1

LUCRAREA 5
CULTIVAREA BACTERIILOR

Cultivarea bacteriilor: totalitatea fenomenelor legate de creşterea şi multiplicarea

bacteriilor în afara mediului lor natural (extern sau intern), prin asigurarea in vitro a
unor condiţii cât mai apropiate de cele naturale, adecvate necesităţilor metabolice ale
acestor microorganisme.
Scop:
• identificarea agentului etiologic al unei infecţii;
• determinarea farmacorezistenţei microorganismelor izolate;
• preparare seruri şi vaccinuri.
Definiţii:
• populaţia bacteriană: multitudinea de indivizi ai unei specii care habitează într-un
biotop;
• clona bacteriană: populaţia rezultată dintr-o singură celulă prin înmulţire
vegetativă (colonie bacteriană);
• tulpina bacteriană: populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure
izolări în cultură pură;
• inoculare/însămânţare: punerea în contact a unei culturi bacteriene sau a unui
produs patologic cu mediile de cultură;
• mediu de cultură: un complex de substanţe care permite creşterea şi multiplicarea
bacteriilor (conţine substanţe nutritive, are pH şi umiditate corespunzătoare, este steril,
asigură condiţii de aero/anaerobioza) sau mediu care asigură nutrienţii şi condiţiile
fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene;
• cultura bacteriană: totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare pe / în mediul
de cultură, aglomerare de bacterii vizibilă cu ochiul liber;
• izolare: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultură cu scopul de a obţine
cultură pură.

Clasificarea mediilor de cultură

a. după scopul utilizării:

- medii uzuale - pe care se dezvoltă majoritatea germenilor patogeni aerobi şi
anaerobi;
- medii speciale destinate izolării, cultivării şi cercetării însuşirilor biologice ale
anumitor specii bacteriene:
- medii de izolare: cu ser, cu sânge Pasteurella pentru Corynebacterium, cu
glicerină, cu cartofi, cu ou pentru Mycobacterium;
- medii de îmbogăţire: conţin substanţe care stimulează dezvoltarea unor
germeni patogeni: mediui hiperclorurate (tip Champan) pentru stafilococi;
mediul Kauffmann-Muller pentru enterobacterii, mediul Korthoff pentru
leptospire;
- medii selective favorizează, prin compoziţia lor chimică, dezvoltarea
anumitor germeni de interes, inhibând în acelaşi timp dezvoltarea altora,
prezenţi în număr mai redus: mediul Istrati-Meiterf: E. coli, Shigella,
Salmonella; mediu Lowenstein Jensen pentru micobacterii; mediul Muller
Hinton pentru antibiograme;
 2

- medii diferenţiale: permit creşterea diferenţiată a unor specii microbiene

sau pun în evidenţă anumite particularităţi metabolică cu semnificaţie în
diagnostic:
- fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreducătoare;
- diferenţierea speciilor lactozo-pozitive;
- detectarea formării H2S;
- producerea de indol;
- medii de transport;
- medii de conservare;
- medii pentru controlul sterilităţii.

b. după consistenţă:
- medii lichide (repartizate în eprubete);
- medii semisolide (repartizate în eprubete);
- medii solide (geloză dreaptă, înclinată, în plăci). Consistenţa mediului de cultură
este dată de includerea în compoziţie a unor substanţe inerte: agar (geloză) sau gelatină.

c. după tipul respirator:

- pentru germeni aerobi:
- pentru germeni anaerobi.
d. după compoziţie:
- naturale (care conţin substanţe nutritive în forma lor naturală fără a fi prelucrate
în prealabil: lapte, bilă, ser, cartof);
- artificale [medii la care este obligatorie o prelucrare prealabilă, pornind de la
proteine animale (carne şi organe de vită, făină de peşte) sau vegetale (mazare,
soia, drojdie)];
- sintetice: sunt acele medii compuse exclusiv din substanţe chimice (aminoacizi,
factori de creştere, săruri);
- semisintetice: sunt acele medii care pe lângă substanţe chimice mai conţin şi
proteine animale sau vegetale.

