Sunteți pe pagina 1din 88

TEHNICI SPECIALE DE PRELUCRARE

A MATERIALULUI BIOLOGIC

Formatori:
CS II dr. Georgeta C. Cozaru
CS III dr. Anca Chisoi
Tematica cursului
Tehnica de hibridizare fluorescenta in situ (FISH)

Detectarea aneuploidiilor (13, 18, 21, x, y) din lichid amniotic prin
tehnica FISH

Tehnica CISH - hibridizare cromogenica in situ



Tehnica cish - protocol pentru detectia genei her2 prin hibridizare
cromogenica in situ

Metode cromatografice

Citometria în flux/ flux citometria/ flowcitometrie


Tehnica FISH
(Hibridizarea fluorescenta in situ )

Formator: CS II dr. Georgeta COZARU


DEFINITIE

Hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) = tehnică de


citogenetică moleculară utilizată în scopul identificării
anomaliilor cromozomiale, numerice și structurale (care
nu pot fi detectate prin cariotipare).

este o metodă specifică, performantă,


dar laborioasă, care necesită
celule intacte; nu se substituie
celorlalte metode de
.
analiză cromozomială
şi are indicaţii foarte precise
Tipuri:

 FISH metafazic (a)

 FISH interfazic (b)


Indicaţii
in cazul suspiciunii clinice sau citogenetice
(prin cariotip) a anomaliilor de structura ale
cromozomilor:
 microdeletii sau microduplicatii,
 translocatii,
 identificarea cromozomilor marker,

stabilirea sexului genetic ,

detectarea anomaliilor numerice cromozomiale
(aneuploidii).
Principiul metodei:
ataşarea la secvenţa-
ţintă a unei sonde de
ADN monocatenar
(de circa 40 kb),
marcată fluorescent,
pe baza
complementarităţii, de
o secvenţă-ţintă a
unui cromozom.
Principiul metodei:
• Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizată la
microscopul cu fluorescenţă echipat cu filtre de excitaţie şi
emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice zonei-ţintă.

Rezultat: se numără şi se analizează semnalele prezente în 100 de celule (de ex.,


trei semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indică sindromul Down).
Tipuri de sonde

a. sonde specifice de locus,


b. sonde centromerice,
c. sonde telomerice,
d. sonde de marcare a intregului cromozom
Tipuri de sonde
Sonde specifice unui locus, pentru identificarea
deletiilor sau duplicatiilor submicroscopice
(care nu sunt vizibile utilizand cariotipul
conventional).
 Absenta semnalului fluorescent corespunzator
sondei pe un anumit cromozom, inseamna deletia
(absenta) zonei respective.
 Aparitia a doua semnale diferite corespunzatoare
sondei, indica o microduplicatie.

Aplicații: diagnosticarea sindroamelor produse prin


microdeletii sau microduplicatii cromozomiale: Williams,
Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi, Angelman, velo-cardio-
facial (Di George), cat-eye etc.
Tipuri de sonde

Sonde centromerice -
au rol in identificarea
unui anumit cromozom
si / sau detectarea
anomaliilor numerice
ale cromozomului
respectiv.
Tipuri de sonde
Sonde telomerice - permit diagnosticarea
microdeletiilor sau altor rearanjamente criptice.

Sonde subtelomerice

Sonde specifice unui cromozom - permit


“colorarea” intregului cromozom sau doar a unei
regiuni.
 Prin colorarea diferita a doi sau mai multi cromozomi se
pot identifica mici rearanjamente in care acestia sunt
implicati.
FISH telomeric

M-FISH

FISH cu Xp/Xq proba subtelomerica


De retinut:

FISH-ul metafazic aduce in plus fata de cariotip sau de


FISH-ul interfazic detalii despre anomaliile de structura
ale cromozomilor.

Deoarece aceasta metoda presupune ca prima etapa de lucru,
obtinerea unor culturi celulare (limfocite din sange periferic sau
amniocite recoltate prin amniocenteza in saptamanile 15-17 de
sarcina), intervalul minim pentru diagnostic este de doua
saptamani.

FISH-ul pe nuclei interfazici (utilizat mai ales in


diagnosticul prenatal) permite punerea în evidenţă a
anomaliilor numerice, detecţia sexului genetic într-un
timp scurt (48-72 h) - pe nuclei interfazici.
Tehnica FISH - etapele de lucru
1. Selectarea preparatelor citogenetice pentru
aplicarea tehnicii FISH

Materiale necesare:

Preparate citogenetice efectuate din sediment celular
fixat în solutie Carnoy, necolorate sau bandate.
Preparatul citogentic trebuie să fie efectuat cu cel putin 24h
înaintea aplicării tehnicii FISH, să prezinte un număr mare
de metafaze (minim 20), fără fond citoplasmatic, bine etalate,
în zona în care se va aplica sonda.
Protocol de lucru:
 Se analizează preparatul la microscopul optic cu
contrast de fază si se delimitează zona de interes (22 x
22mm) prin marcarea lamei cu un creion cu diamante.
2. Pretratamentul preparatelor citogenetice

Solutii necesare:
 2 x SSC

2 x SSC/ 0,5% Igepal
 Soluiii de etanol 70%, 85% si 100%
Protocol de lucru:
 soluție 2 x SSC/0,5% Igepal, 30 de min, la
37°C;
se scurge excesul de soluție de pe lamă

soluție 2 x SSC, 2 min la temperatura camerei

deshidratare - soluții de etanol 70%, 85%,
100%, 5 min / baie, la temperatura camerei
 uscare la temperatura camerei până în
momentul utilizării.

