Biotehnologii medicale

Distrugerea celulelor microbiene

Prof. Univ. Dr. Anca Galaction

anca.galaction@umfiasi.ro
Alegerea tehnicii de separare
Criterii:

• localizarea produsului: intracelular sau extracelular;

• concentrația finală a produsului ȋn lichid;
• caracteristicile fizico-chimice ale produsului;
• utilizarea produsului, respectiv condițiile de puritate impuse;
• natura impurităților din mediul de cultură;
• costul etapei de separare.
Localizarea produsului
Dacă produsul este intracelular și nu poate difuza prin membrana celulară,
este necesară distrugerea acesteia, prin metode adecvate, pentru
eliberarea produsului, care apoi se separă din soluția rezultată prin diferite
tehnici: extracție, schimb ionic, cromatografie, precipitare, distilare, tehnici
membranare.
In anumite cazuri, atât pentru facilitarea eliberării conținutului intracelular,
cât și pentru ușurarea separării ulterioare a produsului util, se pot aplica o
serie de metode:
• efectuarea unui tratament chimic (modificarea pH-ului, utilizarea unor
agenți de floculare, a unor electroliți etc.) sau fizic (utilizarea căldurii)
pentru a se favoriza distrugerea membranelor celulare;
• utilizarea unor enzime specifice pentru a se distruge pereții celulari;
• utilizarea ȋn procesul de fermentație a unor mutanți capabili fie să
reducă sau să elimine formarea unor compuși secundari care ar putea
influența negativ performanța separării, fie să blocheze formarea
membranelor celulare, facilitând astfel difuzia produsului util ȋn mediul
de fermentație;
• modificarea condițiilor de fermentație, pentru obținerea aceluiași efect
menționat mai sus.
Tehnicile de distrugere a membranelor celulelor microbiene

Sunt determinate de:

• forma și dimensiunea celulelor
• structura pereților celulari
• compoziția lichidului intracelular.

Forma și rezistența membranelor celulelor microbiene depind de:

• natura componenților macromoleculari din care sunt alcătuite
• de gradul de realizare a unor legături dintre aceștia și alți
componenți ai peretelui.
Distrugerea celulelor microbiene
a. Metode mecanice b. Metode nemecanice:
- ȋn fază lichidă - uscare
• uscare cu aer
• cu ultrasunete • uscare sub vid
• liofilizare
• prin agitare mecanică
• uscare cu solvenți
• la presiuni ridicate - liză fizică
• șoc osmotic
- ȋn fază solidă
• ȋnghețare/dezghețare
• prin măcinare • șocuri de presiune
- liză chimică
• prin presare • cu substanțe tensioactive
• cu antibiotice
• cu acizi, baze, săruri, esteri etc.
• enzimatică : cu lizozime.
a. Distrugerea mecanică a
membranelor celulelor microbiene
Metodele mecanice de distrugere a biomasei sunt cele mai
utilizate, deoarece oferă posibilitatea prelucrării rapide a unor
cantități mari de biomasă, cu eficiență sporită.
- Principiul general: supunerea celulelor la tensiuni de forfecare
ridicate, create de o presiune ridicată, de o agitare mecanică
intensă sau cu ajutorul ultrasunetelor.
- Caracteristica acestor metode: necesitatea răcirii amestecului
prelucrat, pentru preluarea căldurii excesive generate de
disiparea unei părți din energia mecanică introdusă ȋn sistem.

1. Cu ultrasunete
2. Tehnica presiunilor ȋnalte
3. Agitarea mecanică
1. Cu ultrasunete
Una dintre cele mai folosite metode la nivel de laborator și pilot
este, ȋn general cu frecvențe de 15-25 kHz. Distrugerea celulelor
microbiene este cauzată de tensiunile de forfecare dezvoltate de
vârtejurile (turbioanele) create de unda de șoc. In timpul
procesului, suspensia de biomasă este răcită cu gheață sau cu un
alt agent de răcire care circulă prin mantaua vasului respectiv.

