Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
A MATERIALULUI BIOLOGIC
Formatori:
CS II dr. Georgeta C. Cozaru
CS III dr. Anca Chisoi
Tematica cursului
Tehnica de hibridizare fluorescenta in situ (FISH)
Detectarea aneuploidiilor (13, 18, 21, x, y) din lichid amniotic prin
tehnica FISH
Metode cromatografice
Sonde centromerice -
au rol in identificarea
unui anumit cromozom
si / sau detectarea
anomaliilor numerice
ale cromozomului
respectiv.
Tipuri de sonde
Sonde telomerice - permit diagnosticarea
microdeletiilor sau altor rearanjamente criptice.
Sonde subtelomerice
M-FISH
Materiale necesare:
Preparate citogenetice efectuate din sediment celular
fixat în solutie Carnoy, necolorate sau bandate.
Preparatul citogentic trebuie să fie efectuat cu cel putin 24h
înaintea aplicării tehnicii FISH, să prezinte un număr mare
de metafaze (minim 20), fără fond citoplasmatic, bine etalate,
în zona în care se va aplica sonda.
Protocol de lucru:
Se analizează preparatul la microscopul optic cu
contrast de fază si se delimitează zona de interes (22 x
22mm) prin marcarea lamei cu un creion cu diamante.
2. Pretratamentul preparatelor citogenetice
Solutii necesare:
2 x SSC
2 x SSC/ 0,5% Igepal
Soluiii de etanol 70%, 85% si 100%
Protocol de lucru:
soluție 2 x SSC/0,5% Igepal, 30 de min, la
37°C;
se scurge excesul de soluție de pe lamă
soluție 2 x SSC, 2 min la temperatura camerei
deshidratare - soluții de etanol 70%, 85%,
100%, 5 min / baie, la temperatura camerei
uscare la temperatura camerei până în
momentul utilizării.
Materiale necesare:
preparat citogenetic pretratat
Solutii necesare:
solutie 70% formamida/ 2 x SSC:
70 ml formamida + 10 ml 20X SSC + 20 ml H2Od
solutii de etanol 70%, 85% si 100%
Protocol de lucru:
1. Preparatul citogenetic necesita o preincalzire
la 37ºC, timp de 10 min, inainte de denaturare.
2. solutie 70% formamida/ 2 x SSC, preincalzita
in baie de apa la 76ºC timp de 2 minute.
3. Dupa incheierea timpului de denaturare,
preparatele se introduc rapid in solutie de etanol
70% (-20ºC), timp de 2 minute.
4. Se continua cu imersia in solutiile de etanol
85% (-20ºC) si 100% (-20ºC), cate 2 minute in
fiecare solutie.
5. Preparatele se usuca la temperatura
ambianta.
FISH metafazic – etapele de lucru
4. Denaturarea sondelor FISH
Protocol de lucru:
microtuburile cu sonda se preincalzesc la 37ºC, la
termostat, timp de 10 min, inainte de denaturare.
denaturarea sondei se realizeaza in baie de apa
(microtubul se pune pe un plutitor) la 76ºC, timp de 2
minute.
5. Hibridizarea ADN de interes- sonda
Materiale necesare:
preparat citogenetic si sonda denaturata
lamele 22X 22 mm
guma siliconata (rubber cement)
Protocol de lucru:
Se pipeteaza 10μl sonda de preparat, in aria preselectata si se
acopera zona cu o lamela.
Se sigileaza cu guma siliconata si se incubeaza in camera
umeda peste noapte (16 ore) la 37ºC.
6. Spalari post-hibridizare
Materiale necesare:
preparat citogenetic hibridizat
Solutii necesare:
2 x SSC preparat conform protocoluli mentionat anterior
0,4 x SSC/0,3% Igepal: 10 ml 20 x SSC + 475 ml H2Od + 1,5 ml
Igepal
2 x SSC/ 0,1% Igepal: 250ml solutie 2 x SSC + 1,25 l Igepal
Protocol de lucru :
Se indeparteaza lamela cu grija pentru a nu zgaria preparatul (numai
pe orizontala, fara ridicarea lamelei).
Daca lamela nu aluneca, se introduce preparatul cu lamela intr-un pahar
cu 2 x SSC, pentru cateva secunde.
Dupa indepartarea lamelei se introduce preparatul in urmatoarele
solutii:
0,4 x SSC/0,3% Igepal, 2 minute, la 74ºC in baia de apa; se scoate
lama si se scurge excesul de lichid pe o hartie absorbanta
2 x SSC/0,1% Igepal la temperatura ambianta, timp de 30
secunde, dupa care se scurge excesul de lichid pe o hartie
absorbanta; lama nu se lasa la uscat.
