Planul cursului

SPECTROSCOPIA DE FLUORESCEN

(FLUORESCENCE

SPECTROSCOPY - FS)

SPECTROSCOPIA DE CHEMILUMINISCEN

(CHEMILUMINESCENCE SPECTROSCOPY)
DIFRACTIA CU RAZE X

SPECTROSCOPIA DE FLUORESCEN FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (FS) Analiza de fluorescen este o metod care const n msurarea luminii emise de moleculele unei substane supuse fenomenului de excitare (prin absorbie) cauzat de o radiaie incident. O molecul poate fi excitat din starea electronic fundamental ntr-o alt stare prin absorbie de energie. Multe molecule sunt capabile s emit aceast energie sub form de radiaie, astfel ntorcndu-se n starea fundamental. Radiaia emis se numete fluorescen. Starea electronic fundamental este un singlet (singletul fundamental). Procesul de excitare conduce la tranziia unui electron de pe un orbitalul al starii fundamentale pe orbitalul neocupat cel mai sczut al singletului excitat.

O molecul n starea de singlet S excitat poate s se ntoarc la singletul fundamental prin emiterea de radiaii i execut o tranziie radiativ permis. Lumina emis se numete fluorescen. Dac aceast tranziie este permis, timpul de via al singletului excitat este extrem de sczut, de ordinul 10-8 sec. Aceasta nseamn c fluorescena nceteaz dac sursa de excitaie este ntrerupt. Strile electronice menionate sunt redate n figura de mai jos.

Dac excitarea moleculelor se face cu radiaii luminoase din domeniul UV sau VIS acestea emit radiaiile primite n totalitate sau parial. Maximul emisiei unui compus fluorescent este situat la o lungime de und mai mare dect cea corespunztoare maximului de absorbie. Intensitatea fluxului luminos descrete atunci cnd excitaia nceteaz. Spectrele de fluorescen i cele de excitaie pot fi considerate imagini n oglind.

APARATURA Msurarea intensitii fluorescenei se face cu ajutorul spectrofluorimetrelor.

APLICAIILE SPECTROSCOPIEI DE FLUORESCEN

Aplicaii calitative Fluorescena prin selectivitatea sa (o singur maximal i de emisie pentru fiecare molecul ntr-un solvent definit) este un instrument spectroscopic puternic pentru identificarea moleculelor substanelor medicamentoase. Aplicaii cantitative Marea sensibilitate a metodei justific aplicaia foarte larg n domeniul determinrilor cantitative ale medicamentelor. Pot fi luate n consideraie dou cazuri:
a) determinarea cantitativ a medicamentelor fluorescente; b) determinarea cantitativ a medicamentelor fluorescente prin reacii chimice (derivatizare).

a) Determinarea cantitativ a medicamentelor fluorescente

Se poate lua n considerare fluorescena nativ a unor compui ca: hidrocarburi aromatice, chinoleine, tetracicline, chinina i derivaii si.
b) Determinarea cantitativ a medicamentelor devenite fluorescente prin reacii chimice

Relativ puine molecule de interes farmaceutic prezint o fluorescen nativ. Progresele farmacocinetice au incitat analitii s dezvolte reacii chimice care s permit o detecie fluorimetric sau pentru dozri directe, fie pentru detecia n cromatografia de lichide. Numrul i varietatea reaciilor exclud un catalog exhaustiv i din acest motiv prezentm cteva exemple.

- Derivarea prin reacii chimice ce implic reactvi nefluoresceni Apariia fluorescenei se poate datora ciclizrii suplimentare ce favorizeaz delocalizarea electronic: Vitamina B6 (piridoxalul)

Vitamina B1 (tiamina) - reacia tiocromului

- Derivarea prin reacie cu un cromofor fluorescent

Acest tip de reacie tinde s nlocuiasc reaciile precedente care au inconvenientul de a modifica n totalitate structura moleculei de dozat. In farmacocinetic conservarea integritii moleculei este o necesitate mai ales n studiul metabolismului. Dezvoltarea metodelor cromatografice de lichide justific intensitatea cercetrilor n materie de markeri fluoresceni. Procedeul se aplic pentru: -amino-acizi (sunt derivatizai cu corur de dansil i ortoftalaldehida; - acizi i alcooli cu caten scurt.

Markerii fluoresceni introdui pe molecula unui acid sau alcool nefluorescent contribuie la transformarea acestora n molecule fluorescente. - 3-brommetil,6,7-dimetil-cumarina

- hidroximetilantracenul

- reacia Hantzsch (condensarea acetilacetona n prezena amoniacului)

formaldehidei

cu

SPECTROSCOPIA DE CHEMILUMINISCEN CHEMILUMINESCENCE SPECTROSCOPY Desemneaz emisia de lumin ce nsoete desfurarea unor reacii chimice. Aceste reacii se caracterizeaz prin producerea unei specii moleculare fluorescente ntr-o stare electronic excitat care revine la starea fundamental prin emisia unui foton. Dup descoperirea sa, la sfritul sec. al XIX-lea acest fenomen a rmas mult timp o curiozitate de laborator. Aplicaiile analitice nu au aprut dect la nceputul anilor 60 i de atunci au cunoscut o dezvoltare riguroas datorit proprietilor eseniale ale metodei: sensibilitate i selectivitate. Sensibilitatea se explic prin progresul tehnologiei fotomultiplicatoarelor ct i prin calitile inerente chemiluminiscenei comparativ cu flurescena, concurenta sa direct.