Deși metoda poate fi utilizată ȋn regim continuu, nu poate fi

aplicată la scară industrială, datorită consumurilor energetice
ridicate și a posibilelor denaturări ale biopolimerilor (proteine,
enzime) pe care le produc ultrasunetele.
2. Tehnica presiunilor ȋnalte

Suspensia de biomasă, conținută ȋntr-un cilindru de oțel, este

trecută, sub o presiune de circa 50 - 200 MPa, creată cu ajutorul
unui piston, printr-o valvă cu un orificiu ȋngust (1) (figura 1.1).
Valva este prevăzută cu un dispozitiv alcătuit dintr-un piston (2)
și un resort (3) care menține constantă presiunea cu care
suspensia este ȋmpinsă prin orificiu.

biomasa

Figura 1.1. Dispozitiv de distrugere a celulelor microbiene la presiune ridicată

Gradul de distrugere este influențat, ȋn principal,
de temperatură, concentrația drojdiei și presiune
In funcție de tipul celulelor microbiene și de condițiile de operare (presiuni extrem de ridicate), este
posibilă distrugerea aproape completă a biomasei la o singură trecere a suspensiei prin aparat. Astfel,
gradul de distrugere pentru Saccharomyces cerevisiae a fost 100% pentru P = 175 MPa. Influența
presiunii asupra distrugerii microorganismelor este mai pronunțată ȋn domeniul valorilor sub 70 MPa,
peste acest nivel eficiența procesului crescând lent cu presiunea.
• Există posibilitatea ca același microorganism să elibereze diferite enzime și proteine la treceri
succesive prin dispozitivul de distrugere. Acest fenomen a fost observat la Saccharomyces
cerevisiae, care a eliberat 6 enzime diferite, ceea ce indică o poziționare distinctă a acestora ȋn
celulă.
Preluarea căldurii degajate ȋn timpul operației de distrugere a celulelor, care ar putea determina
denaturarea moleculelor proteice, se poate realiza prin diferite procedee:
• injectare de dioxid de carbon ȋn interiorul valvei;
• utilizarea azotului răcit ȋn prealabil, combinat cu recircularea biomasei.

O variantă a metodei de distrugere la presiuni ȋnalte o reprezintă trecerea printr-o valvă ȋngustă a
unor suspensii ȋnghețate de celule microbiene, sub o presiune de 550 MPa. In acest mod, la acțiunea
forțelor de forfecare ridicate se adaugă efectul abraziv al cristalelor de gheață, modificarea
dimensiunii cristalelor de gheață, comportarea reologică puternic nenewtoniană (vâscoplastică) la
curgerea suspensiei prin orificiu, rezultatul fiind o distrugere avansată a celulelor. Alte avantaje ale
acestui procedeu mai sunt:
• posibilitatea utilizării pentru un domeniu larg de microorganisme;
• conservarea calităților biologice ale produselor intracelulare.
Insă, procedeul nu este recomandat componenților celulari sensibili la temperaturi scăzute.
Agitarea mecanică
• Agitarea mecanică a suspensiilor de celule ȋn amestec cu bile
confecționate din materiale diferite constituie = o metodă cu
aplicații industriale.
• Procedeul constă ȋn amestecarea la turații ridicate a suspensiei
de biomasă cu astfel de bile, distrugerea celulelor fiind cauzată
atât de forțele de forfecare mari, cât și de coliziunea cu
corpurile solide din amestec.