7. Contracolorarea preparatului marcat
Materiale necesare:
preparat citogenetic marcat si spalat
lamela 24 x 60 mm
guma siliconata (rubber-cement)
Solutii necesare:
solutie DAPI/ Vectashield (antifade) (se
gaseste in kit, este gata preparata, vine
impreuna cu sonda)
Protocol de lucru:
Se pipeteaza pe lama 10-15 μl de solutie DAPI/
Vectashield
Se plaseaza o lamela de 24 x 60 mm
Se elimina delicat bulele de aer, fara a zgaria suprafata
preparatului
Se sigileaza cu guma siliconata
Se plaseaza la frigider, la adapost de lumina, timp de 10
minute.
Se examineaza la microscopul cu epifluorescenta cu
obiectiv 63X, cu imersie, utilizand filtrele adecvate
spectrului de emisie al fluorocromilor utilizati.
Se analizeaza metafazele si nucleii interfazici cu
semnale fluorescente vizibile, bine individualizate, din
regiuni ale preparatului cu zgomot de fond redus.
De
retinut:
TEHNICA CISH -
HIBRIDIZARE
CROMOGENICA IN SITU
CS II Georgeta Cozaru
Definitie
Tehnica CISH - Hibridizare Cromogenica In Situ:
tehnică de citogenetică moleculară ce utilizează
sonde ADN etichetate cu digoxigenin care sunt
specifice pentru locusul genei de interes pentru a
hibridiza la acizii nucleici complementari prezenţi în
probă.
Principiile procedurii
Tehnica CISH permite evaluarea aberaţiilor genetice cu un
microscop optic şi o lentilă uscată 40X.
După deparafinare, probele sunt pretratate printr-o etapă de
recuperare a căldurii urmată de digestia enzimatică.
Probele sunt apoi deshidratate şi uscate cu aer înainte de
adăugarea sondei de interes.
În urma adăugării sondei şi lamelei la probă, combinaţia
este denaturată şi hibridizată peste 10 ore sau peste noapte.
Apoi, proba este spălată pentru a înlătura sonda
nehibridizată iar semnalul este detectat cromogenic prin
adăugarea secvenţială de anticopri la digoxigenin şi
conjugat peroxidază de hrean-polimer (HRP).
Principiile procedurii
Culoarea este dezvoltată prin reacţia HRP legat cu
cromogenul DAB şi substratul H2O2.
În cele din urmă, proba este colorată pentru contrast cu
hematoxilină Mayer pentru a identifica morfologia
ţesutului şi acoperită cu o lamelă.
Trastuzumab:
este un anticorp monoclonal specific pentru proteina HER2
este eficient doar la pacienţii ale căror tumori prezintă o
amplificare a genei HER2 şi/sau supraexprimarea proteinei
HER2.
Date generale
Gena HER 2 codifica receptorul HER 2 (proteina
transmembranară cu activitate tirozinkinazică) care
se găseşte la suprafaţa celulară.
Se încălzeşte Heat Pretreatment Solution EDTA (PT2) - la cel puţin 98°C (se pune solutia
de HPS EDTA pe baia de apa cu aprox cu 2.5h inainte)
Se transferă lamele imediat în apă deionizată sau distilată, şi se spală în 3x 2min după care
se scurge excesul de apă de pe lamă
Se deshidratează în etanol 70%, 85%, 95% şi 2x 100%, pentru fiecare timp de 2 min.
Se aplică soluţia DAB 3-4 picături per lamă şi se incubează 30 min la temperatura
camerei
Evaluaţi posibila heterogenitate intratumorală a stării
genei HER2 înainte de numărarea CISH.
Evaluarea semnalelor HER2 CISH
Un eşantion de ţesut este heterogen dacă starea genei HER2 (celule
amplificate şi neamplificate) variază în zone diferite ale aceleiaşi
secţiuni a unui cancer de sân primar.
Trebuie să fie evaluate celule din fiecare zonă de heterogenitate pentru
a determina care stare HER2 (amplificată sau neamplificată)
predomină în peste 50% din secţiunea tumorală.
Procedaţi la numărarea semnalelor din zona unde starea HER2 este
predominantă pentru această tumoră.
Evaluarea semnalelor HER2 CISH
Neamplificarea
Definită ca 1–5 puncte unice în majoritatea
(>50%) celulelor carcinomatoase din zona
tisulară selectată.
Număraţi o aglomerare mică ca 5 puncte.