 În cazul în care preparatul nu a fost utilizat în


interval de 2 săptămâni, este necesară
repetarea etapei de pretratament.
3. Denaturarea preparatului citogenetic

Materiale necesare:

preparat citogenetic pretratat

Solutii necesare:
 solutie 70% formamida/ 2 x SSC:
70 ml formamida + 10 ml 20X SSC + 20 ml H2Od
 solutii de etanol 70%, 85% si 100%
Protocol de lucru:
 1. Preparatul citogenetic necesita o preincalzire
la 37ºC, timp de 10 min, inainte de denaturare.
 2. solutie 70% formamida/ 2 x SSC, preincalzita
in baie de apa la 76ºC timp de 2 minute.
 3. Dupa incheierea timpului de denaturare,
preparatele se introduc rapid in solutie de etanol
70% (-20ºC), timp de 2 minute.
 4. Se continua cu imersia in solutiile de etanol
85% (-20ºC) si 100% (-20ºC), cate 2 minute in
fiecare solutie.
 5. Preparatele se usuca la temperatura
ambianta.
FISH metafazic – etapele de lucru
4. Denaturarea sondelor FISH

Sondele de secventa unica (locus-specifice) sunt


deja preparate – se gasesc in kit.

Intr-un microtub de 1,5ml se alicoteaza 10 μl sonda.
In cazul combinarii a 2 sonde intr-un singur experiment, se
amesteca cate 5 μl din fiecare sonda.

Protocol de lucru:

microtuburile cu sonda se preincalzesc la 37ºC, la
termostat, timp de 10 min, inainte de denaturare.

denaturarea sondei se realizeaza in baie de apa
(microtubul se pune pe un plutitor) la 76ºC, timp de 2
minute.
5. Hibridizarea ADN de interes- sonda

Materiale necesare:
preparat citogenetic si sonda denaturata
lamele 22X 22 mm
guma siliconata (rubber cement)

De la denaturare si pana la inceperea hibridizarii


preparatelor nu trebuie sa treaca mai mult de 5
minute.

 Protocol de lucru:
Se pipeteaza 10μl sonda de preparat, in aria preselectata si se
acopera zona cu o lamela.
Se sigileaza cu guma siliconata si se incubeaza in camera
umeda peste noapte (16 ore) la 37ºC.
6. Spalari post-hibridizare
Materiale necesare:

preparat citogenetic hibridizat

Solutii necesare:

2 x SSC preparat conform protocoluli mentionat anterior

0,4 x SSC/0,3% Igepal: 10 ml 20 x SSC + 475 ml H2Od + 1,5 ml
Igepal

2 x SSC/ 0,1% Igepal: 250ml solutie 2 x SSC + 1,25 l Igepal

Protocol de lucru :

Se indeparteaza lamela cu grija pentru a nu zgaria preparatul (numai
pe orizontala, fara ridicarea lamelei).
Daca lamela nu aluneca, se introduce preparatul cu lamela intr-un pahar
cu 2 x SSC, pentru cateva secunde.

Dupa indepartarea lamelei se introduce preparatul in urmatoarele
solutii:
0,4 x SSC/0,3% Igepal, 2 minute, la 74ºC in baia de apa; se scoate
lama si se scurge excesul de lichid pe o hartie absorbanta
2 x SSC/0,1% Igepal la temperatura ambianta, timp de 30
secunde, dupa care se scurge excesul de lichid pe o hartie
absorbanta; lama nu se lasa la uscat.
7. Contracolorarea preparatului marcat

Materiale necesare:
 preparat citogenetic marcat si spalat
 lamela 24 x 60 mm
 guma siliconata (rubber-cement)

Solutii necesare:
 solutie DAPI/ Vectashield (antifade) (se
gaseste in kit, este gata preparata, vine
impreuna cu sonda)
Protocol de lucru:
 Se pipeteaza pe lama 10-15 μl de solutie DAPI/
Vectashield
 Se plaseaza o lamela de 24 x 60 mm
 Se elimina delicat bulele de aer, fara a zgaria suprafata
preparatului

Se sigileaza cu guma siliconata

Se plaseaza la frigider, la adapost de lumina, timp de 10
minute.

Se examineaza la microscopul cu epifluorescenta cu
obiectiv 63X, cu imersie, utilizand filtrele adecvate
spectrului de emisie al fluorocromilor utilizati.
 Se analizeaza metafazele si nucleii interfazici cu
semnale fluorescente vizibile, bine individualizate, din
regiuni ale preparatului cu zgomot de fond redus.
De
retinut:
TEHNICA CISH -
HIBRIDIZARE
CROMOGENICA IN SITU

CS II Georgeta Cozaru
Definitie
Tehnica CISH - Hibridizare Cromogenica In Situ:
tehnică de citogenetică moleculară ce utilizează
sonde ADN etichetate cu digoxigenin care sunt
specifice pentru locusul genei de interes pentru a
hibridiza la acizii nucleici complementari prezenţi în
probă.
Principiile procedurii
Tehnica CISH permite evaluarea aberaţiilor genetice cu un
microscop optic şi o lentilă uscată 40X.
După deparafinare, probele sunt pretratate printr-o etapă de
recuperare a căldurii urmată de digestia enzimatică.
Probele sunt apoi deshidratate şi uscate cu aer înainte de
adăugarea sondei de interes.
În urma adăugării sondei şi lamelei la probă, combinaţia
este denaturată şi hibridizată peste 10 ore sau peste noapte.
Apoi, proba este spălată pentru a înlătura sonda
nehibridizată iar semnalul este detectat cromogenic prin
adăugarea secvenţială de anticopri la digoxigenin şi
conjugat peroxidază de hrean-polimer (HRP).
Principiile procedurii
Culoarea este dezvoltată prin reacţia HRP legat cu
cromogenul DAB şi substratul H2O2.
 În cele din urmă, proba este colorată pentru contrast cu
hematoxilină Mayer pentru a identifica morfologia
ţesutului şi acoperită cu o lamelă.

