Spectroscopia moleculară și

biomoleculară

Profesor coordonator: Mihali Cristina

Masterande: Rad-Petrici Manuela
Solomonean Dana
 O nouă metodă fluorimetrică de întoarcere pentru speciarea
rapidă a speciei Cr (III) / Cr (VI) în probele de ceai cu reactiv
fluorescent pe bază de rodamină

• O nouă metodă fluorimetrică cu agent fluorescent pe bază de rodamină a

fost dezvoltată pentru speciarea rapidă a Cr (III) / Cr (VI) în probele de ceai,
sol și apă.
• Reactivul reacționează instantaneu la temperatura camerei într-o manieră
stoichiometrică de 1: 1 la cantitatea de Cr (III). Selectivitatea acestui sistem
pentru Cr (III) față de alți ionii metalici este remarcabil mai mare, iar
sensibilitatea lor este sub 0,01 mg L-1 în soluții apoase, ceea ce permite o
simplificare fără pretratarea probei reale.
• Metoda are un interval liniar larg de 0,1-10 mg L-1 și o limită de detecție
de 0,15 μgL-1 pentru Cr (III), în timp ce deviația standard relativă a fost de
0,1% pentru concentrația de 0,1 mgL-1 Cr (III).
• Rezultatele din experimentele de detecție și recuperare a Cr (III) în ceai, sol
și apă au fost satisfăcătoare, ceea ce indică faptul că metoda are o
fezabilitate mai bună și un potențial de aplicare în determinarea și
specificarea de rutină a Cr (III) / Cr (VI).
 Introducere

• Metalele grele sunt definite ca elemente metalice care au o densitate

relativ mare în comparație cu apa.
• Poluarea ionică cu metale grele prezintă riscuri grave pentru sănătatea
umană și pentru mediul înconjurător.
• Din acest motiv, cererea de metode analitice rapide și fiabile pentru
determinarea diferitelor specii ale unui element în probele reale a crescut
rapid, deoarece în majoritatea cazurilor diferitele proprietăți biologice,
nutriționale sau toxicologice depind critic de forma chimică sau de starea
de oxidare
 Cromul
• Cromul (Cr) este un element natural prezent în crusta pământului, cu stări
de oxidare (sau stări de valență) cuprinse între crom (II) și crom (VI).
Compușii de crom sunt stabili în forma trivalentă [Cr (III)] și apar în natură
în această stare în minereuri, cum ar fi ferocromul.
• Contaminarea cu crom este larg răspândită și apare într-o varietate de
procese industriale, cum ar fi industriile metalurgice și chimice,
galvanizarea, refractările, pigmenții, industriile de bronzare, turnurile de
apă oxidativă și de răcire.
• Cromul este un "paradox" deoarece este clasificat atât ca fiind important
din punct de vedere biologic, cât și ca un pericol industrial toxic, în funcție
de starea sa de oxidare.
 Cr (III) și Cr (VI)

