100 100 100
100
88,8
90 83,3 85,7
80 73,4
71,4
Biometrizare V1 (%)
70 66,666,6 64,5
58
60 53
50 44,4
38,8
40 34,6
32,2
30
20
10
0
embrionara
Tip hibrid
Figura 10. Biometrizări (în %) efectuate la nivelul vitroplantulelor de Zea mays iniţiate pe mediul de cultură
Murashige-Skoog (1962) lipsit de regulatori de creştere ( V o), unde: VI- varianta experimentală pentru
hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta experimentală pentru
hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
38
vitrocultivată
B C
D E
Figura 11A-E. Aspecte macroscopice observate la nivelul vitroplantulelor de Zea mays iniţiate pe
mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) lipsit de regulatori de creştere ( V o), unde: VI- varianta
experimentală pentru hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta
experimentală pentru hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
Urmărindu-se zilnic procentul de supravieţuire, respectiv gradul de infecţie a celor

suplimentate cu regulator de creştere prin comparaţie cu cele care nu au fost suplimentate cu 2,4-
39
vitrocultivată
D s-a constatat că cele cărora li s-a introdus în mediu 2,4-D s-au dezvoltat foarte lent, prezentând
doar o mică rădăciniţă şi foarte puţin calus.
5
B io m etriz are V 2 (cm )
3 3 3
3
2
2 1,8 1,8
1,5 1,5
1 1 1
1
30 0
30 0 3,60 0
3 0 0
0
embrionara
Tip hibrid
Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu 2,4-D (V 1), unde: VI- varianta experimentală pentru hibridul Pako;
VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta experimentală pentru hibridul Thermo;
VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
120
100 100 100

100
Biometrizare V2 (%)
80
Pako
60 60 60 Thermo
60
50 50 Cobalt
40 Symba
40 33,3 33,3
20
20
30 30
0 0 0 0 0 0 0 0
0
embrionara
Tip hibrid
Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu 2,4-D, în concentraţie de 2,4-D (V 1), unde: VI- varianta experimentală
pentru hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta experimentală
pentru hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
40
vitrocultivată
B C
D E
Figura 14 A-E. Aspecte macroscopice observate la nivelul vitroplantulelor de Zea mays iniţiate pe
mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu 2,4- D în concentraţie de 2 mg/l (V 1), unde: VI-
varianta experimentală pentru hibridul Pako; V II- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III-
varianta experimentală pentru hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
41
vitrocultivată
4.2.A doua serie de rezultate
Aspectele macroscopice surprinse la 2 săptămâni la nivelul vitroplantulelor provenite din

cei 4 hibrizi care au fost cultivaţi s-au dezvoltat foarte bine, procentul de supravieţuire atins fiind
de 100% pe variantele martor în comparaţie cu cele dezvoltate pe mediul cu 2,4-D în
concentraţie de 5 mg/l, unde procentul de supravieţuire a fost mai mic, 80%. Efectuând în
paralel, măsurători asupra vitroplantulelor pe cele 2 variante de mediu, s-au putut constata
următoarele:
Tabelul 4. Influenţa mediului de cultură lipsit de regulatori de creştere ( V 0) şi a celui cu adaos de

2,4-D în concentraţie de 5 mg/l (V1) asupra capacităţii de calusogeneză a cariopselor de porumb la 2
săptămâni de la inoculare.
Variante V0 V1
de mediu
Tip hibrid Pako Thermo Cobalt Symba Pako Thermo Cobalt Symba
Lungime 7,7 6,7 6,4 4,6 4,2 5,2 5,5 5
rădaciniţă
embrionară
Nr. rădăciniţe 10 8 7 9 6 7 7 9
adventive plus
radaciniţa
embrionară
Nr.frunzuliţe 4 3 3 2 0 0 0 0
Lungime 6 5,2 4,8 5,7 0 0 0 0
frunzuliţe
Lungimea întregii 14,2 11,9 11,2 10,3 4,2 5,2 5,5 5
plantule
42
vitrocultivată
20
14,2
11,9
11,2
10 10,3
(MS)
10 9
V0
7,7 8
6,7 6,4 7
6 5,7
5,2 4,8
4,6
4
3 3
2
0
Lungime rădaciniţă Nr. rădăciniţe adventive Nr.frunzuliţe Lungime frunzuliţe Lungimea întregii
embrionară plus radaciniţa plantule
embrionară
Murashige-Skoog (1962) fără regulatori de creştere (V 0), unde: VI- varianta experimentală pentru hibridul
Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta experimentală pentru hibridul
Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
10
9
7 7
6
(2.4-D)
5,5 5,5
5,2 5,2
V1
5 5
4,2 4,2
0 0 0 0 0 0 0 0
0
Lungime rădaciniţă Nr. rădăciniţe Nr.frunzuliţe Lungime frunzuliţe Lungimea întregii
embrionară adventive plus plantule
radaciniţa
embrionară
Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu 2,4-D, în concentraţie de 5 mg/l (V 1), unde: VI- varianta
43
vitrocultivată
experimentală pentru hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III- varianta
experimentală pentru hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
Figura 3 B. Calusogeneza iniţiată la nivelul coletului la hibridul Pako
mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) fără regulatori de creştere (V 0), unde: VI- varianta
experimentală pentru hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III-
varianta experimentală pentru hibridul Thermo; V IV- varianta experimentală pentru hibridul
Symba.
În totalitate, rezultatele experimentelor întreprinse cu scopul inducerii formării de calus