Interpretare: semnalul genei este identificat printr-


un punct unic, maro închis când este prezent în
copii scăzute, sau aglomerări maro când semnalul
prezintă multe copii.
 Folosind un microscop cu câmp luminos cu un obiectiv
40X, celulele tumorale sunt localizate, iar copiile genei
sunt cuantificate.
 DAB formează un precipitat colorat, aşa că rezultatele
pot fi arhivate şi revăzute mai târziu.
TEHNICA CISH
- PROTOCOL PENTRU
DETECTIA GENEI HER2

KIT ZYTO DOT SPEC HER2


- ZYTOVISION -
Date generale
Amplificarea genei HER2 sau supraexprimarea
proteinei HER2 a fost identificată în 18–30% din
cancerele la sân umane.

Identificarea stării de amplificare a genei HER2


este importantă pentru determinarea prognosticului
pacienţilor diagnosticaţi cu cancer de sân invaziv,
dar şi pentru selectarea pacienţilor eligibili pentru
terapia cu trastuzumab (Herceptin®, F. Hoffmann-La Roche Ltd,
Basel, Elveţia şi Genentech, Inc., South San Francisco, CA).

 Trastuzumab:
este un anticorp monoclonal specific pentru proteina HER2
este eficient doar la pacienţii ale căror tumori prezintă o
amplificare a genei HER2 şi/sau supraexprimarea proteinei
HER2.
Date generale
Gena HER 2 codifica receptorul HER 2 (proteina
transmembranară cu activitate tirozinkinazică) care
se găseşte la suprafaţa celulară.

Factorii de creştere care se leagă de receptorul


HER 2 stimulează creşterea și diviziunea celulară .

Amplificarea genei HER 2 determina acumularea


receptorilor HER 2 la nivelul suprafeţei celulare si
are ca rezultat diviziunea celulara continua.
Metode de determinare:
1. IMUNOHISTOCHIMICE

sunt primele metode utilizate


prezinta un numar crescut de rezultate fals negative (scor 0 si 1+) sau fals
pozitive (scor 2+ si 3+) atunci cand se incearca o masurare cantitativa a
expresiei oncogenei (proteina receptor).
Metode de determinare:
2. Hibridizare in situ prin imunofluorescenta (FISH sau HercepTest)
3. Hibridizare cromogenica in situ (CISH)

Testul FISH – pentru evaluarea amplificarii oncogenei


Her-2/neu

HercepTest – pentru evaluarea supraexpresiei proteinei


Her-2/neu

Tehnica CISH - hibridizare cromogenica in situ

sunt in prezent cele mai bune tehnici de determinare


cantitativa a expresiei oncogenei Her-2/neu, datorita atat
sensibilitatii crescute, cat si standardizarii rezultatului
acestor tehnici;
 Un rezultat negativ al testului FISH / CISH
(supraexpresia proteinei Her-2/neu negativa) se
coreleaza cu un scor mai mic decat +2 obtinut
prin metoda imunohistochimica,

 Un rezultat pozitiv (supraexpresia proteinei her-


2/neu pozitiva) se coreleaza cu un scor mai
mare de +2 obtinut prin metoda
imunohistochimica.

 Intre rezultatele celor doua metode expuse mai


sus exista o concordanta de numai 79%.
supraexpresia proteinei her-2/neu pozitiva
Metode de determinare:
4. P.C.R (Reactie de Polimerizare in Lant)

este recunoscuta ca si metoda cu sensibilitatea diagnostica


cea mai mare;
nu s-a obtinut insa, standardizarea rezultatelor in vederea
determinarii cantitative a expresiei Her-2/neu datorita
numarului mic de studii efectuate pana in prezent.
Importanta determinarii expresiei
oncogenei Her-2/neu:

valoarea sa predictiva asupra evolutiei bolii este


mai mare in cazul pacientelor cu ganglioni limfatici
loco-regionali invadati tumoral (N +).

amplificarea oncogenei her/2-neu este un marker


predictiv pentru hormono-rezistenta la pacientele
cu receptori estrogenici prezenti.
amplificarea oncogenei her/2-neu este un marker predictiv
pentru rezistenta la tratamentul adjuvant chimioterapic al bolii
neoplazice cu localizare mamara.

amplificarea acestei oncogene (testul FISH / CISH pozitiv) se


coreleaza cel mai bine cu raspunsul clinic la medicamentul
Trastuzumab (Herceptin®).
Etapele de lucru
Fixarea în formalină 10% neutră tamponată - 24 ore
la temperatura camerei (rt).