• Cr (III) este cunoscut ca fiind un factor terapeutic esențial implicat în

mecanismul de acțiune al insulinei, hormonul pancreasului și
metabolismului glucozei.
• Cr (III) se găsește în fructe, legume, carne, cereale și diverse alte alimente.
O deficiență a acestui nutrient poate duce la intoleranță la glucoză.
• Cr (VI) este cunoscut ca fiind cancerigen și mutagen.
• Este necesar să se controleze nivelul de Cr (VI) în apa de băut, unde
concentrațiile tipice de crom total sunt în intervalul 0,1-0,5 μg L-1
• Analiza de speciație a Cr, precum și determinarea acestuia, sunt foarte
importante pentru evaluările sale biologice, alimentare și, de asemenea,
de mediu.
• Există o mare varietate de tehnici disponibile pentru speciația de crom
dizolvat în probe reale. Acestea pot fi în mare parte împărțite în mai multe
categorii, și anume schimbul de ioni în cromatografie,
spectrometria,extracția solventului, voltammetria și coprecipitarea
 O nouă metodă fluorimetrică
• A fost propusă o nouă metodă de analiză a fluorescenței pentru detecția Cr
(III) / Cr (VI) în probe reale fără nici o etapă de preconcentrare / separare.
• Metoda de determinare a Cr (III) folosind ligandul fluorogenic 3 ' , 6'-bis
(dietilamino) -2 - {[(1E) - (2,4dimetoxifenil) metilen] amino} spiro [izoindol-
1,9'-xanthen] -3 (2H) utilizat pentru determinarea primară a Cr (III)
utilizând un sistem de fluorimetrie realizat la domiciliu
• De asemenea, proprietățile de legare Cr (III) ale BDAS, un reactiv pe bază
de fluorescență pe bază de turnare în apă, care prezintă selectivitate și
sensibilitate ridicată pentru Cr (III).
• Au fost optimizate condițiile de determinare și determinare în probele de
hrană, s-au efectuat interferențe ionice, limită de detecție, experimente de
recuperare și detectări reale de eșantioane pentru a evalua fezabilitatea
metodei.
 Materiale și metode
Aparatura:
• Măsurătorile prin fluorescență au fost efectuate într-un sistem de
fluorometrie fabricat la domiciliu echipat cu o lampă cu laser violet.
• Instrumentele parametrilor au fost controlați cu un program software.
• Pentru măsurarea valorilor pH-ului în soluțiile de probă a fost utilizat un
aparat de măsurare a pH-ului Nel Electronic PH900 (Istanbul, Turcia).
• Spectrele IR (400-4000 cm-1) ale moleculei au fost înregistrate pe un
spectrofotometru Perkin Elmer Model 298.
• Spectrele 1H și 13C RMN s-au măsurat cu un aparat Bruker AvanceIII
400MHz (Billerica, MA).
• Analizele chimice (S ppm) s-au înregistrat în câmpuri per milion (ppm) din
TMS (atribuite ca ppm zero)
• Puritatea compusului testat a fost determinată prin combustibil pe analize
elementare cu un analizor Leco932CHNS-Oelemental (Kalamazoo, MI).
Sistemul fluorimetric de uz casnic și
etapele de funcționare ale acestuia.
Reactivi și soluții standard
• Soluțiile stoc de Cr (III) (1000 mg L-1) au fost achiziționate de la Sigma.
• A fost folosită apă pură deionizată pentru prepararea soluțiilor stoc.
• Acidul hidrocloric, acidul sulfuric, etanolul și alți compuși chimici au fost
achiziționați de la Merck.
• BDAS a fost inițial sintetizat / caracterizat și utilizat ca un reactiv de
fluorescență pentru analiza Cr (III).
• O soluție de BDAS a fost preparată prin dizolvare 0,1 mg din reactiv într-un
balon cotat de 100 ml cu etanol.
• Pe tot parcursul studiului, s-au preparat următoarele soluții acide cu
ajustarea aciditatii probelor: acid clorhidric, acid azotic și acid sulfuric
(0,1-4 mol L-1).
 Sinteza compusului 2-amino-3',6'-bis
(dietilamino) spiro [izoindol-1,9'-xanthen]-3-(2H)

• Într-un balon de 250 ml s-a dizolvat rodamină B (1,25 g, 2,5 mmoli) si 50

ml etanol. Apoi, 2,5 ml hidrat de hidrazină 80% s-a dizolvat în 50 ml etanol
și s-a adăugat prin picurare la balonul de 250 ml de mai sus, cu agitare
viguroasă.
• Amestecul agitat a fost refluxat până când soluția a devenit portocaliu
deschis. Amestecul a fost apoi răcit și solventul a fost îndepărtat cu un
evaporator rotativ. Apoi, s-a adăugat 1 ml de L-l HCI (50 ml) la solidul din
balon pentru a genera o soluție roșie limpede și apoi s-a adăugat lent 1
mol L-1 NaOH (55 ml) cu agitare până când pH-ul soluției a ajuns la 9-10.
Precipitatul roz a fost colectat prin filtrare și spălat de trei ori cu 25 ml de
apă. După uscare într-o etuvă cu vid, reacția a produs 1,14 g (93,6%) RH
Structura chimică a reactivului BDAS
 Sinteza reactivului de fluorescență
BDAS