din cariopsele celor 4 tipuri de hibrizi de porumb au evidenţiat faptul că aportul exogen de 2,4-D
în concentraţie mai mare de 5 mg/l reprezintă o cerinţă esenţială pentru inducerea de calus la
nivelul coleoptilului într-un timp relativ scurt.
Din datele prezentate în fig.15 se remarcă influenţa favorabilă a mediului de cultură
suplimentat cu 2,4-D (varianta experimentală V1) asupra calusogenezei, determinându-se
formarea de calus la 70% dintre variante, calusogeneza fiind iniţiată în special în zona coletului
şi uneori dispersat pe suprafaţa tegumentului şi a rădăciniţei embrionare, aspect ilustrat în fig. 18.
44
vitrocultivată
Figura 18. Aspect macroscopic observate la nivelul calusogeneza fiind iniţiată în special în zona
coletului de Zea mays
B C
calus
D E
calus
45
vitrocultivată
mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu 2,4- D în concentraţie de 5 mg/l (V 1), unde: VI-
varianta experimentală pentru hibridul Pako; V II- varianta experimentală pentru hibridul Cobalt; V III-
varianta experimentală pentru hibridul Thermo; VIV- varianta experimentală pentru hibridul Symba.
Formarea calusului a fost observată după 2 săptămâni de la inocularea cariopselor pe

mediile de cultură, iar calusurile formate au fost subcultivate pe medii nutritive de aceeaşi
compoziţie, urmând ca o parte din el sa fie injectat cu aflatoxina B1, în concentraţie de 1 mg /l,
respectiv 2,5 ml/placă Petri.
A B
Fig. 20 A, B. Evidenţierea calusului la hibridul Pako la 2 săptămâni de la subcultivare.

A B
Fig. 21 A, B. Evidenţierea calusului la hibridul Thermo la 2 săptămâni de la subcultivare.
46
vitrocultivată
A B
Fig. 23 A, B. Evidenţierea calusului la hibridul Cobalt la 2 săptămâni de la subcultivare.
A B
Fig.24 A,B. Evidenţierea calusului la hibridul Symba la 2 săptămâni de la subcultivare.
47
vitrocultivată
PAKO THERMO COBALT SYMBA
Fig. 25. Aspecte macroscopice observate la nivelul vitroplantulelor de Zea mays iniţiate din calus
netratat cu aflatoxină pe mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) fără regulatori de creştere (V0),
unde: VI- varianta experimentală pentru hibridul Pako; VII- varianta experimentală pentru
hibridul Cobalt; VIII- varianta experimentală pentru hibridul Thermo; V IV- varianta experimentală
pentru hibridul Symba.
PAKO THERMO COBALT SYMBA
Fig. 26. Aspecte macroscopice observate la nivelul vitroplantulelor de Zea mays iniţiate din calus
tratat cu aflatoxina B 1 pe mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) fără regulatori de creştere
(V0), unde: VI- varianta experimentală pentru hibridul Pako; V II- varianta experimentală pentru
hibridul Cobalt; VIII- varianta experimentală pentru hibridul Thermo; V IV- varianta experimentală
pentru hibridul Symba.
48
vitrocultivată
subcultura calusului Pako
Vitroplantulă de Zea mays, hibrid

Organogeneza format la nivelul
Pako, provenită din calus tratat cu
calusului hibridului Pako, provenită
aflatoxina B1
din calus tratat cu aflatoxina B1
Fig.27. Organogeneza format la nivelul calusului hibridului Pako, provenită din calus tratat cu
aflatoxina B1
49
vitrocultivată
BIBLIOGRAFIE
1. Atanasiu L., 1984. Ecofiziologia plantelor. Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti.