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească mediile de cultură:

- să ofere substanţele plastice şi energetice necesare fiecărui microorganism (să
conţină o sursa de N şi C, factori de creştere, săruri minerale;
- să aibă un pH optim pentru specia respectivă, de obicei uşor alcalin 7,2-7,4;
- să asigure, după caz, cerinţele de aerobioză sau anaerobioză;
- să aibă un anumit grad de umiditate;
- să fie stabil (trebuie să-şi păstreze toate calităţile iniţiale pe toată durata incubării);
- să fie sterile, pentru a nu se dezvolta şi alte microorganisme, în afara celor
însămânţate;
- să se păstreze ferite de contaminare, atât înainte, cât şi după folosire.
Mediile de cultură pot fi:
- preparate în laborator conform unor reţete;
- procurate ca medii deshidratate (rehidratate cu apă distilată, demineralizată);
- procurate ca medii gata pentru utilizare, condiţionate în plăci Petri, tuburi.
Controlului de calitate:
 3

- se efectuează pentru fiecare lot în parte:

- mediile de cultură trebuie să fie sterile;
- se verifică prin incubarea a 2 plăci (ex. agar-sânge) la 37°C timp de 48 de ore;
- nu trebuie să apară modificări macroscopice.
Mediile de cultură sunt stocate:
- pentru un timp, la adăpost de lumina solară, la +4°C, în folie de plastic închisă
ermetic;
- în dulapuri, la întuneric, la temperatura camerei în cazul mediilor pentru
creştere în anaerobioză (bulion tioglicolat, alte medii).
Medii de cultură folosite în bacteriologie
Mediu de cultură Utilizări
Medii de bază
Geloză simplă Mediu de cultură de uz general pentru cultivarea
(geloză nutritivă, microorganismelor nepretenţioase: Mediul se distribuie în plăci
conţine bulion de Petri
carne şi agar)
Geloză - sânge Mediu pentru cultivarea microorganismelor pretenţioase şi
(conţine 5% nepretenţioase. Mediul se distribuie în plăci Petri
sânge defibrinat
de animal)
Geloză cord- Pentru cultivarea germenilor pretenţioşi
creier
Apă peptonată Mediu de cultură de uz general pentru germeni nepretenţioşi.
Mediu utilizat atunci când se suspectează prezenţa Vibrio cholerae,
pH 8,6-9,0. Mediul este repartizat în tuburi
Medii selective
Geloză-chocolat Recomandat pentru cultivarea Haemophilus spp. şi Neisseria.
Mediul se toarnă în plăci Petri
Geloză chocolat Recomandat pentru cultivarea Haemophilus spp. şi Neisseria
suplimentat cu
factori de creştere
Geloză Thayer Mediu special pentru cultivarea neisseriilor
Martin
Geloză lactozată Pentru studierea fermentării lactozei
Baza geloză Pentru realizarea unui mediu fără sânge pentru izolarea
Campylobacter Campylobacter spp.
fără sânge (Blood
free - CCDA)
Baza geloză Mediu folosit pentru realizarea unui mediu selectiv şi diferenţial în
Clostridium vederea izolării Clostridium difficile
difficile (necesită
supliment)
Medii pentru testarea sensibilitatii antimicrobiene
Geloza Mueller- Mediu folosit pentru testarea sensibilităţii microorganismelor la
Hinton II antibiotice, cu concentraţie foarte scăzută de tiamină şi timidină
 4

(NCCLS) precum şi cu nivel corespunzător de Ca şi Mg.

Geloza Mueller- Mediu folosit pentru testarea sensibilităţii microorganismelor la
Hinton cu sânge antibiotice, cu conţinut de sânge şi cu concentraţie foarte scăzută de
(Blood II - tiamină şi timidină precum şi cu nivel corespunzător de Ca şi Mg.
NCCLS)
Medii selective şi difernţiale
Mediul Mediu selectiv pentru izolarea şi identificarea prezumptivă a
Chapman- speciilor de stafilococi manito-pozitive
Mannitol Salt
Agar
MRSA Screen Mediu diferenţial pentru identificarea prezumptivă a stafilococului
Agar meticilino-rezistent (MRSA), este indicat pentru depistarea
portajului
Mediul Levine - Mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea enterobacteriilor
Eosin Methylene precum şi pentru identificarea E. coli
Blue Agar
MacConkey Agar Mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea enterobacteriilor
MacConkey Mediu selectiv şi diferenţial pentru identificarea bacteriei E. coli
Sorbitol Agar enterohemoragică (EHEC)
Drigalski Glucose Mediu selectiv şi diferenţial pentru cultivarea şi identificarea
Agar enterobacteriilor
Drigalski Lactose Mediu selectiv şi diferenţial pentru cultivarea şi identificarea
Agar germenilor coliformi
Mediul Leifson Mediu selectiv şi diferenţial pentru izolarea patogenilor enterali.
modificat - Este mai selectiv decât mediul Hynes. Conţine fenilalanină care
Desoxycholate permite diferenţierea speciilor Salmonella de Proteus
Citrate Agar
Salmonella Mediu selectiv şi diferenţial pentru izolarea patogenilor enterali, în
Shigella (SS) special Salmonella şi o parte din speciile Shigella. Conţine
Agar fenilalanină care permite diferenţierea speciilor Salmonella de
Proteus
Brilliant Green Mediu selectiv cu verde briliant pentru izolarea speciilor de
Agar, Uman Salmonella din probele clinice
Hektoen Enteric Mediu selectiv şi diferenţial pentru izolarea patogenilor enterali,
Agar mai ales Salmonella şi o parte din speciile Shigella
XLD Agar Mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea patogenilor enterali,
mai ales a speciilor de Shigella
TCBS Agar Mediu selectiv pentru izolarea microorganismelor patogene din
genul Vibrio
Medii pentru hemocultură
Hemocultura pentru aerobi
Hemocultura pentru anaerobi
Hemocultura pentru aerobi (pediatric mini)
Hemocultura pentru anaerobi (pediatric mini)
Medii de transport repartizate în tuburi cu tampoane de recoltare
 5

