REGLAREA ACTIVITĂŢII GENICE

Necesitatea reglajului activităţii genelor, atât în celula procariotă cât şi în cea eucariotă , este
determinată de faptul că la un moment dat funcţionează numai o mică parte din totalitatea genelor. În
condiţii determinate de mediu, se aproximează că în celula bacteriană, nu se sintetizează decât circa 1
% din totalitatea proteinelor structurale şi enzimelor pentru care există informaţie genetică în genom.
Ca urmare, cantitatea de proteine şi în special de enzime sintetizate în celule nu este constantă în timp,
ci se află sub controlul unui mecanism de reglare genetică. În cazul eucariotelor superioare, numai
circa 7 – 10 % din secvenţele de ADN din genom sunt transcrise în ARN.
Mecanismele de reglare reprezintă deci un sistem de coordonare prin care se face selecţia
adecvată, în raport cu mediul, a informaţiei genetice care urmează a fi exprimată fenotipic. Mesajul
selectat reprezintă doar o parte din totalul informaţiei păstrată şi transmisă ereditar de genom, ceea ce
înseamnă că există molecule semnal care controlează rata de transcriere a unor molecule specifice de
ARNm (control transcripţional). După selecţia genelor, urmează transcrierea informaţiei genetice
purtată de acestea, în vederea sintezelor proteice după un program codificat de gene, apoi realizarea
echilibrată cantitativ a acestor sinteze şi desfăşurarea reacţiilor ce implică activitatea catalitică a
proteinelor sintetizate (control translaţional). Reglarea activităţii genelor, intrarea lor în funcţiune după
un program riguros controlat este evidentă atât la procariote cât şi la eucariote.
Dezvoltarea şi diferenţierea celulară, la eucariote este legată de transcrierea selectivă a
informaţiei genetice de la nivel celular. În cadrul acestor organisme apar diferenţieri celulare specifice
ce nu pot fi explicate decât admiţând faptul că unele gene funcţionează permanent, în timp ce altele
funcţionează diferenţiat, în anumite momente specifice ale ontogenezei.
În sinteza proteinelor există, în general, două tipuri de control:
- Controlul adaptativ – este dependent de condiţiile de mediu care determină activarea unei
anumite părţi din mesajul genetic (nefolosită până în acel moment), făcând să fie sintetizate
enzimele necesare celulei în acel moment şi să fie blocată sinteza enzimelor ce nu sunt necesare
în momentul respectiv;
- Controlul programat – este indirect influenţat de mediu, conducând la funcţionarea constantă
a genelor şi la sinteza de proteine în cantitate aproape constantă în tot timpul vieţii
organismului respectiv.

1
 REGLAREA EXPRIMĂRII GENELOR LA PROCARIOTE

Mecanismele de reglare a activităţii genelor au fost cel mai bine studiate la bacterii. Teoria
reglării genetice la procariote a fost elaborată de geneticienii francezi F. Jacob şi J. Monod, în
1961. Ei au demonstrat experimental şi teoretic că sinteza proteinelor şi respectiv a enzimelor
celulare, nu este constantă în timp ci variază în funcţie de necesităţile celulei. În funcţie de
mecanismele moleculare şi de efectele acestora, procesele de reglare a activităţii genice pot fi
grupate în două mari categorii: reglare pozitivă şi reglare negativă.
Reglarea pozitivă - reglarea genetică se realizează prin activarea unor gene în prezenţa unei
molecule efector care poate fi o proteină, o moleculă activator de mici dimensiuni sau un complex
molecular. Acest sistem, în anumite situaţii, necesită prezenţa AMPc şi a proteinei CRP (proteina
de legare, receptor, a AMPc), care iniţiază transcrierea genetică. În sistemul de reglare negativă în
celulă este prezent un inhibitor care împiedică transcrierea.Acest inhibitor (represor)
interacţionează cu o anumită regiune plasată în faţa genelor reglate. Pentru iniţierea transcrierii este
necesară prezenţa unui antagonist al inhibitorului, numit inductor.

