UNIVERSITATEA DE VEST ”VASILE GOLDIS”

ARAD

MASTER: ANALIZE DE LABORATOR

UTILIZATE IN DOMENIUL BIO MEDICAL

TEHNICI UTILIZATE IN CULTURI DE

CELULE

REFERAT: OBTINEREA INSULINEI CU AJUTORUL

BACTERIILOR

MASTERAND: MIHAI DANIEL

1
 OBTINEREA INSULINEI CU AJUTORUL
BACTERIILOR

INSULINA
Insulina este singurul hormon al organismului cu actiune hipoglicemianta:
el face ca glucoza din sange sa intre in celule, care o folosesc pentru producerea de
energie. Totusi, atunci cand ea se fixeaza in ficat, insulina favorizeaza constituirea
rezervei de glucoza sub forma de glicogen. De altfel, acest hormon favorizeaza
sinteza proteinelor si impiedica distrugerea lipidelor. Reglarea secretiei de insulina
este directa: o hiperglicemie (cresterea nivelului sangvin al glucozei) stimuleaza
sintetizarea sa. 

Tulburari ale metabolismului insulinei - O insuficienta absoluta sau

relativa a secretiei de insulina provoaca un diabet zaharat. Acesta se manifesta in
principal printr-o hiperglicemie. 

Utilizare terapeutica - Insulina este obtinuta in mod traditional prin

purificarea extractelor de pancreas de porc sau de vita. De mai multi ani se dispune
de insulina fabricata prin inginerie genetica, insulina care are exact aceeasi
compozitie cu insulina umana. Dupa durata ei de actiune, se deosebesc trei forme de
insulina: obisnuita (4 ore), intermediara (12 ore), lenta (mai mult de 24 ore). Insulina
este prescrisa in caz de diabet, mai ales de diabet insulinodependent. Bolnavul invata
sa-si faca singur injectiile pe cale subcutanata, una pana la trei pe zi. In plus medicul
poate sa foloseasca insulina obisnuita pe cale subcutanata sau intravenoasa (la nevoie
cu ajutorul unei pompe electrice care asigura o perfuzie intravenoasa continua) pentru
urgente (hiperglicemie majora, acidocetoza diabetica). In viitor, administrarea de
insulina pe cale nazala, deja in testare, ar putea sa se dezvolte si sa inlocuiasca
administrarea pe cale subcutanata, mai constrangatoare.
Insulina rămâne în continuare unul dintre mijloacele cele mai bune de
echilibrare a metabolismului intermediar perturbat în diabetul zaharat, la peste 30-
40% din totalitatea bolnavilor. În ultimul timp concluziile, atât ale pacienţilor, cât şi
ale cercetătorilor sunt unanime în recunoaşterea că un bolnav cu diabet zaharat corect
echilibrat cu insulină, sau când este cazul, numai cu un regim alimentar, este un om
care poate duce o viaţă similară cu a celui care nu are diabet zaharat, ajungând la o
medie de viaţă similară şi fără complicaţii degenerative. 
2
Particularităţi fizico-chimice
Este un hormon cu structură polipeptidică, cu greutate moleculară cca. 34000.
Este secretată de celulele (din insulele lui Largenhans pancreatice şi stocată în
granulele celulare. Degranularea apare după corticostinozi, gluconi, hormon
samatotrop, sulfaniluree. 
Structura chimică este definită după specia animală, dar activitatea biologică
este independentă de specie. Monomerul insulinei bovine are greutatea moleculară de
cca. 5700 şi este format din două catene polipeptidice legate prin două punţi
disulfidice. A fost obţinută şi pe cale sintetică (1963) din 51 de aminoacizi, operaţia
necesitând 200 de etape, cu un randament 5×10-5. 
Există două tipuri principale de preparate insulinice,
- hiposolubile
- si suspensii apoase.
Preparatele hidrosolubile conţin insulină amorfă sau cristalizată, în soluţie
apoasă, la pH intens acid (2, 5 - 3, 5). 
Suspensiile apoase conţin derivaţi greu solubili de insulină, la pH apropiat de
neutru (7, 1 - 7, 5). Ele sunt preparate dépôt sau retard. Conţin fie complexe insulină-
proteine (globin-zinc-insulină, izofan-zinc-insulină, protamin-zinc-insulină), fie
complexe zinc-insulină: 
a) cu insulina amorfă = insulină semilentă; 
b) cu insulina cristalizată = insulina ultralentă; 
c) cele două forme în proporţie de 30% + 70% = insulina (lentă). 