Pentru obtinerea unei fixări optime si uniforme esantionul
de tesut nu trebuie să depăsească 0,5 cm3.
Procesare standard si includere la parafină.
 Includerea la parafină trebuie realizată la temperaturi mai
mici de 65°C.
Realizarea de sectiuni de 3-5 µm.
Etalare pe lame si fixate pentru 2-16 h la 50-60°C.
I.Pretratamentul lamelor
(deparafinarea/ proteoliză) (ziua 1)
 Se incubează lamele timp de 10 min la 70°C pe un platou de uscare
 Se incubează pentru 2x 5 min în xilen.

Se incubează 3x 3 min în etanol 100%.

Spălati în 3x 2min apă distilată sau deionizată.

Se încălzeşte Heat Pretreatment Solution EDTA (PT2) - la cel puţin 98°C (se pune solutia
de HPS EDTA pe baia de apa cu aprox cu 2.5h inainte)

Se introduc lamele în Heat Pretreatment Solution EDTA (PT2) şi se incubează timp de 15


min

Se transferă lamele imediat în apă deionizată sau distilată, şi se spală în 3x 2min după care
se scurge excesul de apă de pe lamă

Se aplică apoi soluţia de pepsină (ES1) (adusă la temperatura camerei) pe ţesut şi se


incubează timp de 5- 10 min

în funcţie de natura şi durata fixării, grosimea secţiunilor şi natura ţesutului în atmosferă umedă.

Se spală în 3X 2 min în apă deionizată sau distilată

Se deshidratează în etanol 70%, 85%, 95% şi 2x 100%, pentru fiecare timp de 2 min.

Se usucă apoi preparatul.


II. Denaturarea şi hibridizarea
(ziua 1)

Se votexeaza Zyto Dot SPEC HER2 Probe (PD1) şi


se dispun 10µl la nivelul preparatului.

Se distribuie picătură cu picătură pe toată suprafaţa


preparatului pentru a evita concentrarea locală a sondei.

Evitând formarea bulelor, se acoperă preparatul cu o lamelă (22mm x


22mm).

Se izolează lamela cu rubber cement.

Se denaturează lamele la 94-95°C timp de 5 min, pe un platou de


uscare.

Se transferă lamele în cameră umedă şi se hibridizează peste noapte


la 37°C (într-un cuptor de hibridizare).

Este esenţial ca preparatul să nu se deshidrateze pe perioada hibridizării.
III. Post-hibridizarea şi detecţia
(ziua 2)

Se îndepărtează cu grijă rubber cementul

Se îndepărtează lamela prin submersie în Wash Baffer


SSC (WB1) la temperatura camerei timp de 5min.

Se spală 5 min în Wash Baffer SSC (WB1) la 75-80°C.



WB1 trebuie preîncălzit. Se creşte temperatura cu 1°C per
lamă pentru mai mult de 2 lame, dar nu depăşiţi 80°C.

Se spală 3x 2min în apă deionizată sau distilată.

Se incubează 10 min în 3% H2O2 (9 părţi metanol: 1 parte


H2O2 30%).

Se spală 3x 2min în PBS/Tween


III. Post-hibridizarea şi detecţia
(ziua 2)

Se aplică Blocking Solution (BS1) 3-4 picături per lamă şi


se incubează 10 min la temperatura camerei

Se îndepărtează BS1, dar nu brusc

Se aplică Mouse- Anti- DIG (AB1) 3-4 picături per lamă şi


se incubează 30 min la temperatura camerei

Se spală 3x 2min în PBS/Tween

Se aplică Anti-Mouse-HRP-Polymer (AB2) 3-4 picături per


lamă şi se incubează 30 min la temperatura camerei

Se spală 3x 2min în PBS/Tween


III. Post-hibridizarea şi detecţia
(ziua 2)
În timpul spălării, preparaţi soluţia DAB adăugând 1 picătură de DAB solution A la
1 ml de DAB solution B.

Se aplică soluţia DAB 3-4 picături per lamă şi se incubează 30 min la temperatura
camerei

Se transferă lamele într-o cuvă de colorare şi se spală 2 min în apa de la robinet

Se colorează lamele cu soluţia de Hematoxilină Mayer (CS1) timp de 8-10 s

Se transferă lamele într-o cuvă de colorare şi se spală 2 min în apa de la robinet

Se deshidratează în etanol 70%, 85%, 95% şi 2x 100%, pentru fiecare timp de 2


min

Incubaţi 2x 2min în xilen (foarte pur)

Evitând formarea bulelor se montează lamela (22mm x 22mm; 24mm x 32mm) cu


ajutorul Mounting Solution (MT4) şi se usucă lamele aproximativ 30 min

Se evaluează preparatul în microscopie optică


Evaluarea semnalelor HER2 CISH

Utilizând obiectivele 4X–20X, se scaneaza proba


colorată CISH pentru a identifica cele mai
reprezentative zone din punct de vedere histopatologic
ale carcinomului invaziv.

Evitaţi:
zonele de necroză,
suprapunerea semnalelor din cauza nucleilor care se suprapun,
nucleii cu intensitate slabă a semnalului,
componentele carcinomului intraductal (DCIS) din carcinoamele
invazive.


Evaluaţi posibila heterogenitate intratumorală a stării
genei HER2 înainte de numărarea CISH.
Evaluarea semnalelor HER2 CISH

Dacă eşantionul este omogen, selectaţi o


zonă de ţesut cu semnale CISH puternice
pentru numărarea semnalelor.