2. Berca Mihai, 1999, Optimizarea tehnologiilor la culturile agricole. Editura Ceres, Bucureşti.
3. Boldor O., Trifu E., Raianu O., 1981. Fiziologia plantelor. Editura Didactică şi Pedagogică,
Bucureşti.
4. Boldor O., Trifu E., Raianu O., 1983. Fiziologia plantelor. Lucrări practice. Editura
Didactică şi Pedagogică, Bucureşti.
5. Diaconu P., Burloi Gh., Cremenescu Gh., Negrea I., Ceauşu C., 1978. Agrofitotehnie.
Editura Didactică şi Pedagigică, Bucureşti.
6. Duvlea Stela, Popescu C., Olteanu A., 1983. Agrofitotehnie. Editura Didactică şi
Pedagogică, Bucureşti.
7. Gâdea Ştefania, 2003, Fiziologia vegetală. Editura Academic Pres, Bucureşti.
8. KNOP W. 1865. Quantitative Untersuchugen uber die Ernahrungsprozesse der Pflanzen
9. Landwintsch Vers. Stn. 7: 93-107.
10. Milică C.I., Bărbat I., Dorobanţu N., Nedelcu P., Baia V., 1977. Fiziologia vegetală.
Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti.
11. Nedelcu P., 1975. Fiziologia plantelor. Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti. Parascan
D., 1967. Fiziologia plantelor. Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti.
12. Peterfi Şt., Sălăgeanu N., 1972. Fiziologia plantelor. Editura didactică şi Pedagogică,
Bucureşti.
13. Sălăgeanu N., Atanasiu L., 1981. Fotosinteza. Editura Academiei Republicii Socialiste
România, Bucureşti.
14. Stancu R., Fleancu M., Stancu D.I., 2004. Fiziologia plantelor. Lucrări practice, Editura
Cultura, Piteşti.
15. Stancu Radu., Olimid V., 1999. Fiziologia plantelor. Nutriţia. Editura Cultura, Piteşti.
Zamfirache M.M., 2001. Fiziologia plantelor. Note de curs. Editura Universităţii Al.I.Cuza,
Iaşi.
50
vitrocultivată
Bennett, J., Goldblatt, L.A., 1973. The isolation of mutants of Aspergillus flavus and A.
parasiticus with altered
aflatoxin producing ability. Sabouraudia 11, 235–241.
Breckenridge, C., Samarajeeua, U., Arsecularatne, S.N., 1986. Aflatoxin contamination and
moisture levels in Sri
Lankan market rice. Journal of National Science Council, Sri Lanka 14, 173–180.
ARTICLE IN PRESS
Z. Liu et al. / Journal of Stored Products Research 42 (2006) 468–479 477Burow, G.B., Gardner,
H.W., Keller, N.P., 2000. A peanut seed lipoxygenase responsive to Aspergillus colonization.
Plant Molecular Biology 42, 689–701.
Cleveland, T.E., Bhatnagar, D., 1992. Molecular strategies for reducing aflatoxin levels in crops
before harvest. In:
Bhatnagar, D., Cleveland, T.E. (Eds.), Molecular Approaches to Improving Food Quality and
Safety. Van
Nostrand Reinhold, New York, pp. 205–228.
Cotty, P.J., 1997. Aflatoxin-producing potential of communities of Aspergillus section Flavi
from cotton producing
areas in the United States. Mycological Research 101, 698–704.
Cotty, P.J., Cardwell, K.F., 1999. Divergence of West African and North American communities
of Aspergillussection
Flavi. Applied and Environmental Microbiology 65, 2264–2266.
Dai, J., 1997. Aflatoxin toxicosis diagnosis. Chinese Animal Infection 93, 47–48.
Dowling, F.S., 1997. Fumonisin and its toxic effects. Cereal Foods World 42, 13–15.
Egel, D.S., Cotty, P.J., Elias, K.S., 1994. Relationships among isolates of Aspergillussection
Flavi that vary in aflatoxin
production. Phytopathology 84, 906–912.
Ellis, W.O., Smith, J.P., Simpson, B.K., 1991. Aflatoxins in food: occurrence, biosynthesis,
effects on
organisms, detection and methods of control. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 30,
403–439.
51
vitrocultivată
Greene-Mcdowelle, D.M., Ingber, B., Wright, M.S., Zeringue Jr., H.J., Bhatnagar, D., Cleveland,
T.E., 1999. The
effects of selected cotton-leaf volatiles on growth, development and aflatoxin production of