Les jeunes actifs ayant entre 18 et 25 ans,

• Un amestec dequi compus RH pas
n'étaient (1,14 g, 2,5 mmoli)
éligibles au RSAșiactivité à
2,4-dimetoxibenzaldehidă
moins d'être (0,40
parentg,isolé
2,5 mmoli) în etanol absolut(60 ml) a
ou de justifier
d'une
fost refluxat timp dedurée
24 ored'activité
pentru aprofessionnelle
se obține un precipitat roșu roz. Apoi,
minimale,
precipitatul a fost filtrat șipeuvent toucher
spălat de la cu
trei ori prime
multă etanol. Reziduul a fost
uscat pentru ad'activité
da compusuls'ils remplissent les conditions
BDAS cu randament 80% (1,20 g)
 Sinteza și caracterizarea complexului
Cr (III) -BDAS
• Complexul Cr (III) -BDAS a fost preparat prin condiții optime ale reactivului
BDAS și Cr (III) utilizând 1 mol L-1 de HNO3.
• O soluție de Cr (III)(1 ml L-1) dizolvată în EtOH (2 ml) a fost adăugată prin
picurare la o soluție de BDAS (3 ml 0,1% în EtOH) la temperatura camerei.
• Soluția purpurie a fost lăsată deoparte, astfel încât solventul să se evaporă
încet.
• Produsul purpuriu a fost format în câteva zile și pentru a elimina
impuritățile pe complexul Cr (III) -BDAS, el a fost spălat cu apă deionizată și
uscat în apă.
• Complexul a fost caracterizat prin studiul FT-IR.
Spectrele IR ale complexului BDAS și
complexului Cr (III) -BDAS
 Explicații
• Așa cum se poate vedea din figura 3, studiul FT-IR a arătat că frecvența
caracteristică de întindere a amidei "C=O" a fragmentului rodamină la
1684 cm-1 este deplasată la un număr mai mic de cavități (1666 cm-1) în
prezența de 1 equiv. din Cr (III). Această schimbare semnifică o polarizare
puternică a C=Ob pe legarea eficientă la ionul Cr (III) și, de fapt, indică
scindarea acestei legături. Aceasta indică faptul că deschiderea inelului
spirolactam în BDAS a avut loc în prezența Cr (III).
• Cr (III) -BDAS în etanol s-a bazat pe condiții optime și stoichiometria
complexului sintetizat a fost determinată prin metoda complotului lui Job.
Reactivul BDAS dă fluorescența maximă la 510,4 nm când se utilizează
sistemul fluorometric nou produs în casă, în timp ce complexul Cr (III) -
BDAS dă absorbanța maximă la 596,2 nm și complexul este de culoare
roz. Blocul de reactiv nu prezintă absorbție la această lungime de undă.
Intensitatea fluorescenței complexului față de fracțiunea molară de Cr (III)
a dat un grafic care indică formarea complexului având un raport Cr (III):
BDAS de exact 1-1, care a fost asumat prin utilizarea metodei moleratio
 Pregătirea probelor reale
• Eșantioane reale care au inclus cinci tipuri diferite de apă, și anume apă
de la Universitatea Erciyes și campusul Universității Bozok, apa de mare
din Marea Mediterană și Marea Neagră (Alanya și Zonguldak) și apa de
stocare (Yozgat) au fost colectate în sticle de chihlimbar. Probele de apă
au fost filtrate, cu excepția apei de la robinet, înainte de analize.
• Procedura prezentată pentru specierea speciilor Cr (III) și Cr (VI) pe baza
metodei fluorimetrice a fost aplicată la diferite probe reale. Apa de la
robinet, apa de mare și apa de stocare, solul și, de asemenea, diferite
probe de ceai au fost folosite ca probe reale.
• Probele de apă de la robinet au fost colectate de la laboratorul universitar