Amies cu cărbune Mediu semisolid îmbunătăţit, recomandat pentru transportul

(conţine agar, germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a
tioglicolat de microorganismelor între recoltare şi însămânţare, păstrează raportul
sodiu, cărbune dintre specii. Permite supravieţuirea microorganismelor sensibile,
neutru şi o soluţie ex. Neisseria gonorrhoeae
tamponată de
săruri anorganice)
Amies Mediu semisolid îmbunătăţit, recomandat pentru transportul
germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a
microorganismelor între recoltare şi însămânţare, păstrează raportul
dintre specii.
Cary-Blair Mediu semisolid, recomandat pentru transportul microorganismelor
Gram negative şi anaerobe, păstrează raportul dintre specii
Stuart cu cărbune Mediu semisolid, recomandat pentru transportul germenilor
patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a
microorganismelor, păstrează raportul dintre specii
Stuart Mediu semisolid îmbunătăţit, recomandat pentru transportul
germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a
microorganismelor, păstrând raportul dintre specii
Medii de îmbogăţire repartizate în tuburi
Bulion selenit - Pentru realizarea mediului de îmbogăţire pentru speciile de
cistină Salmonella si unele specii de Shigella. L - cistina îmbunătăţeşte
dezvoltarea salmonelelor
Trichomonas Mediu de cultură utilizat pentru cultivarea Trichomonas vaginalis
Medium
Medii pentru identificare biochimica repartizate în tuburi
SIM Medium Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza mobilităţii
precum şi a producerii de hidrogen sulfurat şi indol (necesită
reactiv Kovács)
Simmons Citrat Mediu pentru diferenţierea bacteriilor Gram negative pe baza
Agar utilizării citratului
Phenylalanine Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza dezaminării
Rhamnose Agar fenilalaninei şi fermentării ramnozei
Geloză uree Pentru realizarea unui mediu ce permite diferenţierea
microorganismelor pe baza producerii de urează
Motility Agar Mediu pentru studiul mobilităţii enterobacteriilor
Indole Motility Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza producerii de
Ornithine Agar indol, a mobilităţii şi a activităţii ornitin decarboxilazei
Lysine Iron Agar Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza producerii
(LIA) lizin-decarboxilazei şi a hidrogenului sulfurat
TSI (Triple Sugar Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor Gram negative pe baza
Iron) Agar fermentării zaharurilor şi a producerii de hidrogen sulfurat
Esculin Mediu pentru diferenţierea bacteriilor pe baza descompunerii
Agar(ABE)BE esculinei
Salt Bulion Mediu selectiv pentru identificarea prezumptivă a enterococilor
prin determinarea toleranţei la sare
 6

Bulion uree-indol Pentru evidenţierea activităţii ureazei şi a producerii de indol

(necesită reactiv Kovács)
Lowenstein- Mediu utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis.
Jensen (conţine o Se repartizează în tuburi înclinat şi coagulat în pantă
soluţie de săruri
şi amidon, soluţia
de verde malachit
şi omogenizat de
ouă)

Metode de însămânţare:
Cerinţe ce trebuie respectate la însămânţare:
- să se realizeze steril;
- să se evite diseminarea în mediu bacteriilor;
- să s realizeze în timp scurt;
- să se folosească pipete Pateur sau ansa bacteriologică;
- să se folosească medii de cultură sterile solide sau lichide.
Pe medii solide:
- însămânţare prin epuizare (se obţin colonii izolate);
- însămânţare în sector (se obţin colonii confluente);
- însămânţare prin înţepare.
Pe medii lichide
- omogenizarea unei colonii în mediu lichid.