Rolul insulinei in organism

Insulina este un hormon polipeptidic cu mare impact asupra metabolismului,
intervenind chiar in procesele senzoriale si in cele cognitive. In metabolismul
glucidic, insulina asigura cresterea depozitelor de glicogen si scade glicogenoliza
hepatica. In metabolismul proteic favorizeaza sinteza proteinelor in muschi prin
usurarea transportului aminoacizilor si stimularea sintezei ribozomale in celulele
musculare. De asemenea, stimuleaza sinteza trigliceridelor si scade lipoliza prin
inhibarea lipazei din adipocite.
In celulele beta-Langerhans din portiunea endocrina a pancreasului (care reprezinta
doar 2% din intreaga masa pancreatica), insulina este sintetizata din precursorul ei,
proinsulina, sub actiunea enzimelor proteolitice, precum prohormon convertaza si
carboxipeptidaza. 
Insulina este produsa de celulele pancreatice si eliberata sub actiunea a
numerosi stimuli. Eliberarea nu este continua, ci oscileaza (chiar si in cursul

3
digestiei) la 3-6 minute. Astfel, este impiedicat procesul de down-reglare a
receptorilor pentru insulina, fiind facilitata metabolizarea sa de catre ficat.
In celulele asupra carora actioneaza, insulina transmite un semnal de transductie a
carui consecinta este captarea si stocarea glucozei sub forma de glicogen de catre
ficat si muschi. Cand insulina lipseste sau se gaseste in organism in cantitate scazuta,
glucoza nu mai este consumata. Drept sursa de energie este folosit tesutul adipos.
Apare astfel diabetul zaharat tip I, dependent de aportul exogen de insulina.
Boala cronica provocata de marirea cantitatii de zahar in sange si in urina peste
normal. Glucoza provine din digestia alimentelor, iar pentru a putea patrunde in
celule, are nevoie de insulina, un hormon secretat de pancreas. Diabetul apare fie din
cauza productiei insuficiente de insulina de catre pancreas, fie mai ales datorita
insensibilitatii celulare la insulina. In ambele situatii nivelul glucozei din sange
depaseste valorile normale. Hiperglicemia poate duce la dehidratare si cetoacidoza.
Complicatii de termen lung includ probleme cardiovasculare, probleme renale,
probleme cu retina care poate duce la orbire, impotenta si gangrena cu risc de
amputare.
Diabetul zaharat este cauzat de o insuficienta sau o incetinire a secretarii
insulinei de catre pancreas, hormonul necesar utilizarii glucozei pentru a raspunde
necesitatilor energetice celulare. Aceasta forma de diabet afecteaza 4% din populatia
tarilor industrializate si are adesea un teren familial: intre 5 si 7% dintre copiii care au
avut un parinte diabetic risca sa faca boala. Cele doua tipuri principale de diabet sunt
diabetul insulinodependent si diabetul neinsulinodependent. In plus, se mai disting
diabetul zis gestational, care apare in decursul sarcinii, si diabetele zise secundare,
mai putin frecvente, care se manifesta in decursul diferitelor afectiuni (pancreatita
cronica, hemocromatoza, acromegalie, sindromul lui Cushing, feocromocitom), sau al
tratamentelor medicamentoase (corticosteroizi), sau legate de un anume tip de
subnutritie (diabetul tropical). 

Obtinerea insulinei cu ajutorul bacteriilor, mai precis prin intermediul

Escherichiei Coli, prezinta, fata de cea obtinuta prin extractie din pancreasul animal,
avantajul ca nu induce retinopatii, nefropatii. Totodata, nu are potential alergen. Are
aceleasi proprietati ca si insulina umana pancreatica, fiind cea mai pura insulina
existenta pe piata farmaceutica pana in prezent.  Mai mult, studiile clinice au aratat ca
este mai eficienta decat insulina umana.
Exista in prezent doua procedee de obtinere a insulinei prin tehnologia clonarii
genelor. Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare celor doua catene ale
insulinei, sintetizate chimic, iar al doilea, pe clonarea ADN complementar
corespunzator proinsulinei. In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E. coli.
4
 Toate tehnologiile de biosinteza care folosesc microorganisme manipulate
genetic au probleme cu stabilitatea mutantului, deoarece toti mutantii sunt instabili,
iar dupa un anumit numar de multiplicari revin la forma parenterala. Problema
stabilitatii devine esentiala atunci cand se lucreaza in flux continuu sau cu volume
mari. In cazul utilizarii E. coli, aceasta genereaza 60 de cicluri de viata in care
produce insulina, fiind capabila sa produca 12 000 L de mediu de cultura.

a) Obtinerea insulinei umane .