manta

suspensie de
celule

sita agitator agent de racire

 Bilele
Bilele pot fi confecționate din
diferite materiale:
• sticlă,
• ceramică,
• oțel, cu mențiunea că există
restricții ȋn folosirea
anumitor materiale ȋn cazul
prelucrării biomasei ȋn cadrul
industriei farmaceutice sau
alimentare (de exemplu, nu
este admisă utilizarea sticlei
cu conținut de plumb).
Agitatoarele
• Agitatoarele utilizate sȋnt
de tip disc.
Pentru reținerea bilelor ȋn
utilaj pot fi utilizate trei tipuri
de dispozitive:
• site
• site vibratorii
• disc care se rotește ȋn
imediata vecinătate a unui
taler prevăzut cu un orificiu
central.
Factori pentru eficiența distrugerii celulelor
• natura și concentrația microorganismului,
• condițiile de operare,
• dimensiunea și concentrația bilelor,
• de configurația sistemului de agitare etc., factori care vor fi analizați ȋn continuare.
1. Din studiile ȋntreprinse, s-a constatat că pentru fiecare microorganism există un interval caracteristic al
diametrului bilelor pentru care distrugerea decurge cu randamente maxime (diametru optim). Practic,
dimensiunea optimă este dictată de rezistența microorganismului și de localizarea produsului urmărit ȋn celulă
(pentru distrugerea celulelor de fungi rezultate bune se obțin cu bile avȋnd diametrul > 1 mm, iar pentru
celulele vegetale și animale și drojdii pentru diametre < 1 mm). In același timp, dimensiunea celulelor trebuie
corelată cu mărimea și concentrația celulelor microbiene. In general, diametrul bilelor utilizate frecvent
variază ȋntre 0,1 și 3 mm.
2. Fracția volumică ocupată de bile influențează atȋt gradul de distrugere, cȋt și puterea necesară amestecării.
Astfel, distrugerea celulelor este intensificată odată cu creșterea fracției volumice, ȋnsă, peste anumite valori
(80 - 88%) nu se mai observă nici un efect. Totuși, trebuie luat ȋn considerație faptul că, pentru o anumită
turație a agitatorului, creșterea concentrației bilelor generează creșterea semnificativă a temperaturii
dezvoltate ȋn timpul operației.
3. Un alt factor important ȋl reprezintă energia cinetică a bilelor, EC, calculată cu expresia:
1
Ec   m  v 2b
2

unde: m - masa totală a bilelor din utilaj vb - viteza bilelor.

• Deoarece gradul de distrugere depinde direct proporțional de energia cinetică, se observă că o densitate
sporită a bilelor și o viteză de rotație ridicată a agitatorului determină creșterea eficienței distrugerii a biomasei.
• Deși, ȋn general, procesul de distrugere este accentuat cu intensificarea amestecării, la turații ridicate s-a
observat atingerea unui nivel constant al gradului de distrugere sau chiar o reducere a acestuia. Acest fenomen
este rezultatul apariției unei curgeri inverse a suspensiei odată cu creșterea puternică a turației.
4. dispunerea și configurația agitatorului

Majoritatea agitatoarelor au discurile montate

perpendicular pe ax, ȋnsă au fost experimentate și
agitatoare cu o așezare oblică a discurilor. Aceste
agitatoare oferă performanțe superioare, ȋn special
la turații reduse, dar necesită consumuri energetice
mai mari, iar efectul termic este apreciabil.

Configurația elicoidală a agitatoarelor cu discuri.

Tipuri constructive de
agitatoare disc
Combinată cu conformația
agitatorului, poziția camerei de
mărunțire poate afecta semnificativ
eficiența distrugerii biomasei. S-a
demonstrat experimental că utilajele
orizontale conduc la obținerea unui
grad de distrugere mai avansat și, ȋn
plus, elimină o serie din dezavantajele
celor verticale (figura 1.7), cum ar fi:
astuparea racordului de evacuare,
imposibilitatea etanșării perfecte a
utilajului, tendința de fluidizare a
bilelor etc
5. Temperatura, ȋntre limitele ȋn care se operează curent (5 - 40oC), are o
influența mai redusă. In schimb, o importanță deosebită o are creșterea
temperaturii ȋn camera de mărunțire ȋn timpul operației. Din acest motiv,
un criteriu important de transpunere la scară superioară ȋl constituie
preluarea căldurii dezvoltate.

6. Deși concentrația biomasei nu reprezintă un parametru important, se

observă, ȋn general, o creștere a gradului de distrugere a celulelor
microbiene odată cu creșterea concentrației acestora ȋn suspensia
prelucrată. Acest fenomen este atribuit mo dificării comportării reologice
a suspensiei cu concentrația biomasei, ȋnsă trebuie corelat cu turația
agitatorului. Pentru unele agitatoare, viteza de distrugere a biomasei este
independentă de concentrația acesteia.