Însămânţarea prin epuizare

Obţinerea culturii primare:
- se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic;
- se descarcă ansa pe mediu de cultură:
- se însămânţează un prim sector;
- se sterilizează ansa;
- din primul sector însămânţat se trasează câteva striuri paralele în sensul acelor
de ceasornic;
- se continuă însămânţarea prin striuri paralele, terminându-se printr-un striu în
zig-zag. În ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel încât după incubare se vor
forma colonii izolate.

Obţinerea culturii pure:

- se replică o singură colonie din cultura primară pe un mediu de cultură proaspăt,
fie prin epuizare, fie prin însămânţare în sector.

Însămânţarea în sector:
- se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic;
- se descarcă ansa pe mediu de cultură sub forma unui sector de cerc.
Pe o placă pot fi însămânţate mai multe specii bacteriene. Prin însămânţare în sector nu
se obţin colonii izolate.
 7

Însămânţarea pe medii în coloană înclinată:

- se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs;
- se descarcă ansa pe partea înclinată a mediului de cultură sub forma unui striu. Nu
se obţin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele.

Însămânţarea prin înţepare:

- se practică pentru însămânţarea mediilor solide turnate în coloană dreaptă;
- se încarcă acul de inoculare cu produs;
- se înţeapă mediul în direcţie verticală pe o distanţă de ¾ din înălţimea
coloanei;
- se poate utiliza şi pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini
considerate importante, a tulpinilor de colecţie, a tulpinilor de referinţă, pentru
însămânţarea unor medii multitest (TSI, MIU);
- se preferă utilizarea unei anse-fir sau a unei anse cu o buclă foarte mică;
- se utilizează tuburi (eprubete) de dimensiuni diferite şi o cantitate diferită de mediu.
Pentru cultivare pe mediul TSI:
- se utilizează tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuşor);
- se însămânţează „partea dreaptă" prin înţepare, fără a se atinge baza tubului;
- se însămânţează apoi „partea înclinată" prin realizarea unor striuri în zig-zag,
atingând suprafaţa mediului.

Însămânţarea în medii lichide

Tehnica însămânţării cu ansa bacteriologică:
- se introduce ansa cu firul înroşit în flacără în recipientul ce conţine produsul
patologic;
- se răceşte alipind ansa de peretele recipientului;
- se recoltează o porţiune din produs;
- se scoate dopul recipientului cu mediu;
- se flambează gura acestuia;
- se descarcă materialul luat pe bucla ansei din prelevat în mediul din recipientul
deschis sub protecţia flăcării pe peretele recipientului;
- se agită uşor lichidul;
- se flambează din nou gura recipientului şi dopul cu care apoi se astupă recipientul;
după însămânţare, ansa se sterilizează din nou prin încălzire la roşu.

Tehnica însămânţării cu pipeta:

- se scoate pipeta gradată din ambalajul steril;
- se introduce rapid în flacără atât capătul cât şi toată lungimea ei;
- se controlează apoi răcirea ei prin flambare;
 8

- dacă se lucrează cu pipeta Pasteur, se rupe vârful efilat al pipetei, după care se
flambează capătul;
- pipeta flambată şi răcită se introduce în recipientul cu produsul prelevat;
- se aspiră de la câteva picături până la 1 sau mai mulţi ml, în raport cu materialul de
însămânţat şi cantitatea de mediu de cultura;
- pipeta se manipulează cu grijă pentru a nu uda dopul de vată;
- se însămânţează materialul aspirat în pipetă în recipientul cu mediu nutritiv;
- după însămânţare se flambează gâtul recipientului şi dopul;
- pipeta folosită se pune într-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirându-se din
amestec până la aproximativ 1 cm sub dop;
- tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descărcate direct
în mediu, după care vor fi introduse în tub şi puse în găleata de infecte.
În funcţie de specie, bacteriile cresc difuz în tot volumul mediului la suprafaţă sau la
fundul eprubetei.

Identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de cultură, biochimice şi de

metabolism

Pe baza caracterelor de cultură

În acest caz se studiază aspectul macroscopic al coloniilor bacteriene izolate:
a. colonii de tip S (smooth - netede):
- rotunde;
- bombate cu margini circulare, regulate;
- translucide cu suprafaţa netedă;
- uşor detaşabile de pe mediu;
- suspensionate în ser fiziologic produc suspensii omogene;
- produc tulburare în mediu lichid;
- germenii capsulaţi păstrează capsula;
- virulenţa este conservată.
Tipul de colonie S reprezintă forma normală pentru majoritatea bacteriilor patogene (S.
aureus, S. pyogenes, E. coli), fiind dotată cu calităţi optime de structură antigenică şi de
patogenitate;
b. colonii de tip R (rough - rugos, aspru, grunjos):
- colonii cu margini neregulate;
- plate, uscate;
- cu suprafaţa zbârcită;
- aderente la mediu;
 9

- aglutinează spontan în ser fiziologic;

- structura antigenică nu este caracteristică;
- nu păstrează capsula;
- în mediu lichid produce depozit cu supernatant clar. Tipul R de colonie este
caracteristic, în general, bacteriilor nepatogene, cu 3 excepţii: Bacillus anthracis,
Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae;
c. forme intermediare: S-R, R-S;
d. colonii de tip M:
- cu aspect mucos;
- foarte mari;
- foarte bombate;
- foarte lucioase;
- cu tendinţă de curgere şi de confluare.
Tipul M de colonii este caracteristic bacteriilor care posedă capsulă (Klebsiella);
e. fenomen de căţărare (invazie, migrare, roire):
Pe medii simple, creşterea se exprimă într-un strat continuu, sub forma unor valuri
succesive, fenomen caracteristic pentru Proteus spp.
Bacillus anthracis produce colonii în "cap de meduză"/"coamă de leu" (mari, alb-
cenuşii, de tip "R", la periferia coloniei, se pot observa prelungiri ondulate).
Exemple de creştere pe medii de cultură lichide:
- mediul este tulburat omogen (Staphylococcus spp.)
- mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (S. pyogenes)
- mediul este clar, cu văl la suprafaţă (V. cholerae în apă peptonată alcalină)
- dezvoltarea culturii se realizează ca un "inel" aderent de pereţii tubului, la
suprafaţa mediului (E. coli)
- mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafaţă (Bacillus
subtilis)
- mediul este clar cu apariţia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B.
anthracis)
- mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o membrană groasă, plisată (M.
tuberculosis).

Pe baza caracterelor biochimice şi de metabolism

În acest caz se studiază metabolismul bacterian şi prezenţa diferitelor enzime specifice.
Studierea caracterelor biochimice şi de metabolism permit încadrarea bacteriilor în
specie.

a. Metabolismul glucidic
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale sau selectiv-diferenţiale;
- urmăreşte descompunerea diferitelor zaharuri de către bacterii (glucoză, lactoză,
zaharoză, manitol);
- prin descompunerea zahărului de către bacterii mediul se acidifică, iar indicatorul
schimbă culoarea mediului de cultură.
 10

b. Metabolismul proteic:
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale;
- prin descompunerea proteinelor de către bacterii se eliberează metaboliţi precum
indol, H2S sau amoniac;
- indolul şi H2S se evidenţiază cu ajutorul unor hârtii de filtru îmbibate în reactiv
specific (reactiv Kovacs pentru indol şi săruri de Pb pentru H2S);
- prezenţa amoniacului se evidenţiază cu ajutorul unui indicator de culoare.

c. Enzimele bacteriene
 hemolizinele:
- enzime care lizează hematiile (alterează hemoglobina);
- prezenţa acestei enzime se evidenţiază pe mediu geloză - sânge;
- principalele tipuri de hemoliză:
- alfa (α) - apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei;
- beta (β) - sângele este descompus total, în jurul coloniei este o zonă clară,
transparentă. α-Hemolizina sintetizată de Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae) produce liza incompletă a hematiilor, culoare verzuie; ß-hemolizina
sintetizată de Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes produce
liza completă a hematiilor, zona de hemoliza este clară; y-hemolizina produsă de
 11

Staphylococcus spp. lizează hematiile, dar nu produce zone de hemoliza pe agar-sânge