Din 60 de milioane de diabetici, circa 4 milioane necesită un tratament cu
insulină. În 1916, E. Sharpy-Schafer a descoperit că insulina este secretată de celule
care alcătuiesc insulele Langherhans din pancreas, ceea ce l-a determinat să
numească hormonul insulină. În 1921, F. Banting si H. Best, la Toronto, au izolat
din pancreasul de câine, hormonul insulină, demonstrând actiunea lui antidiabetică. În
1923, firma farmaceutică americană „Eli Lilly” pune deja în vânzare prima insulină
animală (în prezent, pentru a obtine circa 100 grame de insulină, este nevoie de 800
kg de pancreas de bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de 200-250
grame)).
Insulina umană este alcătuită din două catene polipeptidice A si B,compuse
respectiv din 21 si 30 de aminoacizi, a căror secventă a fost stabilită în 1955 de F.
Sanger. În perioada 1963-1965, trei grupe de cercetători (americani, germani si
chinezi) au reusit sinteza artificială a insulinei prin intermediul a 170 de reactii
chimice, lucru ce făcea imposibilă producerea insulinei pe cale industrială.
Noile tehnologii industriale de obtinere a insulinei umane au fost posibile odată
cu extragerea genei insulinei (W. Gillbert si colaboratorii săi, 1980) si crearea
moleculelor recombinate de ADN în baza plasmidelor.

Plasmidul —> Restrictia cu Eco Ri —> ADN ligaza (gena reglatoare, gena
insulinei) —> transformarea (in E.coli) —> translatia —> insulina.

Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în colibacili (Escherichia

coli), unde are loc realizarea informatiei genetice codificate în molecula de ADN.
Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizează si insulina. Pentru a proteja
insulina umană (ea nu este proprie colibacililor si este distrusă de enzimele
bacteriene), în molecula recombinată de ADN se încadrează, pe lângă gena insulinei,
si o genă reglatoare care codifică o proteină specifică colibacililor (de exemplu
galactozidaza). Ca rezultat al manifestării informatiei genetice a moleculei
recombinate de ADN, se obtine o catenă polipeptidică hibridă, din care mai apoi se
separă insulina.

Datorită utilizării tehnologiei ADN-ului recombinat, se obtin aproximativ 200

5
grame de insulină de pe 1 m3 de mediu de cultură, adică tot atâta cât se poate extrage
din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc.

Probele clinice efectuate cu insulina umană, produsă prin tehnici de inginerie

genică, au demonstrat că ea nu are efecte secundare si că poate fi comercializată,
adică folosită la tratare bolnavilor de diabet.

Bazele tehnico - materiale ale ingineriei genetice

Datorită cercetărilor de genetică moleculară, a fost posibilă cunoasterea
structurii de profunzime a unor gene si genomuri, fapt ce a condus la elaborarea
tehnologiei ADN-ului recombinat si la transferul de gene peste barierele de specie.
Tehnica recombinării genetice în vitro include trei etape principale:

1) extragerea sau sinteza chimică a ADN-ului din diferite specii;

2) construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN;

3) reintroducerea moleculei recombinate de ADN într-o celulă vie pentru

reproducerea si expresia ei .

Etapele principale ale ingineriei genice.

1. Extragerea ADN-ului se produce utilizându-se o serie de enzime

specifice, în primul rând, cele de restrictie, capabile să rupă molecula de ADN în

anumite locuri. Enzima de restrictie extrasă din Escherichia coli Eco RI recunoaste
următoarea secventă de nucleotide:

G↓ AATTC

CTTAA↑G.

Restrictazele reprezintă instrumentul de bază al ingineriei genetice,

deoarece au capacitatea unică de a tăia molecula de ADN în anumite sectoare (loci).

Prima restrictază a fost obtinută din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul α si
se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 si cartarea lui (Kelly,
Smith, 1970).

Nu toate restrictazele se utilizează în ingineria genică, ci doar acele care au

6
următoarele proprietăti:

 pot tăia molecula de ADN în fragmente discrete;

 posedă o specificitate de actiune înaltă (taie molecula de ADN într-o anumită

succesivitate – „site”-ul de recognitie);

 pot forma, în rezultatul restrictiei, „margini lipicioase” la capetele

fragmentului de ADN (această proprietate nu este caracteristică tuturor
restrictazelor);

 pot fi izolate relativ usor în stare pură din mediul incubational.

La repartitia ADN-ului este implicată ADN-ligaza, care poate lega unele

fragmente de restrictie. Acestea si alte enzime stau la baza obtinerii moleculelor

recombinate de ADN.

Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizati vectorii

(moleculele speciale de ADN ce transferă informatia genetică dintr-o celulă în alta),

reprezentati prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial si ADN
cloroplastic.

Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informatiei străine în

celulele (organismele) – gazdă, trebuie să corespundă următoarelor cerinte:

 inofensivitatea vectorului;

 multiplicarea rapidă în celula-gazdă si lipsa posibilitătilor de multiplicare în

celulele altor organisme;

 prezenta unui număr restrâns de situri de recognitie;

 prezenta genelor marker pentru selectarea de clone după moleculele

recombinate de ADN;

 izolarea relativ usoară, clonarea si expresia în celulele (organismele) străine.

