Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi – 2012 – vol. 116, nr.

FARMACIE ARTICOLE ORIGINALE

DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE GC – MS

PENTRU DETERMINAREA NICOTINEI DIN TUTUN

Doina Şpaiuc1, A. F. Şpac 2*, Luminiţa Agoroaei3, V. Dorneanu 4, Elena Butnaru 3

1. Doctorand al Universităţii de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa“ - Iaşi,
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa“ - Iaşi
Facultatea de Farmacie
2. Disciplina de Chimie Fizică
3. Disciplina de Toxicologie
4. Disciplina de Chimie Analitică

THE DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A GC – MS METHOD FOR NICOTINE

DETERMINATION FROM TOBACCO (Abstract): A gas chromatographic - mass spectromet-
ric method (GC/MS) for determination of nicotine from tobacco products was developed and
validated. Material and method: It was used an Agilent Technologies 7890A Chromatograph
equipped with a DB 5 MS column (30 m x 0.25 mm, 0.25 µm) and Agilent Technologies
5975C inert MSD detector. The temperature program began from 100˚C and increase with
10˚C/min to 190˚C than with 20˚C/min to 280˚C, constant for 5 min, with He as carrier gas (1
ml/min) and MS detection. The temperature of the source was 230˚C and the temperature of the
quadrupole was 150˚C. The parameters of validation were studied according to the internation-
al requirements. Results: Finally, the method established has following parameters: is linear in
the 1.01-201.8 µg/ml range, has the detection limit of 3.6 µg/ml, the quantification limit of
10.8 µg/ml, is precise (RSD  5%, n=9) and accurate (mean recovery is 100.28% in 99.08 –
100.96 µg/ml range). Conclusion: The method can be used to determine nicotine from tobacco
products, with good results. Key words: NICOTINE, GC-MS, VALIDATION

Nicotina este principalul alcaloid extras
din frunzele de tutun, Nicotiana tabacum,
familia Solanaceae. Tutunul uscat din care
se obţin ţigaretele, ţigările de foi şi tutunul
de pipă, are o compoziţie chimică comple-
xă, conţinând nicotină, alături de alţi alca-
loizi secundari, acizi organici, hidraţi de
carbon, rezine, uleiuri eterice, enzime, alţi
compuşi. Ţigareta se poate asemăna cu o
retortă chimică, fumul de tutun rezultat din
arderea unei ţigarete conţinând 4.000 de
compuşi, dintre care peste 60 de substanţe
au potenţial cancerigen.
Consumul cronic de tutun, respectiv ta-
bagismul sau nicotinismul, considerat prima
cauză de mortalitate prematură şi morbidita-
te evitabilă, a atins astăzi amploarea unei
“epidemii mondiale“, deoarece, conform
statisticilor OMS, numărul fumătorilor la
scară planetară se cifrează la aproximativ
1,1 miliarde. În ultimele decenii, tutunul nu
mai este considerat un produs care dăunează
sănătăţii, ci ca un produs care curmă viaţa.
Statistic, după OMS, tabagismul produce la
nivel mondial, în fiecare oră, 560 de decese
(134.000 pe zi; 4,9 milioane pe an) (1).
Tabagismul poate fi definit ca un compor-
tament susţinut de o dependenţă farmacolo-