Procedaţi la numărarea semnalelor.
Evaluarea semnalelor HER2 CISH

Dacă eşantionul prezintă heterogenitate intratumorală a stării


genei HER2 în componenta de carcinom invaziv, selectaţi
zonele care reprezintă fiecare stare a genei HER2 pentru
numărarea semnalelor.


Un eşantion de ţesut este heterogen dacă starea genei HER2 (celule
amplificate şi neamplificate) variază în zone diferite ale aceleiaşi
secţiuni a unui cancer de sân primar.


Trebuie să fie evaluate celule din fiecare zonă de heterogenitate pentru
a determina care stare HER2 (amplificată sau neamplificată)
predomină în peste 50% din secţiunea tumorală.


Procedaţi la numărarea semnalelor din zona unde starea HER2 este
predominantă pentru această tumoră.
Evaluarea semnalelor HER2 CISH

Neamplificarea

Definită ca 1–5 puncte unice în majoritatea
(>50%) celulelor carcinomatoase din zona
tisulară selectată.

Raportaţi rezultatele ca media numărătorii


totale a celor 30 de celule pentru a obţine un
diagnostic clar al neamplificării.
CISH HER2-neu – fără amplificare
Evaluarea semnalelor HER2 CISH
Amplificarea
 Definită ca:
mai mult de 5 puncte în majoritatea (>50%) celulelor
carcinomatoase din zona tisulară selectată sau
aglomerări mari în majoritatea (>50%) celulelor
carcinomatoase din zona tisulară selectată sau
un amestec de puncte multiple şi aglomerări mari în
majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona
tisulară selectată sau
un amestec de puncte multiple şi aglomerări mici în
majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona
tisulară selectată sau
aglomerări mici în majoritatea (>50%) celulelor
carcinomatoase din zona tisulară selectată.
CISH HER2-neu – amplificare cu grad scăzut
CISH HER2-neu
amplificare cu grad crescut
Cazuri neclare de amplificare sau
neamplificare
Interpretaţi cu grijă probele care nu aparţin
clar categoriilor de amplificare sau
neamplificare.
 Aceste probe expun 4–6 puncte în majoritatea
(>50%) celulelor carcinomatoase din câmpul-
ţintă selectat.

Când numărul mediu de puncte este între 4 şi 6
după ce au fost numărate 30 de celule
carcinomatoase, trebuie numărate alte 30 de
celule pentru a obţine un total de 60 de celule.

Dacă aveţi încă dubii, analiza trebuie repetată
pe o lamă cu o probă proaspătă.
Cazuri neclare de amplificare sau
neamplificare

1. Număraţi punctele din 30 de celule tumorale


din zona tisulară selectată.

Consultaţi #4 de mai jos dacă aglomerările mici sunt
evidente.

2. Totalizaţi numărul de puncte din cele 30 de


celule şi calculaţi media.

3. Înregistraţi rezultatul pe baza mediei a 60 de


celule
Cazuri neclare de amplificare sau
neamplificare
4. Dacă se observă un amestec de puncte unice şi
aglomerări mici (din cauza aglomerării a mai multor
puncte unice) sau se observă doar aglomerări mici:


Număraţi o aglomerare mică ca 5 puncte.


Un punct unic din celule carcinomatoase sau celulele epiteliale
normale de pe aceeaşi lamă poate fi folosit ca referinţă pentru
determinarea a ceea ce reprezintă o aglomerare mică.

5. Raportaţi rezultatele ca media totalului numărării celor


60 de celule pentru a obţine un diagnostic fie al
amplificării, fie al neamplificării.
Tehnici speciale de laborator

Metode cromatografice

Formator: CS III dr. Anca CHISOI


Cromatografia reprezintă un set de metode analitice care s-au
dezvoltat iniţial ca şi tehnici de separare de compusi foarte
asemenatori din amestecuri complexe.
În toate variantele, separarea precede analiza (calitativă şi
cantitativă a compuşilor separaţi)

Separarea se realizează prin repetarea, de un număr mare de


ori, a echilibrului de distribuţie între două faze :
– fază staţionară (fixa) - aflata într-un tub ( numit coloană) sau in
plan
– faza mobilă (eluent) - aflată în mişcare, se deplasează prin
golurile primei faze.

http://www.slideshare.net/hussain_761/theories-of-
chromatography
Tipuri de metode cromatografice in functie de natura
fazelor
•Cromatografie de gaze
– Gaz-lichid (GLC)
– Gaz-solid (GSC)
•Cromatografie de lichide
– Lichid-lichid (LLC)
Clasificarea
– Lichid-solid
în(LSC)
functie de configuratia sistemului
cromatografic
1. Cromatografie pe coloana - faza fixa este depusa intr-o
coloana verticala
– Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura)
– Cromatografie pe coloane capilare
2. Cromatografie planara - faza fixa este depusa pe o
suprafata plana
– Cromatografie în strat subtire
– Cromatografie pe hartie
Procedeele cromatografice includ următoarele faze, indiferent de
tipul metodei:

1. prepararea fazei staţionare (pe placa) - pentru metode


manuale, in metodele automate faza stationara este cuprinsa in
constructia coloanei cromatografice, ca parte componenta a
sistemului cromatografic
2. introducerea probei in fluxul fazei mobile
3. trecerea probei (dizolvata sau sub forma de gaz/ lichid) peste
faza staţionară
4. separarea componentelor pe faza stationara
5. colectarea componenţilor amestecului prin eluare (preluare) cu
solventi (gaz sau lichid) potriviti
6. analiza calitativă si/sau cantitativa

Schema bloc pentru gaz cromatograf


Metoda gaz cromatografică/ Gas chromatography (GC)
Principiul metodei
•Substanţa sau amestecul de substanţe ce
trebuie determinate sunt trecute prin injectare, într-o
coloană ce conţine o fază staţionară (fixa) şi unde se
încălzesc la o anumită temperatură, trec in faza
gazoasa si se retin in mod selectiv de catre faza fixa.

