Tehnici de nsmnare a

prelevatelor pe medii de cultura

lichide i solide; dispersii

Plci Petri

Cultivarea bacteriilor nseamn creterea acestora n

condiii de laborator, pe medii de cultur, care s permit i
multiplicarea lor.
Mediul de cultur: reprezint totalitatea substanelor
nutritive care permit creterea i multiplicarea bacteriilor n
laboratorul de microbiologie.

Un bun mediu de cultur trebuie s satisfac urmtoarele

cerine:
1. S asigure cantiti optime de ap i substante nutritive
necesare creterii i multiplicrii microorganismelor;
2. S asigure sursa de carbon i energie (compui organici polizaharide, proteine, lipide);
3. S asigure sursa de azot necesar biosintezei acizilor
nucleici i a proteinelor (azotai, azotii, aminoacizi,
peptone);
4. S conin sruri minerale, cu rol n meninerea echilibrului
ionic al celulei (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+);
5. S asigure condiii de aerobioz sau anaerobioz;
6. S aib un pH corespunztor (de obicei ntre 7,2-7,4;
excepii: Vibrio cholerae = 9,00 9,2, levuri si mucegaiuri =
5-6);
7. S fie steril.

Agarul
Introdus de ctre Walther Hesse i soia sa,
Fanny Hesse (amndoi lucrau cu Robert Koch n laboratorul su)
Utilizat pentru prepararea mediilor solide
Obinut din alge
Fr valoare nutritiv
Nu este afectat de nmulirea bacteriilor
Se topete la 98oC i se stabilizeaz la 42oC
Mediile solide conin 2% agar

Clasificarea mediilor de cultur se poate realiza:

1. dup consisten:
lichide
solide
semisolide
2. dup compoziia substanelor nutritive:
medii naturale: conin substane nutritive (SN) prezente
n natur, care nu necesit o prelucrare prealabil: oul,
laptele, serul sanguin, bila, etc.
medii artificiale: se elaboreaz n laborator pentru
cultivarea microorganismelor.

Placa Petri cu agar 2%

Medii artificiale
medii de baz (MB)
lichide - bulionul simplu (zeam de carne de vit, 1%
pepton, 0,5% NaCl, ap), apa peptonat (AP-1% pepton,
0,5% NaCl, ap)
solide - geloza simpl (2% agar-agar pt. ntrirea mediului,
restul - componenii bulionului simplu)

https://www.youtube.com/watch?v=OljTdYH_Wtg
Preparare + sterilizare mediu agar

https://www.youtube.com/watch?v=cneascR3OEc
Mediu gar f bun si rapid

Blood agar

Chocolate agar

6. medii selective i difereniale - selecteaz un grup de bacterii pe

care le difereniaz pe baza unor caracteristici biochimice; conin o
substan ce inhib flora de asociaie (ex. NaCl sau o sare biliar) i un
zahr sau un alcool polivalent care este sau nu folosit de bacterie,
schimbnd pH-ul mediului, fapt vizualizat cu ajutorul unui indicator. Se
folosesc mai des indicatorii rou fenol (RF), rou neutru (RN) i albastru
de bromtimol (ABT). Culoarea indicatorilor difer n funcie de pH.
Comportamentul indicatorilor la diferite pH-uri:
indicator/pH

Alcalin

Neutru

Acid

RF
(rosu fenol)

rou

portocaliu

galben

RN
(rosu neutru)

galben

portocaliu

rou

ABT
(albastru de
bromtimol)

albastru

verde

galben

Mediu cu ureaz

Alte medii selective

Mediul Mac Conkey pentru bacteriile Gram
negative
TCBS agar (thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose
agar)
agar pentru V.cholerae
Mediul LJ (LwensteinJensen)
(LwensteinJensen M. tuberculosis
Mediul Wilson Blair Salmonella typhi
Mediul cu telurit de potasiu Diphtheria bacilli
Mediul EMB (eosin methylene blue)
blue E. Coli,
Citrobacter, Enterobacter

Yellow coloured colonies of Vibrio

cholerae on TCBS agar.

Colonii bacteriene pe diferite medii difereniale

15

nsmnarea nseamn punerea n contact a produsului

patologic cu mediul de cultur n scopul cultivrii bacteriilor.
Din fiecare bacterie ajuns pe mediu se va dezvolta o colonie, vizibil cu
ochiul liber, de aceea bacteria se numete i Unitate Formatoare de Colonii
(UFC).
Toat colonia este format din urmaii aceleai bacterii (clon).
Dac pe mediu vor aprea colonii identice, vom vorbi de o cultur pur (CP),
iar dac vor fi mai multe tipuri de colonii, cultura va fi mixt.
Scopul cultivrii este obinerea CP, pentru care folosim o metoda de izolare,
replicnd o singur colonie pe un alt mediu de cultur.