611
 Doina Şpaiuc et al.
gică faţă de nicotină, intoxicaţia tabagică
fiind cea mai răspândită dintre toate toxico-
maniile cunoscute în prezent. Fumatul re-
prezintă una din cele mai grave şi complexe
probleme de sănătate publică, prin efectele
provocate asupra organismului.
Nicotina, responsabilă de dependenţa ta-
bagică, acţionează asemănător acidului ci-
anhidric, absorbţia sa fiind foarte rapidă la
nivelul tuturor mucoaselor. Doza letală la
om este de 60 mg. Produce dependenţă de 6-
8 ori mai mare decât alcoolul, dar la fel de
mare ca şi cocaina, 95-100% dintre fumători
fiind dependenţi. Acţiunea toxică a nicotinei
se manifestă la nivelul sistemului nervos
central, la nivelul aparatului cardiovascular,
respirator, tubului digestiv; afectează meta-
bolismul glucidic, lipidic, proteic (2).
În lucrarea de faţă ne-am propus elabo-
rarea şi validarea unei metode simple şi
rapide de determinare, prin cromatografie
de gaze cuplată cu spectrometria de masă
(GC – MS), a nicotinei din tutun.
MATERIAL ŞI METODĂ
Reactivi şi aparatură. S-a utilizat un
cromatograf de gaze Agilent Technologies
7890 A, injector Agilent Technologies 7683
B Series şi detector spectrometru de masă
Agilent Technologies 5975C inert MSD.
Reactivii utilizaţi (metanol şi diclorme-
tan) sunt de puritate cromatografică, iar
etalonul de nicotină a fost procurat de la
firma Merck (densitate 1,009 g/ml). Soluţia
stoc de nicotină, de concentraţie de 200
g/ml, a fost preparată în amestec metanol
/ diclormetan (1/1, v/v).
Condiţii cromatografice. Analiza a
fost efectuată pe o coloană capilară DB 5
MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm) cu o fază
mobilă formată din heliu (debit 1 ml/min);
temperatura injectorului = 250C, tempera-
tura sursei MSD = 230C, temperatura
cvadrupolului = 150C, gradient de tempe-
612
ratură în compartimentul coloanei
(10C/min între 100 - 190C, 20C/min
între 190 - 280C, constant 5 min); volumul
injectat = 0,3 l în modul SPLIT (1 / 10).
Achiziţia s-a efectuat în modul SCAN (10 –
450 UAM). Soft utilizat: Chemstation,
Agilent Techologies.
Soluţii standard. Soluţiile standard de
nicotină au fost preparate în amestec meta-
nol / diclormetan (1/1, v/v), în domeniul de
concentraţie 1,01 – 201,8 g/ml.
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Identificarea nicotinei din probele ana-
lizate s-a realizat pe baza comparării tim-
pului de retenţie şi al spectrului de masă
înregistrat în vârful acestuia, din croma-
tograma probelor, cu timpul de retenţie al
picului corespunzător nicotinei din croma-
tograma unei soluţii standard conţinând
nicotină, şi cu spectrele de masă din biblio-
teca spectrală Willey (3).
Validarea metodei. Pentru validarea
metodei de determinare a nicotinei prin
cromatografie de gaze cuplată cu spectro-
metrie de masă, au fost urmăriţi următorii
parametri: liniaritatea, limita de detecţie,
limita de cuantificare, precizia (precizia
sistemului, precizia metodei, precizia in-
termediară) şi exactitatea. Toate testele de
validare au fost efectuate în conformitate
cu cerinţele internaţionale în vigoare (4-9).
Liniaritatea. Pentru studiul liniarităţii,
pornind de la soluţia stoc de nicotină
(201,8 g/ml) au fost preparate un număr
de 3 seturi de soluţii de lucru, în domeniul
de concentraţie 1,01 – 201,80 g/ml. Pen-
tru fiecare soluţie în parte s-au efectuat
analizele în conformitate cu modul descris,
s-au înregistrat cromatogramele şi s-au
calculat ariile picurilor corespunzătoare
nicotinei. Valoarea medie calculată (tab. I)
s-a reprezentat grafic în funcţie de concen-
traţie (fig. 1).
 Dezvoltarea şi validarea unei metode GC – MS pentru determinarea nicotinei din tutun

TABELUL I
Ariile picurilor obţinute în cazul studiului liniarităţii
metodei de determinare a nicotinei prin GC-MS
Nr. Nicotină Arie pic
det. g/ml I II III Medie
1 1,01 8222266 8222243 8310784 8251764
2 2,02 8532264 8515113 8467305 8504894
3 5,05 9250301 9260584 9256597 9255827
4 10,09 10635143 10680832 10535786 10617254
5 15,14 11735280 11876283 11901127 11837563
6 20,18 13045078 13173306 13114807 13111064
7 30,27 15723175 15805883 15638440 15722499
8 40,36 18302348 18295130 18113730 18237069
9 50,45 20715903 20773050 20760442 20749798
10 60,54 23529690 23284476 23285925 23366697
11 70,63 25925125 25749226 25718447 25797599
12 80,72 28669167 28444229 28703648 28605681
13 90,81 31154353 31182582 30995956 31110964
14 100,9 33635114 33459437 33430843 33508465
15 110,99 36018603 36200992 36032968 36084188
16 121,08 38542738 38734483 38581342 38619521
17 131,17 41375240 41382384 41353258 41370294
18 141,26 43827881 43854923 43975547 43886117
19 161,44 49308802 49420389 49437142 49388778
20 181,62 53061887 53404152 53520378 53328806
21 201,8 58426340 58034957 58094618 58185305