(la streptococi, "y-hemoliza" indică absenţa hemolizei).
 catalaza (Staphylococcus spp):
- descompune apa oxigenată în apă şi oxigen;
- oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz;
 coagulaza:
- determină coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant;
 oxidaza (N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, V. cholerae):
- enzime oxidative;
- acţionează asupra unor substanţe producând compuşi coloraţi.
 gelatinaza (Clostridium perfringens):
- lichefiază gelatina;
 lecitinaza (Bacillus anthracis, Clostridium spp.);
 nitrat-reductaza (Mycobacterium spp.);
 Alte caractere metabolic:
- toleranţa la un anumit pH (V. cholerae se multiplică la pH alcalin);
- toleranţa la o anumită concentraţie de NaCl (Staphylococcus aureus);
sensibilitatea la optochin (S. pneumoniae) sau la bacitracină (S. Pyogenes).
d. Alte teste
Mobilitatea:
- bacteriile flagelate sunt mobile şi migrează într-un mediu de cultură semisolid,
deviază de la locul de inoculare (traiectul de înţepătură).
Mirosul:
- la multe specii, coloniile au miros caracteristic:
Producerea de pigment:
- pigmenţi nedifuzibili - nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia
(Staphylococcus aureus - pigment auriu);
- pigmenţi difuzibili - difuzează în mediu, colorează şi mediul (Pseudomonas -
pigment verde).

Teste de identificare

Testul sensibilităţii la bacitracină

Principiu: Bacitracina (antibiotic sintetizat de Bacillus licheniformis) inhibă
multiplicarea streptococilor de grup A. Mai puţin de 1% din
tulpinile de Streptococcus pyogenes rezistă la acţiunea bacitracinei.
Materiale - colonii P-hemolitice izolate pe geloză - sânge;
necesare: microcomprimate de bacitracină cu 0,04 U şi cu 0,1 U.

Tehnica de lucru: - se prelevează 3-4 colonii P-hemolitice;

- se însămânţează omogen pe 1/2 de placă Petri cu geloză-sânge.;
- se plasează în centrul ariei însămânţate un microcomprimat cu
bacitracină;
se incubează pentru 18-24 ore la 35-37°C.
Interpretare: Test pozitiv:
- când se constată inhibarea creşterii bacteriene în jurul
 12

microcomprimatului cu 0,04 U bacitracină (indiferent de diametru);

- când se constată o inhibare a creşterii bacteriene în jurul
microcomprimatului cu 0,1 U bacitracină cu diametrul>11 mm.
Control de Martor pozitiv: Streptococcus pyogenes
calitatea: Martor negativ: Streptococcus agalactiae.
Testul bilolizei (Neufeld)
Principiu: Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în
prezenţa bilei sau a sărurilor biliare prin activarea unei enzime
autolitice.
Materiale - colonii ct-hemolitice izolate;
necesare: - soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%;
- soluţie izotonică;
- apă distilată.
Tehnica de lucru: - se prepară în soluţie salină fiziologică o suspensie de colonii ct-
hemolitice izolate;
- se repartizează în 2 eprubete de sticlă câte o,5 ml suspensie;
- se adaugă în prima eprubetă 0,5 ml dezoxicolat de sodiu;
- se adaugă în a doua eprubetă 0,5 ml apă distilată
- se incubează probele 2 ore la 35-37oC.
Interpretare: Testul este pozitiv (bacterii lizate - pneumococi):
- dacă suspensia din eprubeta în care s-a adăugat dezoxicolat s-a
clarificat şi nu s-a clarificat în cealaltă eprubetă;
Testul este negativ: dacă ambele tuburi au rămas opace.
Controlul Martor pozitiv - Streptococcus pneumoniae
calităţii: Martor negativ - Streptococcus viridans.
Testul producerii de catalază
Principii: Se testează capacitatea bacteriilor de a elibera oxigen din peroxidul
de hidrogen (H2O2) prin acţiunea catalazei.
Materiale - colonii dezvoltate şi izolate pe medii fără sânge;
necesare: - soluţie de peroxid de hidrogen 3%;
- apă distilată.
Tehnica de lucru: - se realizează o suspensie bacteriană densă în 1-2 ml apă distilată;
- se adaugă 1-2 picături de peroxid de hidrogen 3%;
- se observă imediat şi după 5 minute apariţia bulelor de oxigen.
Interpretare: Test pozitiv: apariţia bulelor de gaz, bacteria sintetizează catalază;
Test negativ: absenţa bulelor de gaz, bacteria nu sintetizează
catalază.
Control de Martor pozitiv - Staphylococcus aureus;
calitate: Martor negativ - Streptococcus pyogenes.
Testul coagulazei
Principiu: Stafilococii coagulazo-pozitivi (Staphylococcus aureus) produc o
enzimă care activează coagularea plasmei. Există 2 tipuri de
coagulază: coagulaza liberă şi coagulaza legată de peretele celular
(“dumping factor“). Coagulaza liberă şi legată convertesc
fibrinogenul din plasmă la fibrină cu formarea unui coagul.
Materiale - colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmează să fie
 13