Metode de nsmnare:
1. pe suprafaa mediilor solide:
prin epuizare, pe toat suprafaa mediului - pentru a
obine colonii izolate,
n sector, n triunghiuri - pentru pstrarea mai multor
tipuri de bacterii pe acelai mediu
2. n profunzime: prin nepare, nglobare,
3. n medii lichide: cu acul, seringa, ansa de platin.

https://www.youtube.com/watch?v=0heifCiMbfY

Condiiile anaerobe pot fi create prin scderea potenialul de reducere a

oxigenului (redox), prin urmtoarele metode:
- Mediul Holman: bulion creier, bulion carne
- Bulion cu 0,1% tioglicat de Na, dextroz i albastru de metilen,
din mediul de cultur lichid se extrage oxigenul prin fierbere,
se nsmneaz dup rcirea mediului de cultur,
se sigileaz cu parafin sau vaselin steril.
Mediul srac n oxigen poate fi creat prin urmtoarele metode:
fizice:
-incubarea n aerostat a mediului de cultur timp de 24 de ore,
-nsmnare pe geloz nalt, n coloan.
chimice:
- Gas pack, Anaerocult, Anaerob-jar.
Principiul metodei este extragerea oxigenului i producerea CO2 n spaiul n care
se desfoar cultivarea.
Astfel se obine o atmosfer:
capnofil (bogat n CO2),
anaerob (lipsit de oxigen)
sau
microaerofil (srac n oxigen).

Anaerobic Culture Methods

Anaerobic jar

Anaerobic Culture
Methods

Anaerobic
chamber

Tehnici de nsmnare a mediilor de cultur

n mediul de cultur lichid
Pentru nsmnare ntr-un mediu lichid, folosim o ans, un ac sau tampon,
innd ansa ca un creion, cu mna dominant, iar mediul de cultur cu cealalt.
Scoatem dopul din eprubet cu ajutorul degetelor 4 i 5 de la mna
dominant.
Flambm orificiul de deschidere al eprubetei i introducem ansa/acul sau
tamponul n mediul lichid.
Flambm orificiul eprubetei din nou i introducem dopul.

nsmnare pe mediul de cultura solid

A. Pe suprafa:
n sector: efectuarea unui singur sector
Prin epuizare - aceast tehnic se aplic cel mai frecvent
1.Ansa de platin sterilizat se ncarc cu produs patologic. Insmnm pe o
treime a suprafeei mediului de cultur.
2. Dup arderea la rou a ansei, ntindem 2-3 linii paralele de pe sectorul
nsmnat.
3. Dup arderea la rou a ansei, ntindem cu o singur linie.
Principiul metodei const n epuizarea bacteriilor nsmnate pn la obinerea coloniilor
izolate, pentru a putea observa caracterele de cultur ale bacteriei izolate.

tehnica de nsmnare prin epuizare

B. n profunzime:
pentru bacteriile anaerobe
nepare cu acul, seringa.
nglobarea n mediul solid - topit n prealabil.

blood agar plate culture

Bacillus cereus.

Bacillus anthracis

E.coli on EMB

Shigella dysenteriae
on EMB

Caracterele de cultur ale bacteriilor: variaz n funcie de mediu (lichid,

solid).
Caracterele de cultur (CC) ale bacteriilor cultivate pe medii solide:
Morfologia coloniilor
La examinarea morfologic a coloniilor bacteriene, lum n considerare
urmtoarele:
mrimea coloniilor
forma
opacitatea
culoarea,
consistena
mirosul lor.
Marimea coloniilor (dimensiunile):
colonii mici ( < 1 mm)
colonii mijlocii ( ~ 1 mm)
microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul)
colonii mari ( > 2 mm)

Forma

Opacitatea: lucioase, mate.

Suprafaa: neted, bombat, plat, rugoas, mucoid,
pufoas, etc.
Culoarea: pigmentat, transparent.
Mirosul:
Pseudomonas aeruginosa: arom asemntoare florilor de iasomie
Proteus: ciocolat ars
Clostridii: fecaloid, de corn ars
Prevotella melaninogenica: acru
Nocardiile i streptomicetele: de subsol mucegit

Klebsiella, Streptocccus pneumoniae

Colonii pufoase - mucegaiurile

Fenomen de crare: la speciile
de Proteus

A fungal colony surrounded by bacterial colonies from dirty hands and house