Reglarea operonului lactozei la Escherichia coli (operonul lac)

Cercetările privind reglarea genetică la procariote, au dus la concluzia că genele care acţionează
asupra unei căi metabolice nu au o activitate independentă ci fac parte din unităţi mai mari
denumite operoni ce funcţionează coordonat.
Un operon - unitate funcţională alcătuită dintr-o secvenţă de nucleotide ce include: un
promotor, un operator şi una sau mai multe gene structurale care sunt transcrise într-un ARNm
policistronic (o moleculă de ARNm codifică pentru mai mult decât o proteină).
Promotorul – este o secvenţă de ADN, reprezintă situsul de recunoaştere a enzimei ARN
polimeraza care are rol în procesul de iniţiere a transcrierii. În sinteza ARN, promotorul indică care
gene ar trebui utilizate pentru sinteza ARNm, şi prin alungire (elongare), controlează ce proteine
vor fi sintetizate.
Operatorul – este un segment de ADN, care reglează activitatea genelor structurale din cadrul
operonului, prin interacţiunea cu un represor sau un inductor specific.
Primul operon, descris de către F. Jacob, D. Perrin, C. Sanchez and J. Monod în 1960, a fost
operonul lac de la Escherichia coli. Se consideră a fi circa 200 de operoni, la Escherichia Coli
dintre care numai activitatea unora este mai bine cunoscută. Astfel, la Escherichia Coli,
posibilitatea utilizării lactozei din mediu şi a metabolizării ei, se realizează cu ajutorul a trei
enzime:

2
 - β –galactozid – permeaza (localizată în membrana celulei bacteriene asigură permeabilizarea
acesteia, facilitând trecerea lactozei în celula bacteriană) ;
- β – galactozidaza (localizată în citoplasma bacteriană, clivează lactoza la glucoză şi galactoză –
figura 1).
În cadrul metabolismului celular mai intervine tiogalactozid transacetilaza (care în mod
normal, are rol de acetilare a lactozei şi a altor β –galactozide cu ajutorul acetil- CoA).

Fig. 1. Lactoza și produsii de clivare

Sinteza acestor trei enzime este determinată de trei gene structurale: lac Z – codifică β-
galactozidaza, lac Y – codifică β- galactozid permeaza şi lac A- codifică tiogalactozid transacetilaza.În
absenţa lactozei din mediu, genele structurale care determină sinteza celor trei enzime sunt
inactive.Dacă însă se adaugă lactoză în mediu, cele trei gene sunt rapid activate şi încep sinteza celor
trei enzime. Activitatea celor trei gene structurale este controlată de o genă reglatoare lac I, care
acţionează asupra lor prin intermediul unui represor. În absenţa lactozei, gena reglatoare sintetizează o
proteină represoare care se cuplează cu un segment de ADN denumit operator dispus înaintea celor trei
gene structurale, blocând astfel activitatea genelor respective.
Operonul lac (fig. 2) este alcătuit din cele trei gene structurale (lac Z, lac Y, lac A) şi o serie
de elemente reglatoare reprezentate de:
 Represor – o proteină codificată de gena lac I –gena reglatoare, situată de regulă
separat de operonul a cărei activitate o reglează; are 2 situsuri de recunoaştere: unul
pentru lactoză şi compuşii săi şi altul pentru operonul lactozei;
 Promotorul (p) – reprezentat de o secvenţă de nucleotide care are rol de loc de
recunoaştere pentru enzima ARN polimeraza, determinând astfel iniţierea transcrierii;
 Operatorul (o) – o secvenţă de nucleotide care serveşte ca un situs de recunoaştere şi
de legare pentru represorul specific operonului.

3
 Figura 2. Harta genetică a operonului lac. Secvențele p si o sunt mult mai mici decât genele.
Prin transcrierea operonului lac se formează o moleculă de ARNm ce copiază informaţia de pe
catena sens. Acest ARNm policistronic conţine mai multe semnale start pentru iniţierea
traducerii.Transcrierea genetică a operonului lac este controlată atât pozitiv cât şi negativ.