6. Pe lȋngă acești factori, o influență deosebită este atribuită naturii

celulelor microbiene și condițiilor de creștere, similar celor prezentate ȋn
cadrul procedeului anterior de distrugere a biomasei. In acest tip de utilaj,
datorită dimensiunii inferioare, bacteriile sȋnt distruse mai greu decȋt
drojdiile.
Distrugerea nemecanică a
membranelor celulelor microbiene
• a. Liza enzimatică
• b. Liza chimică
• c. Metodele fizice
• d. Uscarea
a. Liza enzimatică
• folosește enzime capabile să atace membrana celulară (lizozime).
Utilizarea acestei metode presupune parcurgerea a două etape
preliminare:
• - selectarea unei enzime, sau sistem enzimatic, care să corespundă
microorganismului respectiv;
• - stabilirea condițiilor unei lize eficiente.
Unele microorganisme sȋnt accesibile atacului enzimatic numai ȋn
anumite etape ale dezvoltării acestora sau numai atunci cȋnd creșterea
se desfășoară ȋn anumite condiții. De asemenea, microorganismele pot
fi destul de rezistente la liza enzimatică, caz ȋn care facilitarea
procesului se realizează prin:
• - iradiere;
• - adăugarea unor săruri ȋn concentrație ridicată;
• - utilizarea unor factori biologici pentru mărirea activității
lizozimelor;
• - utilizarea unor sisteme enzimatice combinate.
 Avantaje Dezavantaje
• specificitatea ridicată a • costuri ridicate, ȋn prezent
aplicarea ei fiind
acțiunii lizozimelor. neeconomică la nivel
industrial;
• separarea dificilă a
produșilor intracelulari
eliberați de lizozime, mai
ales atunci cȋnd aceștia
sunt tot enzime (acest
dezavantaj poate fi
ȋnlăturat prin imobilizarea
lizozimelor pe un suport
macromolecular
- Autoliza
• O variantă a acestui procedeu o reprezintă autoliza,
microorganismul producȋnd el ȋnsuși lizozimele. Numeroase
microorganisme sȋnt capabile să producă enzime autolitice care să
realizeze distrugerea stucturii polimerice a peretelui celular, proces
favorizat de modificarea condițiilor de creștere a microorganismelor
respective.
Autoliza depinde de o serie de parametri, dintre care pot fi amintiți:
• temperatura (autoliza drojdiilor necesită 12-24h la 45-50oC);
• valoarea pH-ului;
• componența și concentrația mediului de cultură (cantități reduse de
NaCl, acetat de etil, sau cloroform pot accelera procesul autolitic);
• stadiul de dezvoltare a microorganismului.

In general, autoliza necesită durate ȋndelungate, ȋntre 2 și 20 h,

eficiența sa fiind destul de redusă. In plus, ȋn timpul acestui proces
este posibilă denaturarea moleculelor proteice eliberate din lichidul
intracelular.
- Utilizare de
microorganisme mutante
• Recent au fost experimentate cȋteva microorganisme
mutante, cărora li s-a inhibat capacitatea de a-și sintetiza
peretele celular sau ȋn al căror mediu au fost adăugați unii
componenți meniți să blocheze sinteza membranei celulare
(unele antibiotice, cum ar fi penicilina, adăugate către sfȋrșitul
etapei de creștere).
• O condiție a atingerii unor eficiențe sporite a procesului este
aceea ca biosinteza produselor utile să decurgă și după
adăugarea inhibitorului, astfel ȋncȋt celulele care realizează
diviziunea să aibă membrana distrusă.
 b. Liza chimică
• folosită fie pentru distrugerea pereților celulari, fie pentru extracția unor componenți intracelulari.

Acest procedeu, destul de răspȋndit, utilizează agenți chimici incluși ȋn următoarele categorii:
• - compuși tensioactivi: detergenți ionici (dodecilsulfat de sodiu) sau neionici. Detergenții ionici sȋnt
mai eficienți, produc liza membranei celulare, sau extrag unii componenți din lichidul citoplasmatic,
ȋnsă pot determina și o denaturare a moleculelor proteice eliberate. De asemenea, efectul
compusului tensioactiv trebuie corelat cu cel indus de temperatură, ȋn acest caz atingerea unei
eficiențe sporite fiind posibilă numai la temperaturi scăzute.