În calitate de vectori, plasmidele au căpătat o răspândire deosebită.

Plasmidele reprezintă niste molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot
exista autonom si determină unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de
7
conjugare, rezistenta la antibiotice, agresivitatea.

Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie să posede un număr restrâns de

regiuni sensibile la actiunea enzimelor de restrictie. În acest caz, se poate realiza
ruperea si apoi insertia de ADN exogen în plasmid.

Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat
„pSC 101”, realizat de S. Cohen (1973).

2. Obtinerea moleculelor recombinate de ADN:

A) – metoda ligazică; B) – metoda terminală.

Ca vector plasmidic, la plante se foloseste plasmidul Ti (Tumour inducing)

de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care conditionează formarea tumorilor pe

tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate.

A doua tehnică de introducere a unei gene într-o bacterie foloseste ca

vector un bacteriofag (fagul leambda – λ), al cărui genom (10-50 gene) integrează
gena străină. Ea se va sintetiza întocmai ca si celelalte gene ale virusului, dacă acesta
din urmă se va replica în celula bacteriană.

Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regulă,
virusul tumoral SV-40 si virusul papiloma bovin (BPV). Se crede că vectorii virali
vor putea fi utilizati si la plante.

Un tip particular de vectori reprezintă liposomii, picături foarte mici de

lipide produse artificial, în care pot fi incluse gene, precum si diferite medicamente,
enzime etc.

Genomul mitocondriilor si cloroplastelor, este similar celui bacterian si, ca urmare, se

crede că el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote.

Celulelor utilizate în experimentele ingineriei genice le sunt înaintate o

serie de cerinte care au menirea de a asigura securitatea investigatiilor stiintifice.

Conform „Regulilor despre molecule recombinate de ADN” celulele-gazdă trebuie să

satisfacă următoarele cerinte:

 capacitatea sporită de implicare în investigatiile stiintifice;

8
  incapacitatea de sinteză a anvelopei protectoare în afara laboratorului;

 capacitatea lizării ADN-ului său în afara laboratorului;

 imposibilitatea transferului informatiei ereditare altor organisme;

 imposibilitatea poluării mediului înconjurător în rezultatul transformării

si/sau transfectiei.

În prezent, de rând cu E. coli, în calitate de obiecte de studiu (celule

gazdă), se utilizează bacilul fânului (Bacillus subtilis), celulele de drojdii, culturile de

celule si tesuturi vegetale si animale, culturile de protoplasti.

După obtinerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate în celulele

(organismele) procariote sau eucariote pentru functionarea lor ulterioară (replicarea si
transmiterea informatiei ereditare).

De mentionat că, în cazul operării cu genele organismelor eucariote, genele

eucariotelor superioare, de regulă, nu se manifestă în celulele procariote, iar genele

eucariotelor inferioare se manifestă doar partial. Iată de ce, în aceste experimente se
acordă o

deosebită atentie directiei transferului de informatie ereditară a moleculelor

recombinate, adică: de la celula procariotă în celulele pro- sau eucariote si invers, de
la celula eucariotă în eu- sau procariote.

Moleculele recombinate ale procariotelor functionează usor în celulele

procariote (în calitate de repliconi).

Sunt descrise si cazuri de functionare a genelor procariotelor în celulele eucariotelor.

K. Merril si colab. (1971), In. Hors si colab. (1975) au demonstrat posibilitatea

transferului genei β-galactozidazei din E. coli în fibroblastele umane ale unui bolnav
de galactozimie cu ajutorul fagului (galactozimia este o boal ă autozomială recesivă
ce provoacă dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei 1-D-galactozo-1-
fosfaturidiltransferazei).

Expresia genelor eucariotelor în celulele procariote, de asemenea, este posibilă. Devis

(1976) a transferat gena histidinei drojdiilor în E. coli cu ajutorul fagilor. Astăzi se
obtin pe scară largă produse ale organismelor eucariote în baza bacteriilor (hormoni,
interferoni etc.).
9
 Informatia ereditară străină (a moleculei recombinate), care pătrunde în
Celula (organismul) gazdă, este protejată pe diferite căi:
 metilarea ADN-ului (virusurile);
 transferul moleculei liniare de ADN în formă circulară (fagul λ);
 blocarea sistemului de restrictii al celulei-gazdă (fagul T3);
 actiunea restrictazelor.

În acelasi timp, celula-gazdă îsi protejează informatia ereditară prin diferite

mecanisme:
 actiunea restrictazelor specifice;
 metilarea ADN;
 actiunea vecinătătii epigenetice;
 actiunea nespecifică a nucleazelor celulare;
 protectia mecanică prin membranele celulare;
 actiunea proteinelor histonice si nehistonice;
 actiunea interferonului.

10