•Concomitent prin coloană se trece un gaz care


reprezintă faza mobilă şi care va elua componentele
amestecului

•la ieşirea din coloană este amplasat un detector


care înregistrează apariţia substanţelor sub forma
unor picuri ce formează cromatograma.
In gaz cromatografie separarea particulelor analizate se
face pe baza dimensiunilor lor.
Pentru identificarea analitului, la iesirea din coloana de
gaz, cromatograful poate fi cuplat cu un spectrometru de
masa sau cu un spectrometru in infrarosu (detectorul)

Faza mobilă este reprezentata de un gaz: hidrogenul,


heliul, azotul sau argonul

Faza fixa / stationara din punct de vedere al starii de


agregare poate fi:
• Solid : silicagel, alumină
• Lichid (adsorbit pe substrat solid)
Coloane cromatografice
• coloane cu umplutură
• coloane capilare

Introducerea probelor in coloana de cromatografie se face prin


intermediul unei microseringi, volumul probei fiind între 1 şi 5 µl la
coloanele cu umplutură şi de 0,1 până la 2 µl la cele capilare.

Microseringa poarta numele de injector si in functie de natura


probei poate fi:
1.Pentru probe gazoase: head space
2. Pentru probe lichide:
•injector cu splitare
•cu injectie directa in coloana
3. Pentru probe solide:
•cuptor de evaporare in gazul purtator
•cu desorbtia probelor de pe coloanele de microreactie/ SPME
(solide phase microextraction)
Detectorul este un dispozitiv electronic care are rolul sa
transforme in semnal electric prezenta moleculelor in spatiul
acestuia.

Detectori pentru gaz cromatografie


•detector pentru determinari calitative
•detector pentru determinari cantitative si calitative

Analiza cromatografica
• Analiza calitativa – pe baza compararii timpilor de retentie
inregistrati pentru compusii din proba si pentru etaloane
cunoscute
• Analiza cantitativa – se calculeaza pe baza ariei cuprinse sub
fiecare pic cromatografic (sau inaltimea picului) care este
proporţională cu concentraţia compusului respectiv

Prin gaz cromatografie pot fi analizate toate amestecurile de


lichide, gaze sau solide care pot fi trecute, sau exista, in stare
gazoasa si care nu se descompun la incalzire in alte specii
da cromatografiei de lichide/ Liquid chromatography (
Termenul de cromatografie de lichide se refera la o gama
extinsa de sisteme cromatografice care au în comun faptul ca
utilizeaza o faza mobila lichida.

Cromatografia in care faza mobila este un lichid poarta numele


de cromatografie de inalta performalnta sau lichid
cromatografie de inalta presiune ( HPLC).
HPLC se configureaza de catre utilizator pentru a raspunde
cerintelor aplicatiilor specific activitatii analizate. Fiecare
element component al sistemului de HPLC poate avea structuri
complet diferite, atat functional cat si privitor la materialele din
care sunt confectionate.

Avantaje ale lichid cromatografiei (comparativ cu gaz


cromatografia)
- permite analiza probelor greu volatile sau instabile termic
- faza mobila participa activ la separare, oferind posibilitati
Principiul metodei
1. Substanţa sau amestecul de substanţe ce trebuie
determinate sunt trecute prin injectare, într-o coloană ce
conţine o fază staţionară (fixa) şi unde se încălzesc la o
anumită temperatură, trec in faza lichida si se retin in mod
selectiv de catre faza fixa.
2. Concomitent prin coloană se trece un lichid care reprezintă
faza mobilă şi care va elua componentele amestecului
3. la ieşirea din coloană este amplasat un detector care
înregistrează apariţia substanţelor sub forma unor picuri ce
formează cromatograma.

In lichid cromatografie separarea particulelor analizate se face


pe baza polaritatii lor, pe baza dimensiunilor particulelor, a
bioafinitatii sau a izomerilor optici.

Pentru identificarea analitului, la iesirea din coloana lichid


cromatografului, se poate cupla cu un spectrometru de masa
sau cu un spectrometru in infrarosu (detectorul)
Coloane cromatografice
http://people.whitman.edu/~dunnivfm/C_MS_Ebook/CH2/Figures/Fig_2_11
_Columns.jpg

• coloane cu umplutură
• coloane capilare

Detectoare utilizate în lichid cromatografie


- Detectoare care masoara modificarea unei proprietati fizice a
efluentului coloanei
- Detectoare care masoara modificarea unei proprietati a solutului