Erciyes și de la Universitatea din Bozok și au fost analizate fără pre-tratare.
Probele de apă de mare din Marea Mediterană și Marea Neagră (Alanya și
Zonguldak) și apa de stocare (Yozgat) au fost colectate în sticle de
polietilenă pre-spălate. Toate celelalte probe de apă au fost filtrate printr-
un filtru de membrană de celuloză (Millipore)
• O alicotă de 0,1 g din fiecare probă de ceai și de sol a fost tratată cu 10 ml
de HNO3 concentrat și apoi încălzită până când s-a obținut o soluție
limpede. Procesul a continuat până la evaporarea completă și s-au
adăugat încă 10 ml de HNO3 concentrat la umezeală. După aceea,
amestecul a fost complet evaporat și apoi s-au adăugat 2 ml de H2O2
concentrat.
• După terminarea procesului de dizolvare, soluția de probă a fost filtrată
printr-o hârtie de filtru din celuloză. Hârtia de filtru a fost spălată cu 1-2 ml
de 0,1 mol L-l HNO3. Filtratul a fost diluat la 25 ml cu 0,1 mol L-1 de
HNO3.. Volumul final de măsurare al soluțiilor de probă a fost de 5 ml.
• Din materialul de referință certificat (frunze de ceai INCT-TL-1), o cantitate
de 0,1 g de frunze de ceai a fost dizolvată într-un amestec de 10 ml de
HNO3 concentrat și 2 ml de H2O2 concentrat pe o placă fierbinte. După
terminarea procesului de dizolvare, toate soluțiile de probă au devenit
clare.
• Volumul probelor a fost diluat la 25 ml cu 0,1 mol L-1 de HNO3. Volumul
final de măsurare al soluțiilor de probă a fost de 5 ml. Concentrația Cr (III)
/ Cr (VI) investigată în soluția de măsurare finală a fost determinată de
sistemul de fluorimetrie realizat la domiciliu.
 Procedura generală pentru Cr (III)
• Metoda a fost testată în primul rând prin utilizarea soluțiilor model,
înainte de aplicarea pe eșantioanele reale.
• În condiții experimentale optimizate, alicote de 5 ml de soluție de probă,
care au fost ajustate la 0,1 mol L-1 HNO3 optim, conținând 0,1 mg L-1 Cr
(III), au fost plasate în tuburi de testare de 15 ml.
• S-a adăugat reactiv de fluorescență BDAS 0,1% în soluție de etanol și 1 ml
de soluție de dodecil sulfat de sodiu (SDS) 0,25% (greutate / greutate) la
soluția de probă.
• Soluția complexă Cr (III) -BDAS a fost formată în eprubeta.
• În această etapă, Cr (III) a reacționat cu reactivul BDAS și complexul
format.
• Apoi, volumul probei a fost diluat până la 5 ml utilizând 0,1 mol L-1 HNO3.
• Pentru a determina concentrația de Cr (III) în soluție, complexul a fost
introdus în sistemul de fluorometrie realizat la domiciliu.
• Semnalele Cr (III) au fost măsurate în modul de înălțime a vârfurilor
utilizând software-ul instrumentului. Graficul de calibrare a fost construit
față de standardele apoase prin utilizarea aceleiași proceduri.
 Rezultate si discuții
Efectul acidității:
• Intensitatea fluorescenței Cr (III) a fost maximă în jur 0,1 mol L-1 de HNO3,
în timp ce Cr (VI) nu a dat niciun semnal pentru reactivul BDAS. Aceste
rezultate arată că atât speciile de crom pot fi determinate cantitativ la 0,1
mol L-1 de HNO3. În toate studiile ulterioare pentru separarea /
specifcarea ionilor Cr (III) / Cr (VI), 0,1 mol L-1 de HNO3 a fost utilizat ca