Aspergillus parasiticus.
Toxicon 37, 883–893.
Hansen, T.J., 1993. Quantitative testing for mycotoxins. American Association of Cereal
Chemists 38, 346–348.
Ilago, L.L., Juliano, B.O., 1982. Colonization and aflatoxin formation by Aspergillusspp. on
whole grain rice differing
in endosperm properties. Journal of Science of Food and Agriculture 33, 97–102.
Ju, N., 1980. Aflatoxin. Light Industry Press, Beijing, China.
Li, Y., 1997. Determination and control of aflatoxin in feedstuff. Grain and Feedstuff Industry 8,
39–40.
Liu, X., Yin, X., Li, Y., Meng, Z., 1981. Investigation on toxic-producing of A. flavus in grains
in different region,
China. Journal of Chinese Medicine Academic 3, 266–269.
Moreno, O.J., Kang, M.S., 1999. Aflatoxins in maize: the problem and genetic solutions. Plant
Breeding
118, 1–16.
Nesci, A., Rodriguez, M., Etcheverry, M., 2003. Control of Aspergillus growth and aflatoxin
production
using antioxidants at different conditions of water activity and pH. Journal of Applied
Microbiology 95,
279–287.
Paranagama, P.A., Abeysekera, K.H.T., Abeywickrama, K., Nugaliyadde, L., 2003. Fungicidal
and anti-aflatoxigenic
effects of the essential oil of Cymbopogon citrata (DC.) Stapf. (lemongrass) against Aspergillus
flavus Link. isolated
from stored rice. Letters in Applied Microbiology 37, 86–90.
52
vitrocultivată
Paster, N., 1995. Fungi in stored grain and animal feeds: their occurrence and harm caused to
animals. Israel Journal of
Veterinary Medicine 50, 49–53.
Pitt, J.I., 2000. Toxigenic fungi and mycotoxins. British Medical Bulletin 56, 184–192.
Resnik, S., Neira, S., Pacin, A., Martinez, E., Apro, N., Latreite, S., 1996. A survey of the natural
occurrence of aflatoxins and zearalenone in Argentina field maize 1983–1994. Food Additives
and Contaminants
13, 115–120.
Tang, J., 1999. Research progress of aflatoxin in Guangxi. Journal of Chinese Veterinary
Medicine 5, 33–35.
Tang, Z., Li, G., Kang, Y., Zhong, Z., 1998. The investigation of the groundnut contaminated by
Aspergillus flavus
before harvest. Fujian Journal of Agriculture Science 13, 25–28.
Wen, J., 1996. Quantitative analysis of HPLC and separation and purification of
siliconmagnesium absorbent column
for aflatoxin B1
of corn. Food Science 17, 68–70.
Wilson, R.A., Gardner, H.W., Keller, N.P., 2001. Cultivar-dependent expression of a maize
lipoxygenase responsive to
seed infesting fungi. Molecular Plant–Microbe Interactions 14, 980–987.
Wright, M.S., Greene-Mcdowelle, D.M., Zeringue Jr., H.J., Bhatnagar, D., Cleveland, T.E.,
2000. Effects of volatile
aldehydes from Aspergillus-resistant varieties of corn on Aspergillus parasiticus growth and
aflatoxin biosynthesis.
Toxicon 38, 1215–1223.
Xiao, D., 1988. Contamination research of aflatoxin in Chinese peanut. Chinese Oil Plants 2, 85–
87.
ARTICLE IN PRESS
478 Z. Liu et al. / Journal of Stored Products Research 42 (2006) 468–479Yu, J., Bhatnagar, D.,
Cleveland, T.E., 2004a. Genetics and biochemistry of aflatoxin formation and genomics
53
vitrocultivată
approach for eliminating aflatoxin contamination. In: Romeo, J.T. (Ed.), Recent Advances in
Phytochemistry:
Secondary Metabolism in Model Systems, vol. 38. Elsevier, Amsterdam, pp. 224–242.
Yu, J., Chang, P.-K., Ehrlich, K.C., Cary, J.W., Bhatnagar, D., Cleveland, T.E., Payne, G.A.,
Linz, J.E., Woloshuk,
C.P., Bennett, J.W., 2004b. Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis. Applied and
Environmental
Microbiology 70, 1253–1262.
Zhang, P., Zhang, J., Han, G., 2003. Rapid detection of aflatoxin contamination in feedstuff.
Modern Agriculture 5, 40.
54