Analiza cromatografica in lichid cromatografie


• Analiza calitativa – pe baza compararii timpilor de retentie inregistrati
pentru compusii din proba si pentru etaloane cunoscute
• Analiza cantitativa – pe baza compararii ariilor pentru compusii
identificati pozitiv din proba cu aria unor etaloane de concentratii
cunoscute
Cromatografia in strat subtire CSS / Thin Layer
Principiul metodei:
Chromatography TLC
Separarea se bazeaza pe distributia componentelor probei intre doua faze:
– Faza fixa – strat subtire de material solid depus pe un suport plan
– Faza mobila – lichida (singular sau amestecuri)

Faza fixa poate fi reprezentata de : silicagel , oxid de aluminiu, kieselgur


Faza mobila este reprezentata de amestecuri de solventi in proportii si
concentratii variabile

Avantaje :
• Rapiditate
• Cost redus
• Aplicabilitate la compuşi care prezintă instabilitate termică, atât
hidrosolubili cât şi liposolubili
• Posibilitatea analizării simultane a mai multor probe
• Reproductibilitatea rezultatelor

Dezavantaje:
• Sensibilitate mai mică decât în cromatografia de gaz sau lichid
• Necesitatea unei purificări mai avansate
• Repetabilitate scăzută în cazul unor temperaturi sau umidităţi
ambientale ridicate
Mod de lucru
Se folosesc plăci de sticlă de diferite dimensiuni, (pana la 20 x
20 cm) pe care se depune un strat uniform de absorbant cu
grosime de aproximativ 250 µm (faza staţionară) .

1. Spotare - la o distanţă de circa 1,5 cm de marginea plăcii se


aplică o cantitate foarte mică de amestec al substanţelor ce
urmează a fi separate cu ajutorul unei microseringi

2. Developare: se imersează placa într-un vas cu închidere


etanşă în care atmosfera este saturată de vapori ai solventului
sau ai amestecului de solvenţi utilizaţi pentru separare (faza
mobilă).
- In acest mod are loc un proces de migrare al componenţilor
fazei mobile printre particolele fazei staţionare.
- Componentele amestecului migrează diferit, în funcţie de
modul lor de distribuţie între cele două faze

3. Atunci când frontul developantului ajunge la extremitatea


plăcii, aceasta se scoate, se usucă şi se trece la faza de
identificare
Indiferent de metoda de realizare a analizei cromatografice,
rezultatul analizei este reprezentat de cromatograma.
Cromatograma este un grafic in care sunt reprezentate
abundenta substantei analizate si marimea moleculei prin
viteza sa de deplasare.

Cromatograma obtinuta prin tehnica gaz/ lichid cromatografiei


Cromatograma prin tehnica cromatografiei pe hartie/ in stat subti

http://blog.restek.com/wp-content/uploads/2011/08/Chro-1.jpg http://www.botanicalauthentication.or g/index.php/Cannabis_spp._%28pistillate_in


florescence_and_leaf%29''
plicatii ale metodelor cromatografice

Cromatografia pe hartie are aplicatii in determinarea calitativa de


aminoacizi, aditivi alimentari.

Cromatografia in strat subtire are aplicatii in identificarea


componentelor alimentare de tip carotenoide, vitamine; a
contaminantilor alimentari de tip medicamente, pesticide; a
aditivilor alimentari ca conservanti, coloranti.

Dintre numeroasele aplicatii ale tehnicii de gaz cromatografie,


fac parte si cele in domeniul separarii si
identificarii hidrocarburilor, de mare importanta fiind analiza
aromaticelor policiclice din mediul ambiant stiuta fiind actiunea
cancerigena a acestora. Din domeniul biomedical amintim
separarile de aminoacizi, peptide, prostaglandine, glucide,
steroide.
Gaz cromatografia identifica componente ale alimentelor - grasimi,
acizi grasi, arome; contaminanti alimentari organoclorurati,
hidrocarburi policicilice, dioxine, furani, acrilamida sau medicamente.

Un domeniu de aplicatie de cea mai mare importanta este cel al poluarii
mediului, unde gaz cromatografia este folosita frecvent in analiza
calitativa si cantitativa a poluantilor prezenti in aer, ape, sol.

Lichid cromatografia identifica componente alimentare - glucide,


aminoacizi, vitamine sau contaminanti alimentari - micotoxine. Alte
aplicatii ale lichid cromatografiei sunt in farmacocinetica si
bioanaliza.

Proteomica este o alta zona in care lichid cromatografia are aplicatii


mai ales in identificarea digestiei si denaturarii proteazice. In
cercetarea farmaceutica lichid cromatografia are aplicatii in
caracterizarea peptidelor, glicoproteinelor; in identificarea
metabolitilorm sau a impuritatilor; in screening-ul in vivo si
screening-ul bioafinitatii.
Tehnici speciale de labortor
-
Citometria in flux/ Flux citometria/
Flowcitometria

Formator: CS III dr. Anca CHISOI


Flux citometria/ Flowcitometria este o tehnologie prin care se pot
masura si ulterior analiza anumite proprietati fizice si chimice (indirect)
ale particulelor ce trec in flux, in mod individual, prin dreptul unui
punct de interogare (un fascicul laser).

In cadrul fluxului de lucru este necesara realizarea unor suspensii ale


particulelor analizate.
Flowcitometria nu poate furniza informatii privind structura tesuturilor.