Inducţia, represia şi retroinhibiţia enzimatică

Cercetările privind sinteza celulară a enzimelor au dus la descoperirea fenomenelor de inducţie

şi represie enzimatică, fenomene opuse ca acţiune (antagoniste) şi care controlează cantitatea de
substanţe sintetizate.
Inducţia enzimatică este declanşată de prezenţa în mediu a substanţei ce trebuie metabolizată
(Exemplu lactoza) – denumită în acest caz inductor.
În mod obişnuit, operonul lac este nefuncţional. El este indus să funcţioneze de îndată ce
bacteria este pusă pe un mediu cu lactoză. Represorul se combină cu inductorul (substanţa ce trebuie
metabolizată), devine inactiv şi pierde afinitatea pentru regiunea Operatorului. Starea deblocată a
operatorului permite accesul ARN polimerazei la genele structurale care încep să fie transcrise
sintetizându-se astfel enzimele corespunzătoare (enzime catabolice-ce catalizează metabolizarea sau
degradarea- substratului nutritiv).
Celulele de Escherichia coli cultivate pe un mediu cu glucoză sau cu glicerol, conțin mai puțin
de l0 molecule de b-galactozidază/celulă, iar numărul lor crește la câteva mii, după cultivarea
celulelor pe mediul cu lactoză. Sinteza b-galactozidazei este inductibilă. Inductorul fiziologic al
sintezei b-galactozidazei este alolactoza (izomerul glucoză-l,6-galactoză), derivată din lactoză,
printr-o reacție de transglicozilare. Sinteza alolactozei este catalizată de cele câteva molecule de b-
galactozidază, existente în celulă, înainte de inducție. Sinteza b-galactozidazei la nivel minim se
numește sinteză constitutivă de bază (bazală) și este posibilă, deoarece legarea represorului de
operator nu este niciodată atât de fermă încât să blocheze complet transcrierea operonului.
Inductorul (lactoza) se asociază cu represorul și îl modifică, astfel încât acesta nu mai
interacționează cu operatorul. În prezența inductorului, operatorul rămane liber și promotorul este
disponibil pentru inițierea sintezei ARNm. Genele structurale z, y, a sunt transcrise într-o moleculă
de ARNm, codificatoare pentru toate cele trei proteine. O moleculă de ARNm ce codifică sinteza a
cel puțin două proteine diferite se numește poligenomică sau policistronică.

4
 Reglarea operonului necesită ca gena operatoare să fie adiacentă genelor structurale ale
operonului (lac z, lac y, lac a), dar proximitatea genei lac i nu este obligatoriu necesară, deoarece
represorul lac I este o proteină difuzibilă.
Genele ARNm lac sunt traduse diferențial. Raportul cantitativ al celor trei proteine (b-
galactozidaza, permeaza și transacetilaza) este l,0 : 0,5 : 0,2. Sinteza lor diferețiată cantitativ este
rezultatul reglării traducerii pe două căi:
l) Gena z este tradusă prima, din ARNm policistronic. După sinteza b-galactozidazei, jumătate
din ribosomi se detașează de molecula de ARNm. Cealaltă jumătate a numărului de ribosomi
continuă traducerea și la nivelul genei y. Astfel, numărul moleculelor de permează va fi numai
jumătate din numărul moleculelor de β-galactozidază;
2) ARNm bacterian este degradat după câteva cicluri de traducere. Degradarea este lentă, dar
începe cu o frecvență mai mare la nivelul genei a decât la nivelul genei y, iar degradarea la nivelul
genei y este mai frecventă decât la nivelul genei z.

Figura 3. Diagrama operonului lac în stare activă (indusă). Un inductor exogen se asociază cu
represorul și formează un complex inactiv, care nu recunoaște secvența operator. Genele operonului
sunt transcrise și se sintetizează enzimele pentru catabolismul lactozei.
Represia enzimatică – declanşată de absenţa substratului din mediu ( intervine în momentul în
care concentraţia substratului din mediu scade). Represorul trece din stare inactivă în starea activă, se
cuplează cu regiunea operatorului blocând-o, inhibând astfel activitatea genelor structurale care asigură
sinteza enzimelor corespunzătoare.
În mod normal, represorul este inactiv şi genele care asigură sinteza enzimelor implicate în
sinteza unor metaboliţi esenţiali funcţionează. Atunci când însă concentraţia unui metabolit esenţial
depăşeşte necesităţile celulei, metabolitul (substanţa sintetizată) formează cu represorul un complex
activ numit corepresor, care blochează operatorul şi genele corespunzătoare.
S-au izolat mutante defective pentru sinteza uneia din cele trei proteine. De exemplu, mutanta
- + +
z y a este defectivă pentru sinteza β-galactozidazei, dar sintetizează permeaza și transacetilaza.
5
 Cea mai interesantă clasă de mutante este aceea a mutantelor constitutive, care sintetizează
cantități mari ale celor trei proteine în absența inductorului. Rata sintezei celor trei proteine este, în
mod normal, controlată de o genă reglatoare comună (gena i). Bacteriile de tip salbatic sunt
inductibile și au genotip i+ z+ y+ a+. Efectul reglator al genei i se realizează prin intermediul
represorului pe care-l codifică.

