DEPARTAMENTUL TEHNOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

Microbiologia generală

METODE DE IZOLARE ŞI OBŢINERE A CULTURILOR PURE

1
 CONŢINUT

8.1. Metode fizice de izolare şi de obţinere a culturilor pure

8.2. Metode biologice de izolare şi de obţinere a culturilor pure
8.3. Importanţa practică a culturilor pure
8.4. Procedee de conservare a culturilor pure

Cultura pură reprezintă o biomasă de celule rezultate prin reproducere dintr-o singură
celulă aflată într-un mediu nutritiv steril, cu volum limitat.

2
 CLASIFICAREA METODELOR DE IZOLARE ŞI DE OBŢINERE A CULTURILOR PURE

I. METODE FIZICE II. METODE BIOLOGICE

1.1. Metode bazate pe tehnici de răspândire q Metoda Burii

q Tehnica de răspândire pe placă (tehnica Drigalsky)

q Tehnica de răspândire prin striuri pe placa Petri
q Metode scarificate
q Metoda în strii
q Metoda culturală Koch

1.2. Metode prin diluare

q Metoda Lindner
q Metoda Naumov

1.3. Metode de izolare cu ajutorul micromanipulatorului

3
 METODE BAZATE PE TEHNICI DE RĂSPÂNDIRE
Principiul metodei
§ răspândirea celulelor din medii naturale unde acestea se află în număr mare, prin diluare în medii
lichide
§ răspândirea celulelor din medii naturale prin diseminare mecanică pe suprafaţa mediilor sterile.

Tehnică de răspândire pe placă (tehnica Drigalsky)

Metoda A
Colonii de
Incubarea suprafaţă

Proba este picurată pe placa Proba este răspândită uniform pe

cu agar suprafaţa de agar utilizând bagheta sterilă

Metoda B Colonii de Colonii de

Incubarea suprafaţă suprafaţă

Proba este pipetată pe Este adăugat mediu steril şi amestecat

placa sterilă bine cu inoculul

4
 TEHNICA DE RĂSPÂNDIRE PRIN STRIURI PE PLACA PETRI

• constă în efectuarea inoculării probei de cercetare (analizate) în patru sectoare.

• cu ajutorul ansei sterile se prelevează proba cu produs
• se fac însămânţări prin striuri în sectorul 1
• apoi din primul sector cu ansa sterilizată se fac trasări în sectorul 2, în direcţia acelor ceasornicului
• trasările sunt continuate în sectorul 3, iar în sectorul 4 se efectuează printr-un striu în formă de zig-zag.

Inoculul iniţial,
Sectorul 2
sectorul 1

Sectorul 3 Sectorul 4

5
 METODE SCARIFICATE DE IZOLARE

• în placa Petri se repartizează un mediu de cultură adecvat, de exemplu MMA/BCA

• după solidificarea mediului cu firul metalic se recoltează celule din mediul natural
• se execută trasări pe suprafaţa mediului, astfel încât diversele celule rămân distanţate între ele
• prin termostatare, 48-72 ore, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie izolat se face
repicare într-o eprubetă cu mediu solid înclinat

6
 METODA ÎN STRII

• este similară celei scarificate

• însă drept suprafaţă de răspândire se foloseşte mediul înclinat din 2-3 eprubete,
• se realizează prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, în mod succesiv
7
 METODA CULTURALĂ KOCH

Suspensia celulelor 9 ml mediu fluidizat

microbiene
Diluții 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:10000000

Colonii

Mediu
fluidizat
Turnarea în placă Colonii izolate

• este folosită în special la izolarea drojdiilor;

• ca mediu de răspândire se foloseşte MMA repartizat în 3 eprubete, fluidificat şi menţinut la 40°C;
• din mediul natural, de exemplu un must în fermentaţie, se recoltează proba de cercetare cu ajutorul
ansei care se introduce succesiv în cele 3 eprubete, cu agitare, care să asigure desprinderea celulelor;
• după inoculare şi uniformizare, conţinutul fiecărei eprubete se repartizează în câte o placă Petri;
• prin solidificare celulele rămân fixate în gel şi prin multiplicare vor forma colonii izolate;
• în funcţie de densitatea celulelor recoltate, iniţial în placa a 2-a sau a 3-a coloniile sunt suficient de
distanţate (se preferă o distanţă de circa 2 cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvată a
culturii pure, prin repicare în eprubeta cu MMA 8
 METODE DE DILUARE

159 x 103 = 1,59 x 105

nr. de factorul celule (colonii unități formatoare
germeni de diluție de colonii) per ml de probă originală