Parametrii analizati
- Parametrii de dispersie a luminii – in functie de unghiul de dispersie
se calculeaza marimi legate de dimensiunile si granularitatea
particulei analizate
- Parametrii de fluorescenta - in urma marcarii particulelor cu
fluorocromi ce se leaga specific de molecule interne sau externe ale
particulei.

http://s2.postimg.org/hf91gzt6h/flow2.png
Componentele sistemului de citometrie in flux

•Componenta fluidica – asigura transportul ordonat, in


flux constant, al particulelor prin dreptul razei laser.
Dimensiunile particulelor ce pot fi analizate prin flowcitometrie
este de maxim 150 microni.

•Componenta optica – realizeaza iluminarea particulelor


din fluxul lichid sau gazos prin una sau mai multe raze laser,
precum si filtrarea, directionarea, amplificarea si colectarea
radiatiei luminoase prin intermediul unui sistem de filtre, oglinzi
si fotomultiplicatori.

•Componenta electronica – are in principal functia de a


transforma semnalele luminoase in semnal analogic si ulterior in
semnale electrice ce apoi sunt procesate de un computer.
Fluorocromii utilizati in flowcitometrie

Fluorocromii sunt molecule (organice in marea lor


majoritate) capabile de a absorbi lumina si a produce
fluorescenta.

Fluorocromi
 cu legare covalenta de sonde proteice (anticorpi,

hormoni, streptavidina) sau nucleice


 cu legare non-covalenta de structuri celulare

 proteine fluorescente
Etapele analizei prin flowcitometrie/ citometrie
de flux

1. Prepararea suspensiei de particule – separa particulele


de analizat in asa fel incat sa poata trece individual prin dreptul
laserelor.
Poate include - liza eritrocitelor pentru analiza leucocitelor
- separarea in gradient de densitate
- liza enzimatica sau mecanica pentru tesuturi

2. Citirea probelor dupa introducerea in flowcitometru –


injectarea probei in sistemul de citometrie in flux, colectarea si
inregistrarea parametrilor de dispersie si /sau fluorescenta
pentru particulele separate corespunzator in faza anterioara

3. Marcarea particulelor – concomitenta cu citirea probelor,


evidentiaza elementele organice intracelulare sau membranare
prin intermediul fluorocromilor.
4. Prelucrarea si exportul datelor obtinute – cuprinde
clasarea populatiilor celulare identificate in functie de
parametrii definiti de utilizator si calculul indicilor statistici
ce caracterizeaza subpopulatiile definite.

5. Analiza si interpretarea datelor – etapa finala ce


cuprinde extragerea parametrilor statistici si a
semnificatiei lor biologice. Rezultatele procesarii datelor
pot fi prezentate sub forma unor parametrii statistici,
precum mediana, media aritmetica, media geometrica,
procent , abatere standard, coeficient de variatie.
Datele obtinute din analiza flowcitometrica se
reprezinta prin histograme sau citograme.
Citogramele sunt histograme in mai multe
dimensiuni.
Histograme Citograme

http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n11/images/nprot.201 http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.200
3.131-F6.jpg 8.77-F1.jpg
Aplicatii ale citometriei de flux
- Analiza AND (sinteza/degradare, determinarea gradului de
ploidie, analiza ciclului celular)
- Imunofenotipare cu aplicatie in leucemiile acute si
limfoproliferari maligne, detectia bolii reziduale minime,
subpopulatii limfocitare T
- Monitorizarea infectiei cu virusul HIV
- Determinarea receptorilor de suprafata
- Cuantificarea anticorpilor antitrombocitari
- Analiza moleculelor de adeziune
- Analiza celulelor stem hematopoietice
- Sortare de particule/celule
- Analiza fluxurilor ionice, a metbolismului oxidative si a
modificarilor de pH
- Detectia de celule tumorale circulante
- Detectia antigenului carcinoembrionar
- Determinarea hemoglobinei fetale
- Teste de fagocitoza
- Teste referitoare la proliferarea celulara
Bibliografie
Covic M, Ştefănescu D, Sandovici I (sub redacţia), (2011), Tratat de genetică medicală , Ediția
II, Polirom, Iaşi
Jean-Louis Serre, (2006), Diagnostic Techniques in Genetics, John Wiley&Sons Ltd., England
Gavrila L., (2003), Genomica, Editura Enciclopedica, Bucuresti
Liang Cheng, David Y Zhang, (2008), Molecular Genetic Pathology, Humana Press
Nicholas C Dracopoli, Jonathan L. Haines, Bruce R. Korf & al., (2004), Short Protocol in
Human Genetics, Wiley
ZytoDot SPEC ERBB2 – Protocol - https://www.zytovision.com/products/zytodot2c/c-3018
FISH Probes from Cytocell – DNA Screening Solution – http://www.cytocell-us.com/
Mihai Ionica, Sisteme de gaz si lichid cromatografie cuplate cu spectrometrie de masa - curs de
pregatire profesionala, Spitalul Clinic de Urgenta Bucuresti, Centrul de Cercetari Stiintifice
Medico-Militare, Universitatea "Politehnica" Bucuresti, 2016
http://www.scrigroup.com/sanatate/sport/UTILIZAREA-GAZCROMATOGRAFIEI-
I11593.php
http://documents.tips/documents/cursul-12-13-metode-cromatograficepdf.html
Radu-Ionut Huica, Mihaela Surcel, Adriana Narcisa Munteanu, Cornel Ursaciuc, Mihaela Zlei,
Florin Zugun-Eloae, Eugen Casasevici, Citometrie in flux, principii si aplicatii clinice; ISBN
978-973-160-076-5, ed. Viata Medicala Romaneasca, Bucuresti, 2013