necesare testată;
- plasmă de iepure;
- lame;
- tuburi.
Tehnica de lucru: - se depune pe lamă o picătură de apă distilată;
Testul coagulazei - se suspensionează şi omogenizează 1-2 colonii în picătura de apă
pe lamă - distilată (tulbure omogen);
coagulaza legată - se aşteaptă 10 secunde;
- se urmăreşte apariţia eventualelor autoaglutinări;
- dacă apare fenomenul de autoaglutinare se trece la efectuarea
testului coagulării în tub;
- dacă picătura se menţine tulbure omogen se adaugă 1 picătură de
plasmă; se urmăreşte apariţia “coagulilor” timp de 10-15 secunde
Interpretare: Test pozitiv: apariţia “coagulilor“ în 10-15 secunde;
Test negativ: absenţa “coagulilor“ (5% din Staphylococcus aureus
dau reacţii fals negative).
Testul coagulazei - se pipetează 0,5 ml de plasmă într-un tub steril;
în tub - coagulaza - se prelevează o colonie care se descarcă în plasma din tub;
liberă - se incubează tubul timp de 4 ore la 35-37°C;
- se recomandă examinarea, prin înclinarea tubului, din 30 în 30 de
minute, în primele 4 ore;
- dacă reacţia este negativă la 4 ore, se reincubează tubul până la
24 ore.
Interpretare: Test pozitiv: formarea unui coagulului;
Test negativ: absenţa coagulului.
Control de Martor pozitiv - Staphylococcus aureus
calitate: Martor negativ - Staphylococcus epidermidis
Medial multitest MIU (mobilitate indol uree)
Principiu: MIU conţine uree, triptofan, roşu fenol (indicator de pH) şi este
condiţionat în tuburi de dimensiuni mici. Geloza moale permite
mobilitatea microorganismului însămânţat; hidroliza ureei va duce la
alcalinizare mediului (culoarea virează de la galben la roşu);
producerea de indol din triptofan va fi indicată de înroşirea
reactivului Ehrlich.
Materiale - tuburi cu mediul MIU;
necesare: - hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich;
- colonii izolate de identificat;
- ansă fir.
Tehnica de lucru: - se prelevează probă pentru însămânţare din colonia, izolată pe
mediu neselectiv, cu ajutorul ansei fir;
- se însămânţează mediul prin înţepare astfel încât să se realizeze o
însămânţare în “linie dreaptă“
- se fixează de dop hârtiuţa indicator în aşa fel încât să ajungă
deasupra coloanei de mediu, fără ca acesta să fie atins;
- se incubează la 35-37°C, timp de 24 ore;
- se reincubează tubul până la 48 de ore dacă nu s-a constatat
 14

virarea culorii mediului.