Figura 4. Diagrama operonului lac în stare represată. Represorul activ se leagă de regiunea operator
și blochează transcrierea genelor structurale.

De exemplu, la Salmonella typhimurium, genele din operonul his care specifică enzimele ce
intervin în sinteza histidinei, sunt funcţionale atunci când în celulă se află o concentraţie mică de
histidină. Când în celulă s-a acumulat o cantitate mare de histidină, expresia acestor gene este represată
şi sinteza histidinei încetează. Corepresorul (histidina în cazul operonului his) se cuplează cu
represorul (o proteină reglatoare) inactiv, care devine activ, blocând transcrierea operonului his.
Retroinhibiţia enzimatică – denumită şi inhibiţia prin feedback sau efectul Novick- Szilard,
este un alt sistem de control al sintezei proteice prin cantitatea de produs final. Astfel, în cazul unui
anumit lanţ metabolic în care intervin mai multe enzime, produsul final în cantitate mare inhibă
moleculele existente ale enzimei care controlează prima etapă a lanţului metabolic. Aceasta spre
deosebire de represia enzimatică care blochează sinteza tuturor enzimelor care intervin în lanţul
metabolic respectiv.
De exemplu, în calea metabolică a histidinei, prima enzimă este pirofosforilaza. Când
concentraţia histidinei în celulă devine prea mare, molecula de histidină se leagă la o regiune specifică
acestei enzime, schimbându-i conformaţia sa tridimensională, astfel că enzima devine nefuncţională.
Când concentraţia de histidină scade, aceasta părăseşte enzima, care refăcându-şi conformaţia spaţială
originală, redevine activă.
La Escherichia coli s-a observat că prin cultivarea pe un mediu ce conţine atât glucoză cât şi
lactoză, bacteriile utilizează preferenţial mai întâi glucoza, lactoza rămâne nemetabolizată până când în
mediu nu mai există glucoza, fenomen numit diauxie. Aceasta înseamnă că atâta timp cât există
glucoză în mediu, genele lac sunt inactivate. Acest mecanism reglator a fost denumit represie prin
catabolit.

6
 Prin urmare, pentru iniţierea transcrierii ARNm policistronic, pe lângă prezenţa inductorului
mai este necesar încă un element. Activitatea acestui element este legată de concentraţia glucozei,
efectul inhibitor al glucozei asupra exprimării genelor lac fiind indirect. Natura elementului
suplimentar necesar iniţierii transcrierii operonului lac, a fost stabilită recent, acesta fiind reprezentat
de proteine implicate în reglarea pozitivă a genelor.
De exemplu, în cazul operonului lac, când glucoza este absentă, în celulă există o cantitate
mare din molecula de reglare AMPc (adenozin-monofosfat ciclic). Acest element există şi în cazul
celulelor eucariote, mai ales la animale, unde reglează acţiunea mai multor hormoni. Când glucoza este
prezentă în mediu, nivelul AMPc este scăzut. Deasemenea, dacă în mediu se află glicerol sau un alt
compus care nu poate intra în calea metabolică a glucozei, nivelul AMPc este ridicat.
Tulpinile de Escherichia coli (şi multe alte specii de bacterii) sunt capabile să sintetizeze o
proteină specifică ce are rolul de receptor pentru AMPc (proteina CRP) codificată de gena crp.
Proteina CRP, împreună cu AMPc, formează un complex AMPc-CRP care se leagă la promotorul
operonului lac, la nivelul unui situs specific şi activează transcrierea. Sinteza ARNm are loc doar
în absenţa represorului şi în prezenţa complexului AMPc-CRP legat la o secvenţă din regiunea
promotor. În celulele ce conţin mutaţii în genele crp sau cya nu se poate iniţia sinteza ARNm chiar
dacă respectivele celule conţin şi mutaţii lac I- (deci nu se sintetizează represor) sau mutaţii la
nivelul regiunii operator care determină sinteza constitutivă a b-galactozidazei. Cu toate acestea, s-
a dovedit că transcrierea genelor operonului lac se realizează şi în condiţii bazale, cu o rată foarte
scăzută dar activitatea maximă a acestuia necesită îndeplinirea condiţiilor menţionate anterior.