Fig. 1. Dreapta de calibrare pentru determinarea nicotinei prin GC-MS

S-a calculat ecuaţia şi eroarea standard de regresie (R2). Astfel, ecuaţia dreptei de
a dreptei de regresie, precum şi coeficientul calibrare este:
Arie pic = 251535,6 x Concentraţia (g/ml) + 8102784

613
 Doina Şpaiuc et al.

Valorile calculate pentru eroarea stan- liniară pe domeniul de concentraţie studiat.

dard a dreptei de regresie (SE) este Folosind parametrii statistici calculaţi
271159,5, iar pentru coeficientul de regre- (eroarea standard şi panta dreptei de regre-
sie (r2 ) este 0,9997. sie), s-au calculat limita de detecţie (LD) şi
Din datele prezentate rezultă că metoda limita de cuantificare (LQ), utilizând relaţi-
de determinare a nicotinei prin GC-MS este ile:
3,3  SE 3,3  271159,5 10  SE 10 271159, 5
LD    3, 6 g / mL LQ    10,8 g / mL
Panta 251535, 6 ; Panta 251535, 6

Precizia. Pentru determinarea preciziei,

s-au studiat precizia sistemului, precizia TABELUL II
metodei şi precizia intermediară. Precizia sistemului
Pentru determinarea preciziei sistemului (repetabilitatea injecţiei)
sau a repetabilităţii injecţiei, aceeaşi soluţie Nr. determinării Arie pic
conţinând nicotină, în concentraţie de 100,9 1 33776882
g/ml, a fost analizată de 10 ori, în aceleaşi 2 33596284
condiţii de operare. Rezultatele experimen- 3 33635053
tale şi calculul statistic s-a realizat pe baza 4 33475707
deviaţiei standard – SD şi a deviaţiei stan-
5 33476349
dard relativă – RSD % (tab. II).
6 33775885
Pentru determinarea preciziei metodei,
s-au efectuat câte trei determinări pe soluţii 7 33609431
diferite, aflate la trei nivele de concentraţie 8 33421825
(100 g/ml  30%). Pentru toate cele nouă 9 33538452
cromatograme obţinute, s-a calculat aria 10 33404652
picului corespunzător nicotinei şi (pe baza Media 33571052
ecuaţiei dreptei de regresie) concentraţia SD 126336,1
reală din probă (tab. III). RSD 0,3763%

TABELUL III
Precizia metodei pentru determinarea nicotinei prin GC-MS
Nr. Concentraţie teoretică Concentraţie calculată
Arie pic %
det. (g/ml) (g/ml)
1 25765760 70,22 99,42
2 70,63 25846522 70,54 99,87
3 25787033 70,31 99,54
4 33735374 101,90 101,00
5 100,90 33565101 101,23 100,32
6 33740976 101,93 101,02
7 41317675 132,05 100,67
8 131,17 41426286 132,48 101,00
9 41413721 132,43 100,96
Media (%) 100,42
Date statistice SD 0,6590
RSD (%) 0,6562

614
 Dezvoltarea şi validarea unei metode GC – MS pentru determinarea nicotinei din tutun

Pentru determinarea preciziei interme- cele nouă cromatograme obţinute, s-a cal-
diare, s-au efectuat câte trei determinări pe culat aria picului corespunzător nicotinei şi
soluţii diferite aflate la trei nivele de con- (pe baza ecuaţiei dreptei de regresie) con-
centraţie (100 g/ml  30%). Pentru toate centraţia reală din probă (tab. IV).

TABELUL IV
Precizia intermediară pentru determinarea nicotinei prin GC-MS
Nr. Concentraţie teoretică Concentraţie calculată
Arie pic %
det. (g/ml) (g/ml)
1 25764109 70,21 99,41
2 70,63 25732428 70,09 99,23
3 25939261 70,91 100,40
4 33456945 100,80 99,90
5 100,90 33752212 101,97 101,06
6 33574085 101,26 100,36
7 41414853 132,43 100,96
8 131,17 41432299 132,50 101,02
9 41426742 132,48 101,00
Media (%) 100,37
Date statistice SD 0,7147
RSD (%) 0,7121