Reacii de chemiluminiscen
Luminolul

Luminolul (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) i analogii si sunt chemiluminisceni n mediu alcalin i n prezena unor oxidani. Mediul poate fi apos sau organic (DMSO). Specia responsabil de emisie este dianionul ftalat, ce produce o lumin albastr. Aceast reacie este catalizat de numeroase metale, complecii lor i de metaloproteine.

Lucigenina

Lucigenina (dinitrat de N,N-9,9-dimetilbisacridin) i analogii si, n mediu alcalin i n prezena apei oxigenate, sau din contr, n prezen de reductori, conduce la emisia de lumin albastr sau verde, funcie de solveni prin intermediul N-metilacridonei.

Siloxenul Este un polimer pe baz de siliciu al crui monomer este Si6H6O3 i posed o structur ciclic cu 6 atomi de siliciu (2D-poli[1,3,5-trihidroxociclohexasilan]) Siloxenul este un reductor puternic, prin intermediul legturilor sale Si-Si care pot fixa oxigenul sau clorul molecular ca i apa sau NH3, cu eliberare de hidrogen. Oxidarea siloxenului cu unii ageni ca peroxidul de hidrogen sau KMnO4, n soluie acid este nsoit de o chemiluminiscen intens a crei culoare depinde de condiiile experimentale.

Peroxioxalatul

Numeroi derivai ai acidului oxalic (cloruri, esteri, amide) n prezena H2O2 conduc la peroxioxalat, intermediar instabil cu o energie mare. Acesta furnizeaz un complex cu fluoroforii uor oxidabili prin transfer de sarcin. Apoi, ruperea peroxioxalatului furnizeaz fluoroforul excitat (fluorofor*) care revine la starea iniial cu emitere de lumin.

Ali derivai ai acidului oxalic: - TCPO - bis(2,4,6-triclorfenil)oxalat

- ester difenil oxalic ( Cyalume)

Mecanism: Ester oxalic + H2O2 Intermediar(I) + produi Intermediar(I) + Fluorofor(F) Fluorofor*(F*) + produi Fluorofor* Fluorofor + h (lumin)

APLICAIILE CHEMILUMINISCENEI Aplicaii n titrimetrie

Titrimetria acido-bazic Titrimetria redox Aplicaii n spectroscopie Determinarea metalelor Chemiluminiscena n cromatografia de lichide Chemiluminiscena n gaz-cromatografie

DIFRACIA RAZELOR X

X-RAY DIFFRACTION (XRD)

Radiaiile electromagnetice cu lungimi de und cuprinse ntre 10 0,01 nm, 10-8-10-6 cm, corespunznd frecvenelor de ordinul 30 30000 PHz (petahertz=1015 hertz) sunt cunoscute sub denumirea de raze X. Metodele de analiz care folosesc razele X se bazeaz pe 3 fenomene distincte: emisia, absorbia i difracia. Razele X sunt produse prin accelerarea electronilor din stratul profund al atomului unor metale int cu un foton incident de nalt energie (stratul K).

Astfel se emite energie la diverse lungimi de und (K): molibden (0,07 nm), crom (0,23 nm), cupru (0,15 nm), cobalt (0,18 nm). Difracia razelor X Este fenomenul care se produce atunci cnd un fascicol de radiaii X trece printr-un mediu. Un fascicul de raze X paralel, monocromatic, este refractat de ctre straturile succesive de atomi dintr-un cristal A, B, C, D.

Din analiza figurii se constat c acest cristal acioneaz ca o reea format din planuri paralele (planuri Bragg), echidistante (d=constanta reticular), formate din atomi sau ioni. Dac razele reflectate de pe planuri diferite se ntlnesc, pentru ca s se amplifice, vorbim de reflexie Bragg i se obine o imagine de difracie. Intrirea undelor are loc cnd raza R1 reflectat ntlnete raza R2 reflectat astfel c diferena de drum parcurs de raza R2 s fie un multiplu ntreg (n) al lungimii de und. n acest caz: Legea lui Bragg exprimat prin ecuaia de mai sus se utilizeaz la determinarea constantei reticulare, a dimensiunilor celulei elementare i, cunoscnd densitatea corpului la determinarea greutii moleculare. Nu exist dou substane n stare cristalin n care distana dintre planurile de reflexie s fie identic n toate direciile. Aadar, aeznd un cristal n toate unghiurile posibile fa de fasciculul de raze X, se obine o imagine caracteristic.

Imaginea unei difractograme

APARATURA Se folosesc spectrometre de tip Bragg, a cror componente i funcionare este redat mai jos:

DETECTORI: - plci fotografice; - photostimulable phosphors (psps); - contor Geiger.

APLICAIILE DIFRACIEI RAZELOR X

Identificarea compuilor medicamentoi - morfina i heroina -Furosemid Identificarea amestecurilor Cocain 10% Cocain 50% Maltoz -------Pantotenat de calciu Vitamina B-12 Clorhidratat de tiamin Cercetarea structurilor polimorfe Determinarea structurii cristaline a proteinelor