Represia sintezei enzimelor într-un sistem biosintetic. Operonul triptofanului

Represia enzimatică reprezintă fenomenul scăderii ratei de sinteză a unui grup de enzime
metabolic înrudite, ori chiar de oprire a sintezei lor, ca urmare a prezenței în celulă, a unui
metabolit cu rol de represor. Enzimele din această categorie se numesc represibile.
Represia sintezei enzimelor s-a studiat la Escherichia coli. Pe un mediu minimal, cu glucoză și
azot combinat anorganic, celulele sintetizează toți monomerii necesari în proporții optime. În medii
complexe (cu aminoacizi), prezența produsului final al unei căi de biosinteză, reprezintă un semnal
pentru celula, care, printr-un fenomen de feed-back negativ sau de represie prin produsul final al
căii, stopează biosinteza enzimelor devenite inutile, întrucât celula folosește cu precădere
metabolitul existent ca atare în mediu. Invers, când aprovizionarea cu triptofan diminua, se
sintetizează enzimele sale de biosinteză.
Operonul triptofanului (trp) la Escherichia coli codifică sinteza acestui aminoacid (figura 5).
Reglarea operonului se face astfel încât, când triptofanul se găsește în mediul de creștere, operonul
trp nu este transcris. Când aprovizionarea celulelor cu triptofan este insuficientă, transcrierea
operonului este inițiată.

7
 Pentru reglarea unei căi biosintetice, o reglare de tipul on-off nu răspunde necesităților celulei.
Este necesară o reglare cantitativă, deoarece în natură apar situații în care, o cantitate suboptimală
de triptofan este disponibilă, dar aceasta este insuficientă pentru creșterea normală a celulei.
Deficitul de triptofan în celulă, este evitat printr-un sistem reglator modulator, în care, nivelul
transcrierii operonului în starea derepresată este determinat de concentrația triptofanului disponibil.
Acest mecanism reglator este activ pentru mulți operoni care codifică biosinteza aminoacizilor.
Triptofanul se sintetizează în 5 trepte, fiecare catalizată de o enzimă specifică. La E. coli,
genele codificatoare (A, B, C, D, E) ale enzimelor sunt traduse dintr-o moleculă de ARNm
policistronic. Prima gena tradusă este trp E. Gena pentru sinteza represorului (trp R) este localizată
departe de acest policistron. Proteina codificată de gena trp R este aporepresorul trp, inactiv ca
atare, datorită lipsei totale de afinitate pentru regiunea operator. În prezența produsului final al căii
de biosinteză (triptofanul), de origine exogenă sau acumulat prin sinteza endogenă, aporepresorul
se activează: moleculele de triptofan, cu grupa moleculară mică, se comportă ca un corepresor.
Complexul format din aporepresor și corepresor se leagă de secvența operator și transcrierea
genelor trp este blocată.

Figura 5. Diagrama operonului triptofanului la Escherichia coli.

Când aprovizionarea celulei cu triptofan exogen este diminuată, operatorul este liber și
transcrierea începe. Acesta este principiul mecanismului reglator on-off.
Căile biosintetice sunt controlate însă, prin mecanisme mai fine, în care concentrația enzimelor
unei căi este variabilă în funcție de concentrația produsului final al căii. Mecanismul constă în
terminarea prematură a transcrierii, înainte ca prima genă structurală să fie transcrisă.
Pe măsură ce triptofanul disponibil scade, începe transcrierea, dar aceasta este modulată
cantitativ. Între promotor și operator sunt două regiuni, denumite leader și atenuator (trp L și trp
a). Secvența L, necodificatoare, se găsește la capatul 5’ al moleculei de ARNm. La bacteriile de tip
sălbatic, în absența triptofanului în mediu, transcrierea majorității moleculelor de ARNm se termină
la secvența de 28 de baze, denumită atenuator. Rezultatul este transcrierea unui ARNm de l40 de
nucleotide (al secvenței L), fără ca genele structurale ale operonului să fie transcrise. Secvența
Leader codifică un polipeptid de l4 aminoacizi, care conține triptofan în pozițiile l0 și 11. Cei doi
codoni ai triptofanului din secvența Leader sunt sensibili la concentrația ARNt trp, adică dacă
aprovizionarea cu triptofan este suficientă, traducerea ARNm Leader diminua.
Moleculele de ARNm Leader au rolul de a recepționa concentrația triptofanului sintetizat de
enzimele operonului. Dacă nivelul triptofanului este scăzut, ARN-polimeraza depășește situsul
atenuator și transcrie întregul operon. Invers, creșterea concentrației aminoacidului în celulă,
blochează transcrierea la nivelul secvenței atenuator.