Un punct unic din celule carcinomatoase sau celulele epiteliale
normale de pe aceeaşi lamă poate fi folosit ca referinţă pentru
determinarea a ceea ce reprezintă o aglomerare mică.
http://www.slideshare.net/hussain_761/theories-of-
chromatography
Tipuri de metode cromatografice in functie de natura
fazelor
•Cromatografie de gaze
– Gaz-lichid (GLC)
– Gaz-solid (GSC)
•Cromatografie de lichide
– Lichid-lichid (LLC)
Clasificarea
– Lichid-solid
în(LSC)
functie de configuratia sistemului
cromatografic
1. Cromatografie pe coloana - faza fixa este depusa intr-o
coloana verticala
– Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura)
– Cromatografie pe coloane capilare
2. Cromatografie planara - faza fixa este depusa pe o
suprafata plana
– Cromatografie în strat subtire
– Cromatografie pe hartie
Procedeele cromatografice includ următoarele faze, indiferent de
tipul metodei:
Analiza cromatografica
• Analiza calitativa – pe baza compararii timpilor de retentie
inregistrati pentru compusii din proba si pentru etaloane
cunoscute
• Analiza cantitativa – se calculeaza pe baza ariei cuprinse sub
fiecare pic cromatografic (sau inaltimea picului) care este
proporţională cu concentraţia compusului respectiv
• coloane cu umplutură
• coloane capilare
Avantaje :
• Rapiditate
• Cost redus
• Aplicabilitate la compuşi care prezintă instabilitate termică, atât
hidrosolubili cât şi liposolubili
• Posibilitatea analizării simultane a mai multor probe
• Reproductibilitatea rezultatelor
Dezavantaje:
• Sensibilitate mai mică decât în cromatografia de gaz sau lichid
• Necesitatea unei purificări mai avansate
• Repetabilitate scăzută în cazul unor temperaturi sau umidităţi
ambientale ridicate
Mod de lucru
Se folosesc plăci de sticlă de diferite dimensiuni, (pana la 20 x
20 cm) pe care se depune un strat uniform de absorbant cu
grosime de aproximativ 250 µm (faza staţionară) .
Parametrii analizati
- Parametrii de dispersie a luminii – in functie de unghiul de dispersie
se calculeaza marimi legate de dimensiunile si granularitatea
particulei analizate
- Parametrii de fluorescenta - in urma marcarii particulelor cu
fluorocromi ce se leaga specific de molecule interne sau externe ale
particulei.
http://s2.postimg.org/hf91gzt6h/flow2.png
Componentele sistemului de citometrie in flux
Fluorocromi
cu legare covalenta de sonde proteice (anticorpi,
proteine fluorescente
Etapele analizei prin flowcitometrie/ citometrie
de flux
http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n11/images/nprot.201 http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.200
3.131-F6.jpg 8.77-F1.jpg
Aplicatii ale citometriei de flux
- Analiza AND (sinteza/degradare, determinarea gradului de
ploidie, analiza ciclului celular)
- Imunofenotipare cu aplicatie in leucemiile acute si
limfoproliferari maligne, detectia bolii reziduale minime,
subpopulatii limfocitare T
- Monitorizarea infectiei cu virusul HIV
- Determinarea receptorilor de suprafata
- Cuantificarea anticorpilor antitrombocitari
- Analiza moleculelor de adeziune
- Analiza celulelor stem hematopoietice
- Sortare de particule/celule
- Analiza fluxurilor ionice, a metbolismului oxidative si a
modificarilor de pH
- Detectia de celule tumorale circulante
- Detectia antigenului carcinoembrionar
- Determinarea hemoglobinei fetale
- Teste de fagocitoza
- Teste referitoare la proliferarea celulara
Bibliografie
Covic M, Ştefănescu D, Sandovici I (sub redacţia), (2011), Tratat de genetică medicală , Ediția
II, Polirom, Iaşi
Jean-Louis Serre, (2006), Diagnostic Techniques in Genetics, John Wiley&Sons Ltd., England
Gavrila L., (2003), Genomica, Editura Enciclopedica, Bucuresti
Liang Cheng, David Y Zhang, (2008), Molecular Genetic Pathology, Humana Press
Nicholas C Dracopoli, Jonathan L. Haines, Bruce R. Korf & al., (2004), Short Protocol in
Human Genetics, Wiley
ZytoDot SPEC ERBB2 – Protocol - https://www.zytovision.com/products/zytodot2c/c-3018
FISH Probes from Cytocell – DNA Screening Solution – http://www.cytocell-us.com/
Mihai Ionica, Sisteme de gaz si lichid cromatografie cuplate cu spectrometrie de masa - curs de
pregatire profesionala, Spitalul Clinic de Urgenta Bucuresti, Centrul de Cercetari Stiintifice
Medico-Militare, Universitatea "Politehnica" Bucuresti, 2016
http://www.scrigroup.com/sanatate/sport/UTILIZAREA-GAZCROMATOGRAFIEI-
I11593.php
http://documents.tips/documents/cursul-12-13-metode-cromatograficepdf.html
Radu-Ionut Huica, Mihaela Surcel, Adriana Narcisa Munteanu, Cornel Ursaciuc, Mihaela Zlei,
Florin Zugun-Eloae, Eugen Casasevici, Citometrie in flux, principii si aplicatii clinice; ISBN
978-973-160-076-5, ed. Viata Medicala Romaneasca, Bucuresti, 2013