Interpretare: Mobilitatea:
- bacterie imobilă - dacă opacifierea apare numai pe traiectul de
însămânţare;
- bacterie imobilă - dacă opacifierea este uniformă în coloana de
mediu.
Urează:
- bacterie urează negativă - dacă culoarea coloanei rămâne
galbenă;
- bacteria urează pozitivă - dacă culoarea devine roşie;
- apariţia unui inel de culoare roşie la suprafaţa mediului nu
semnifică un test pozitiv.
Indol:
- bacterie indol pozitivă - dacă apare schimbarea culorii hârtiei la
roşu-violet;
- bacterie indol negativă, dacă hârtia rămâne albă.
Control de Martor pozitiv - Proteus mirabilis: M+, U+, 1+;
calitate: Martor negativ - Shigella spp.: M-, U-, I-.
Mediul multitest TSI (triple sugar iron - trei glucide şi fier )
Principiu: Examinarea concomitentă a mai multe teste de identificare a
bacteriilor pe un singur mediu de cultură.
Materiale - tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI de culoare roşu deschis
necesare: [mediul TSI conţine glucoză (1/10 din cantitatea celorlalte
zaharuri), lactoză şi zaharoză, citrat feric şi un indicator de pH (roşu
neutru)]. Mediul se solidifică în poziţie înclinată astfel încât să
rămână în partea inferioară a tubului o porţiune de mediu
neînclinată de 1-2 cm. Partea dreaptă (coloana) nu vine în contact
cu aerul şi oferă condiţii relative de anaerobioză; partea înclinată
(panta) oferă condiţii de multiplicare în aerobioză;
- colonii izolate de identificat;
- ansa fir.
Tehnica de lucru: - se prelevează probă din colonia izolată pe mediu neselectiv cu
ajutorul ansei fir;
- se însămânţează coloana prin înţepare;
- se retrage ansa şi se însămânţează partea înclinată prin striuri
paralele (sau în zig-zag);
- se incubează tubul la 35-37oC, timp de 24 ore.
Interpretare: - fermentarea glucozei este pozitivă dacă în porţiunea dreaptă
culoarea virează la galben;
- dacă culoarea coloanei rămâne roşie, glucoza nu este fermentată
(şi nu este o enterobacterie);
- dacă fermentarea a avut loc cu producere de gaze, bulele sunt
vizibile;
- fermentarea lactozei/zaharozei este considerată pozitivă dacă în
porţiunea înclinată culoarea virează la galben;
- producerea de hidrogen sulfurat este pozitivă dacă între porţiunea
 15

dreaptă şi cea înclinată se înnegreşte zona.

Control de Martor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere
calitate: de fbS - E. coli;
Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul
pantei şi producere de H2S - Salmonella typhimurium
Testul producerii de citocrom oxidaza
Principiu: Unele bacterii produc citocrom oxidază, enzimă care lipseşte la
bacteriile strict anaerobe. Aceasta acţionează asupra tetra-metil p-
fenilendiaminei cu formarea unui compus de culoare purpurie. Sunt
oxidazo-pozitive bacteriile: Vibrio spp., majoritatea speciilor de
Pseudomonas, Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germenii
Gram negativi) şi Micrococcus spp. (dintre germenii Gram
pozitivi).
Materiale - soluţie apoasă de tetra-metil p-fenilendiamină 1% conservată în
necesare: sticlă de culoare brună la frigider sau fâşii de hârtie indicator
impregnate în reactiv;
- hârtie de filtru;
- ansă cu fir de platină sau pipetă Pasteur (cudată);
- colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge, agar-chocolat sau agar
Mueller Hinton.
Tehnica de lucru: - se prelevează cu un tampon steril 2-3 colonii;
- se realizează o însămânţare pe jumătatea unei plăci cu agar-
sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluentă,
- se plasează un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate;
- se presează uşor pentru ca discul să adere uniform;
- se incubează timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosferă de 5%
CO2.
Interpretare: Test pozitiv: apariţia unei zone de culoare purpurie în 10 secunde;
Test negativ: absenţa culorii purpurie.
Apariţia zonei colorate mai târziu nu permite interpretarea testului
(posibile rezultatul este negativ).
Control de Martor pozitiv - Pseudomonas aeruginosa;
calitate: Martor negativ - Escherichia coli.
Testul sensibilităţii la optochin (ethyl hydrocuprein hydrocloride)
Principiu: Testul optochin ajută la diagnostic prin diferenţierea pneumococilor
de Streptococcus viridans. Optochin este inhibitor pentru
dezvoltarea pneumococilor (Streptococcus pneumoniae) chiar la
concentraţii < 5 μg/ml de optochin, pe când alţi streptococi se
dezvoltă bine sau prezintă o zonă mai slabă de inhibare.
Materiale - discuri cu optochin (5 μg/disc), cu diametrul de 6 milimetri;
necesare: - plăci cu agar-sânge;
- tampoane sterile;
- colonii α-hemolitice izolate, care urmează a fi testate.
Tehnica de lucru: - se Prelevează cu un tampon steril 2-3 colonii;
- se realizează o însămânţare pe jumătatea unei plăci cu agar-
sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluentă;
 16

- se plasează un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate;

- se presează uşor pentru ca discul să adere uniform,
- se Incubează timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosferă de 5%
CO2.
Interpretare: Test pozitiv: apariţia unei zone de inhibiţie cu diametrul mai mare
de 14 mm,
Test negativ: absenţa inhibiţiei în jurul discului semnifică un test
negativ.
Control de Martor pozitiv - Streptococcus pneumoniae;
calitate: Martor negativ - Streptococcus viridans.