Din mediul natural se execută diluţii decimale în ser fiziologic steril, astfel încât numărul de celule într-o
micropicătură din ultima diluţie să fie redus. 9
 Metoda Lindner

§ se foloseşte pentru izolarea de drojdii fermentative;

§ din diluţia convenabilă, cu ajutorul unei peniţe topografice se plasează aproximativ 9
. picături pe suprafaţa unei lamele sterile;
§ lamela se amplasează cu picăturile în jos pe o lamă cu excavaţie şi se studiază la
microscop fiecare picătură;
§ se notează cu un marker conturul picăturii în care se află o singură celulă;
§ se desprinde lamela şi cu ajutorul unei benzi sterile de hârtie se absoarbe picătura
notată;
§ odată cu lichidul se adsoarbe şi celula de izolat, apoi banda se introduce într-o eprubetă
cu mult lichid;
§ celula va da prin reproducere o cultură pură.

Metoda Naumov
• este folosită pentru izolarea culturilor pure de mucegaiuri;
• dintr-o diluţie convenabilă se aplică distanţat micropicături peste care se adaugă picături
de mediu MMA fluidificat (42°C);
• după 3-8 zile se selectează din picătura cu o singură colonie cultura pură dorită.
Metoda de izolare cu ajutorul micromanipulatorului
• este o metodă precisă şi se realizează cu ajutorul unui aparat prevăzut cu tuburi capilare
cu care se poate face selecţia celulelor dorite din preparate studiate la microscop.
• cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule
ascogene şi este folosit la dirijarea proceselor de fuziune a protoplastelor, pentru
conjugare etc. 10
 8.2. METODE BIOLOGICE DE IZOLARE ŞI DE OBŢINERE A CULTURILOR PURE

q Se bazează pe proprietăţile fiziologice ale microorganismelor de izolat care să se diferenţieze clar de

cele ale microorganismelor însoţitoare din acelaşi biotop.
q Uneori prin aceste metode se face izolarea unui grup cu caractere taxonomice apropiate apoi se face
izolarea de culturi pure prin tehnici de răspândire sau prin folosirea mediilor selective

Metoda Burri - separarea microorganismelor în funcţie de necesarul de oxigen pentru creştere

Zone de creștere a microorganismelor în Metoda Burri de izolare şi obţinere a culturilor pure

funcţie de necesarul de oxigen pentru § dintr-un mediu natural se face inocularea în BCA;
creştere § după uniformizare acesta se introduce într-un tub de
sticlă prevăzut la un capăt cu dop de cauciuc ;
§ prin răcire celulele sunt imobilizate în gel;
§ în funcţie de accesul oxigenului din aer, în zona
tubului prevăzut cu dop de cauciuc se vor dezvolta...
11
 8.3. IMPORTANŢA PRACTICĂ A CULTURILOR PURE

Ò studiul proprietăţilor morfologie şi fiziologice în scopul identificării;

Ò caracterizarea şi stabilirea domeniului de utilizare a culturii.
Ò pornind de la cultura pură, în biotehnologiile alimentare prin cultivarea în medii adecvate
se obţine cantitatea necesară de inocul/maia folosită drept cultură - starter a procesului
fermentativ.
Inoculul reprezintă un mediu nutritiv steril în care s-au înmulţit celulele aparţinând unei
culturi pure, aflată în etapa finală a creşterii exponenţiale.

Utilizarea culturilor pure:

q la fabricarea berii,
q la fabricarea alcoolului,
q la fabricarea vinului,
q la fabricarea produselor lactate acide,
q la fabricarea panificaţie etc.

12
 8.4. PROCEDEE DE CONSERVARE

§ menţinerea culturilor la temperaturi scăzute în condiţii de refrigerare sau congelare.

Culturile de fungi păstrate la 5°C se transferă anual, iar dacă păstrarea se face la 16°C la
interval de 6 luni;
§

§ privarea de oxigen. În absenţa oxigenului din aer, microorganismele aerobe trec în stare
latentă de viaţă;

§ reducerea umidităţii mediului conduce la trecerea celulelor în stare de anabioză care

poate fi menţinută timp îndelungat fără a se produce modificări intracelulare, ireversibile;

§ păstrarea culturilor în stare liofilizată. Este tehnica cea mai utilizată şi avantajoasă,
deoarece prelungeşte cel mai mult intervalul de conservare a culturilor, fără să producă
modificări ale proprietăţilor lor fiziologice. În cazul mucegaiurilor, o suspensie de spori în
lapte degresat se congelează rapid la - 25°C, apoi are loc uscarea în vacuum timp de trei
ore în recipiente de sticlă care se închid ermetic şi culturile se pot menţine 10 ani

13