8
 1. Dacă în celulă nu există triptofan – represorul este inactiv, ARN-polimeraza se fixeaxă
de
promotor şi se produce ARNm şi apoi enzime – operonul este activ;
2. Dacă în celulă există triptofan – acesta interacţionează cu represorul şi il activează –
represorul-se leagă de secvenţa operator şi ARN polimeraza nu se mai poate lega de
promotor – transcrierea încetează – operonul este inactiv
Alți câțiva operoni care codifică sinteza aminoacizilor la E. coli, posedă situsuri atenuatoare și
realizează o reglare cantitativă asemănătoare. Secvența atenuatoare este senzor al concentrației
celulare a aminoacidului a cărui sinteză o reglează. Peptidul leader al fiecărui operon conține câțiva
aminoacizi de tipul celor controlați de operon. De exemplu, operonul treoninei codifică enzime ce
sintetizează treonina și izoleucina. Peptidul leader conține 8 resturi de treonina și 4 resturi de
izoleucina. În secvența leader de l5 aminoacizi a fenilalaninei se găsesc 7 resturi de fenilalanina, iar
peptidul leader al operonului histidinei conține 7 resturi consecutive de histidină.
Din punct de vedere molecular, mecanismul reglator este condiționat de faptul că la bacterii,
transcrierea este cvasi-simultană cu traducerea mesajului.
Fenomenul represiei sintezei enzimelor prin feed-back, permite celulei să mențină în limite
adecvate, concentrațiile relative ale enzimelor necesare sintezei aminoacizilor, proteinelor, acizilor
nucleici.

9
 Controlul procesului de traducere al mesajului genetic
• Cercetările efectuate asupra operonului lac au evidenţiat faptul că există unele diferenţe în ceea
ce priveşte traducerea informaţiei purtate de ARNm policistronic, ceea ce sugerează existenţa
şi la procariote a unei reglări la nivelul procesului de tranducere.
• Astfel, s-a remarcat faptul că biosinteza celor trei enzime (b-galactozidază, permează şi
acetilază) se face în raport molar de 1:1/2:1/5, diferenţele datorându-se reglării la nivelul
traducerii. Fenomenul se poate realiza pe două căi in care gena lac Z este tradusă prima.
Se pare că, în cazul moleculelor de ARNm policistronic, imediat după sinteza polipeptidului
codificat de prima genă are loc separarea de ribosomi,
urmând să se formeze un nou complex de iniţiere la nivelul codonului AUG al celei de-a doua
gene.

Frecvenţa cu care se realizează acest proces este corelată cu probabilitatea reiniţierii la fiecare
codon AUG următor.
Astfel, se formează un gradient în cantitatea de polipeptide sintetizate de la capătul 5’ spre cel 3’ al
ARNm.
Aceste efect, numit polaritate, se realizează în cazul majorităţii moleculelor de ARNm
policistronic. Toate moleculele de ARNm sunt degradate la nucleotide după câteva runde de
traducere.
• Degradarea este înceată dar uneori începe imediat după primul eveniment de traducere.

10
• Degradarea ARNm policistronic începe, cel mai frecvent, la nivelul genei lac A, apoi continuă
cu gena lac Y şi, abia la sfârşit, cu gena lac Z.
• Consecinţa acestui fenomen este că, la un moment dat, sunt mai multe copii ale genei lac Z
decât lac Y şi, evident, cu mult mai multe decât lac A.

11