• - săruri, zaharuri, esteri acetici: sȋnt compuși care induc plasmoliza, extrăgȋnd materialul
intracelular, ȋn general fără denaturarea acestuia. In acest mod a fost separată invertaza din drojdii.

• - acizi: realizează cel mai rapid hidroliza componenților care alcătuiesc peretele celular, necesitȋnd
ȋntre 6 și 12 h. De exemplu, suspensii concentrate de drojdii au fost acidulate și refluxate ȋntr-un
evaporator pelicular, suspensia rezultată după hidroliză fiind neutralizată, filtrată, decolorată și
concentrată. Insă, cu toate că randamentele hidrolizei acide sȋnt ridicate, se produc pierderi ȋn
proteine, vitamine și compuși aromatici.

• - baze: solubilizează o gamă largă de compuși intracelulari, fără să producă distrugerea peretelui
celular.

• - antibiotice: pot distruge membrana celulară.

• - butanol, uree etc.: pot crea probleme referitoare la separarea produselor eliberate și la toxicitate.
 c. Metodele fizice
Utilizate mai rar, ȋn principal datorită eficienței reduse, chiar după un număr mare de
cicluri.

• șocul osmotic: este indus de modificarea rapidă a concentrației sărurilor din mediu,
fiind aplicat, ȋn general, la distrugerea celulelor animale și a celulelor sanguine,
majoritatea microorganismelor fiind mai puțin afectate de modificarea bruscă a
presiunii osmotice.

Mecanismul distrugerii celulelor are la bază capacitatea celulelor de a echilibra rapid

concentrația din interiorul lor cu cea din mediul exterior, prin osmoză.

Astfel, atunci cȋnd celulele sȋnt suspendate ȋntr-o soluție cu o presiune osmotică
ridicată (ca de exemplu, o soluție de 1 M zahăr) și apoi se diluează repede soluția,
pătrunderea rapidă a apei ȋn celulă crează o presiune hidrostatică care produce liza
celulară. {ocul osmotic poate fi o metodă de intensificare a procesului de autoliză.

• - ȋnghețare-dezghețare: cu o desfășurare ciclică, ȋnsă cu randamente scăzute. In

plus, unii componenți intracelulari sȋnt sensibili la aceste tratamente. Efectele sȋnt
similare cu ale șocului osmotic.
d. Uscarea
• prin ȋncălzire
• cu solvenți
Dezavantaj:
• poate cauza denaturarea unor molecule proteice sau a altor
componenți intracelulari utili.

Modalitatea de realizare a uscării determină performanțele

procesului. Astfel, uscarea masei celulare ȋn uscătoare tip
tambur oferă o eficiență sporită ȋn ceea ce privește eliberarea
proteinelor, comparativ cu uscarea prin liofilizare sau atomizare.
Analiza gradului de distrugere a
membranelor celulelor microbiene
Metodele directe
• stabilesc numărul sau masa
celulelor rămase intacte
Se bazează pe numărarea
celulelor rămase intacte cu ajutorul
unui microscop sau al unui
numărător electronic de particule.
Uneori compușii obținuți prin
distrugerea celulelor pot afecta
negativ precizia metodei.
Ușurarea numărătorii se poate
realiza prin colorarea celulelor,
astfel ȋncȋt să poată fi diferențiate
mai bine celulele ȋntregi de cele
distruse. Metoda necesită un timp
mai lung și nu poate fi aplicată cu
destulă precizie bacteriilor
Metodele indirecte
• determină componenții
celulari eliberați
Constau ȋn dozarea concentrației
componenților citoplasmatici
eliberați ȋn mediu sau ȋn
măsurarea unor parametri care
depind ȋn mod direct de
concentrația acestora
(conductivitate electrică,
activitate) și compararea cu
valorile standard
corespunzătoare unui grad de
distrugere de 100%.