CROMATOGRAFIA DE NALT

PERFORMAN N MEDIU LICHID (HPLC)

PENTRU SEPARAREA UNOR DERIVAI
METABOLICI DIN ARTHROBACTER
NICOTINOVORANS
- Lucrare de licen -

Boiangiu Rzvan tefan*

Facultatea de Biologie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Ia i

Coordonator tiinific: Lect. Dr. Marius Mihan

*boiangiu.razvan@yahoo.com
 Cuprins
CARACTERIZAREA TAXONOMIC I FIZIOLOGIC
A SPECIEI ARTHROBACTER NICOTINOVORANS

APLICAII BIOTEHNOLOGICE ALE CII DE

DEGRADARE A NICOTINEI DIN ARTHROBACTER
NICOTINOVORANS

MATERIALE I METODE

REZULTATE I DISCUII

CONCLUZII
Arthrobacter nicotinovorans i pAO1
 6HNic un posibil medicament?

Reprezentarea schematic a unui receptor

nAChR artnd (a) ncorporarea n membran, Poziia de legare a 6HNic (a) i a nicotinei (b) aa cum
spaiul sinaptic, citosolul i (b) situsurile de este prezentat prin experimente de ataare in silico.
legare a acetilcolinei.
 Posibile metode de producere a 6HNic:

Sinteza chimic;

Izolarea i utilizarea enzimei NDH;

Izolarea din mediul de cultur;

6HNic un posibil medicament?

 Materiale i metode

Tulpini utilizate i condiii de cretere:

Arthrobacter nicotinovorans pAO1+, pAO1-
cultivate n mediul citrat suplimentat cu nicotin
0.05% i 0.005 % soluie de minerale pe un agitator
rotativ la C/190 rpm.*
Spectrele de absorbie: au fost nregistrate pe un
spectrofotometru Beckman Coulter DU 730 Life
Science utiliznd mediu citrat ca etalon

Analiza HPLC a fost realizat pe un sistem

Bischoff echipat cu 2 pompe, un detector DAAD,
si o coloana Nucleodur RP C18 ec (150x4.6 mm,
cu dimensiunea particulei de 3m).

*Eberwein, H., Gries, F. A., Decker, K. (1961): [On the decomposition of nicotine by bacterial enzymes. II. Isolation and
characterization of a nicotine-splitting soil bacterium]. Hoppe-Seylers Zeitschrift fr physiologische Chemie, 323, 236
 Rezultate i discuii
1. Stabilirea condiiilor optime pentru separarea 6HNic de nicotin
Coloan cromatografic Faz mobil Raport Debit/temperatur Detecie Referin

Kromasil KR100-5C18,
150mm4.6mm; dimensiunea Metanol:1 mM H2SO4 15:85 0,5 ml/ min / 30oC 210 nm (Wang et al., 2005)
particulei este de 5m

Kromasil KR100-5C18,
150mm4.6mm; marimea Metanol:1 mM H2SO4 25:75 0,5 ml/ min / 30oC 207 nm (Tang et al., 2008)
particulei 5m

Kromasil KR100-5C18,
150mm4.6mm; dimensiunea Ap distilat:Metanol 75:25 0,5 ml/ min / 30oC 210 nm (Tang et al., 2009)
particulei este de 5m

Grace Alltima C18, 263 nm;

4.6250 mm; dimensiunea Metanol:Ap distilat 10:90 0,5 ml/ min / 30 C
o
232 nm; (Ma et al., 2014)
particulei este de 5m 307 nm

Eclipse XDB-C18,
25064.6 mm; dimensiunea Metanol:1 mM H2SO4 5:95 0,5 ml/ min / 30oC - (Liu et al., 2014)
particulei este de 5m
 Cromatograme tipice pentru separarea
Dependena timpilor de retenie fa de nicotinei i a 6HNic folosind ca faz mobil
concentraia de metanol un amestec de acid sulfuric 1mM i metanol
n raport de 75:25

Cea mai eficient separare => acid sulfuric 1mM i metanol n raport de 75:25
 2. Dezvoltarea microorganismului Arthrobacter nicotinovorans pe medii cu nicotin

Curba de cretere a tulpinilor de A.

nicotinovorans pAO1+ i pAO1- pe
mediu cu nicotin

Acumularea pigmentului albastru n

dependen de timp
 3. Separarea cromatografic a mediului de cultur din Arthrobacter nicotinovorans

Separarea cromatografic a
compuilor din mediul de cultur a
tulpinei Arthrobacter nicotinovorans
pAO1

Prezena n cromatograme a primului intermediar metabolic indic faptul c faza

mobil folosit este cea care asigur separarea cromatografic a 6HNic din mediul de
cultur.

Rezultate i discuii
 Concluzii

S-a reuit stabilirea unui protocol de separare a intermediarilor

metabolici ai nicotinei ce apar n mediul de cultur a
microorganismului Arthrobacter nicotinovorans pAO1+

Faza mobil optim pentru separarea nicotinei de 6HNic este

compus din acid sulfuric 1mM i metanol n raport de 75:25.

Utilizarea direct a celulelor de Arthrobacter nicotinovorans

pAO1+ cu scopul de a transforma nicotina ntr-un compus cu
potenial biotehnologic precum 6HNic este realizabil.
Rezultatele obinute au permis: Conferine
BOIANGIU Rzvan tefan, GUZUN Doina, MIHAN Marius, Time dependent accumulation of
nicotine derivatives in the culture medium of Arthrobacter nicotinovorans pAO1, 1st edition Young
Researchers in BioScience International Symposium, Cluj-Napoca, Romnia 23-27 Iulie 2014;

GUZUN Doina, BOIANGIU Rzvan tefan, MIHAN Marius, Dinamica acumulrii derivailor
nicotinici n mediile de Arthrobacter nicotinovorans pAO1, Conferina tiinific anual a Facultii
de Biologie, UAIC, Conservarea biodiversitii n contextul dezvoltrii durabile, Ia i, Romnia
23-25 Octombrie 2014;

GUZUN Doina, BOIANGIU Rzvan tefan, MIHAN Marius, Dinamica acumulrii derivailor
nicotinici n mediile de Arthrobacter nicotinovorans pAO1, Sesiunea naional de comunicri
tiinifice studeneti, Ediia a XIX-a, Etapa a I-a, USM, Chiinu, R. Moldova 17 Martie 2015;

GUZUN Doina, BOIANGIU Rzvan tefan, MIHAN Marius, Dinamica acumulrii derivailor
nicotinici n mediile de Arthrobacter nicotinovorans pAO1, Sesiunea naional de comunicri
tiinifice studeneti, Ediia a XIX-a, Etapa a II-a, USM, Chiinu, R. Moldova 13-14 Mai 2015;
CROMATOGRAFIA DE NALT PERFORMAN N MEDIU LICHID
(HPLC) PENTRU SEPARAREA UNOR DERIVAI METABOLICI DIN
ARTHROBACTER NICOTINOVORANS