În urma prelucrării statistice a datelor terminări prin metoda adausului de soluţii

experimentale obţinute (tabelele II, III, IV),
se constată că valorile RSD sunt mult mai
mici decât limita maximă admisă de 5%, de
unde rezultă că metoda de determinare a
nicotinei prin GC – MS este precisă.
Exactitatea. Pentru determinarea exac-
tităţii metodei, s-au efectuat câte trei de-
diferite aflate la trei nivele de concentraţie
(100 g/ml  30%). Pentru toate cele nouă
cromatograme obţinute, s-a calculat aria
picului corespunzător nicotinei şi (pe baza
ecuaţiei dreptei de regresie) concentraţia
reală din probă. S-a calculat regăsirea me-
die, minimă şi maximă (tab. V).

TABELUL V
Exactitatea metodei de determinare a nicotinei prin GC-MS
Nr. Concentraţie teoretică Concentraţie calculată Regăsire
Arie pic
det. (g/ml) (g/ml) (%)
1 25705694 69,98 99,08
2 70,63 25814063 70,41 99,69
3 25777616 70,27 99,49
4 33715665 101,83 100,92
5 100,90 33663327 101,62 100,71
6 33497876 100,96 100,06
7 41403480 132,39 100,93
8 131,17 41413616 132,43 100,96
9 41329236 132,09 100,70
Regăsire medie 100,28
Date statistice Minim 99,08
Maxim 100,96

615
 Doina Şpaiuc et al.

Din datele experimentale obţinute, s-a
constatat că valorile medii (100,28%) se
încadrează în limitele admise ( 5÷10%),
ceea ce confirmă că metoda de determinare
a nicotinei prin GC – MS este exactă.
Pentru aplicarea în practică a metodei
dezvoltate şi validate, s-au preparat probe
de tutun provenind din ţigări aflate în re-
ţeaua comercială a municipiului Iaşi
(Marlboro şi Kent). Astfel, nicotina a fost
extrasă din tutun, cu amestec metanol /
diclormetan (1/1, v/v), şi determinată prin
GC – MS, în condiţiile metodei. Din datele
experimentale obţinute, s-a constatat faptul
că, în probele de tutun analizate, cantitatea
de nicotină este în limitele specificate.
CONCLUZII
Constatările noastre au permis elabora-
rea şi validarea unei metode de determina-
re cantitativă a nicotinei prin GC-MS,
stabilindu-se condiţiile de lucru: coloană
cromatografică, regimuri termice, cantita-
tea de probă analizată, modul de identifi-
care a nicotinei, liniaritatea dreptei de
calibrare, limita de detecţie, limita de
cuantificare, precizia (precizia sistemului,
precizia metodei, precizia intermediară) şi
exactitatea. Rezultatele experimentale ob-
ţinute arată că metoda este liniară (r 2 =
0,9997) pe domeniul de concentraţii studi-
at (1 – 200 g/ml), este sensibilă (LD =
3,6 g/ml, LQ = 10,8 g/ml), precisă
(RSD  5%, n = 9) şi exactă (regăsire
medie = 100,28%). Metoda a fost aplicată
cu rezultate bune pentru determinarea ni-
cotinei din tutunul utilizat la prepararea ţi-
gărilor comerciale.

BIBLIOGRAFIE

1. Didilescu C, Marica C, Didilescu A. Fumatul sau drumul de la sănătate la boală. Iaşi: Editura Dan,
2006.
2. Butnaru E, Proca M. Toxicologie, vol. II. Iaşi: Editura Timpul, 2001.
3. *** G4350-90020 7820 Gas Chromatograph Advanced User Guide. USA: Agilent Technologies,
2009.
4. Grob RL, Barry EF. Modern Practice of Gas Chromatography. 4th Edition, New Jersey: John Wiley
& Sons, 2004.
5. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R. Validarea metodelor de analiză şi control. Bucureşti: Ed. Medica-
lă, 1998.
6. Jaba E. Statistica. Bucureşti: Editura Economică, 1998.
7. *** Reviewer guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for Drug Evaluation and
Research (CDER), FDA, USA, 1994.
8. *** Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation, FDA, USA,
1987.
9. Oprean R, Rozet E, Dewé W, Boulanger B, Hubert Ph. Ghid de validare a procedurilor analitice
cantitative. Cluj-Napoca: Editura Medicală Universitară “Iuliu Haţieganu”, 2007.

616