Continut Lucrare Rosca

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Continut Lucrare Rosca

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Jianu Teodora - Modificări fiziologice produse de excesul în substanţe nutritive asupra speciei Zea mays

Aflatoxinele au devenit un subiect extrem de important în toata mass media romanească,

Având în vedere importanţa alimentară şi furjeră a porumbului, în lucrarea de faţă ne-am

Centrul de origine al porumbului este America Centrală (Mexic-Guatemala) şi America de

1.2. Însuşiri morfologice şi fiziologice

1.3. Sistematică şi hibrizi

În funcţie de durata perioadei de vegetaţie, hibrizii de

HIBRIZI INDICELE DE PRECOCITATE

Tabelul 1. Hibrizii de porumb cultivaţi în România (după Lista oficială a

1.4. Cerinţe faţă de factorii de vegetaţie

1.5. Zonele de cultivare a hibrizilor de porumb

Fig.2. Tipuri de aflatoxine

Fig.3. Morfologia speciilor din genul Aspergillus care secretă aflatoxine

Fig.4. Aspecte privind morfologia ciupercii Aspergillus parasiticus pe diferite produse

Tabelul 2- Efectele şi simptomele apărute în urma consumului cu produse infestate cu

Sistemul afectat Efecte/simptome

Un sfat important pentru a preveni intoxicarea cu aflatoxine este să nu se consume

Autorii citati arata ca A. flavus si A. parasiticus se intalnesc relativ rar in produsele de

Metode pentru decelarea aflatoxinelor

cloroform si se usuca la o baie de nisip cu temperatura de 90-100°C. Inainte de a se incepe

cromatografica in functie de cantitatea aplicata de standard si de cantitatea de material luat in

CAPITOLUL 2. SCURT ISTORIC AL CERCETĂRILOR CULTURILOR DE

Fig.5. Diferite forme de calus şi organogeneza iniţiată la nivelul calusului

Fig.6. Suspensii de celule vegetale pe agitator cu suporturi

În vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape:

NaCl, substanţă introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură. Astfel, a raportat

CAPITOLUL 3. CERCETĂRI PERSONALE CU PRIVIRE LA MODIFICĂRILE

3.1. Materiale şi metode de cercetare utilizate în obţinerea de vitroculturi de Zea mays pe

fost sterilizate cu hipoclorit de Ca timp de 15 min.şi cu Domestos timp de 15 min., ultima

hibridul Cobalt. În urma acestor teste, am procedat la sterilizarea cariopselor în vederea

3.2. Materiale şi metode de cercetare utilizate în obţinerea aflatoxinei B1 din Aspergillus

CAPITOLUL 4. REZULTATE ŞI DISCUŢII CU PRIVIRE LA MODIFICĂRILE

4.1.Prima serie de rezultate

Tabelul 3. Evoluţia comparativă a vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 2 săptămâni de la

Variante V0 ( MS) V1 (MS +2,4-D)

100% 100% 75% 50% 100% 0% 0% 0%

Lungime frunzuliţe 9,5 8 6 7,5 0 0 0 0

Pako Thermo Cobalt Symba

Pako Thermo Cobalt Symba

Urmărindu-se zilnic procentul de supravieţuire, respectiv gradul de infecţie a celor

Pako Thermo Cobalt Symba

100 100 100

4.2.A doua serie de rezultate

Aspectele macroscopice surprinse la 2 săptămâni la nivelul vitroplantulelor provenite din

Tabelul 4. Influenţa mediului de cultură lipsit de regulatori de creştere ( V 0) şi a celui cu adaos de

Pako Thermo Cobalt Symba

Pako Thermo Cobalt Symba

Figura 3 B. Calusogeneza iniţiată la nivelul coletului la hibridul Pako

În totalitate, rezultatele experimentelor întreprinse cu scopul inducerii formării de calus

Formarea calusului a fost observată după 2 săptămâni de la inocularea cariopselor pe

Fig. 20 A, B. Evidenţierea calusului la hibridul Pako la 2 săptămâni de la subcultivare.

Fig. 21 A, B. Evidenţierea calusului la hibridul Thermo la 2 săptămâni de la subcultivare.

Fig. 23 A, B. Evidenţierea calusului la hibridul Cobalt la 2 săptămâni de la subcultivare.

Fig.24 A,B. Evidenţierea calusului la hibridul Symba la 2 săptămâni de la subcultivare.

PAKO THERMO COBALT SYMBA

PAKO THERMO COBALT SYMBA

subcultura calusului Pako

Vitroplantulă de Zea mays, hibrid

1. Atanasiu L., 1984. Ecofiziologia plantelor. Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti.

S-ar putea să vă placă și