optim. Prin urmare, aciditatea sistemului care ar da formația maximă
complexă a fost studiată prin măsurarea intensității fluorescenței Cr (III) /
Cr (VI) -BDAS în 0,1 mol L-1 de HNO3
 Efectul surfactantului
• Agentul tensioactiv, dodecil sulfat de sodiu (SDS), a fost utilizat pentru a
schimba intensitatea fluorescenței complexului Cr (III) -BDAS.
• S-a observat că SDS a schimbat vârful maxim de fluorescență al BDAS
singur în comparație cu complexul. Deplasările pot reprezenta o
solubilizare mai mare a BDAS în prezența SDS comparativ cu complexul.
Aceste rezultate indică faptul că solubilizarea favorabilă este adusă de
surfactanți neionici. De-a lungul studiului, cantitatea de SDS utilizată a fost
de 1 ml SDS 0,25%.
 Efectul timpului asupra complexării
• Sa studiat, de asemenea, influența timpului de complexare în metoda
fluorimetrică a Cr (III) și Cr (VI) utilizând reactivul BDAS. Efectul timpului de
complexare a fost studiat în intervalul 0-180 min, în timp ce celelalte
condiții experimentale au rămas constante.
• Rezultatele obținute au indicat că timpul de complexare nu a avut un
impact semnificativ asupra eficienței complexării.
• Complexarea lui Cr (III) cu BDAS este o reacție foarte rapidă, prezentând
un semnal de luminiscență mare, în timp ce Cr (VI) nu a dat niciun semnal
cu BDAS. Timpul de complexare optimă a fost atribuit timp de 0,5 minute
în studiu.
 Efectul valorii BDAS
• Efectul cantității de reactiv de fluorescență complexă (BDAS) 0,1% (g / v)
asupra eficienței de recuperare a metodei fluorimetrice pentru
determinarea Cr (III) și Cr (VI) a fost investigat pentru cantități de
reactivare de la 0,0 la 4,0 mg.
• Rezultatele au arătat că semnalele Cr (III) au crescut brusc până la 2,5 mg
de reactiv și au dat vârful maxim în jurul a 2,5 mg BDAS. Apoi semnalul Cr
(III) a scăzut brusc după 2,5 mg, în timp ce Cr (VI) nu a dat niciun semnal
pentru nici o concentrație de BDAS.
 Efectul temperaturii asupra complexării
• Sa studiat, de asemenea, efectul temperaturii (interval: 0-50 ° C) asupra
formării complexului Cr (III) -BDAS.
• Creșterea temperaturii de reacție de la 0 la 10 ° C nu a afectat semnificativ
semnalul; spre deosebire de temperaturi mai mari de 20 ° C, s-a observat
o intensitate fluorescentă scăzută în soluțiile de probă. Acest efect negativ
cauzat de temperatură poate fi probabil datorat termocoagulării soluției
de probă, formarea unui precipitat care ar putea încorporează complexul,
interferând cu el în mediul de eșantionare.
• Temperatura optimă a fost aleasă ca 10 ° C.
 Efectul interferențelor
• Efectul interferențelor asupra determinării celor două specii de crom (Cr
(III) / Cr (VI)) a fost investigat utilizând metoda optimizării metodei
fluorimetrice de specie.
• Ionii metalici interferenți posibili s-au adăugat individual soluțiilor model
conținând 0,5 mg L-1 din ambii ioni Cr (III) și Cr (VI) și apoi s-a aplicat
procedura propusă.
• Efectul fiecărei specii interferante a fost considerat drept interferență
atunci când semnalul analitic în prezența speciei a dus la o abatere de
absorbție mai mare de ± 5%.
• Rezultatele indică faptul că diferitele substanțe prezente în probe de apă și
/ sau apă reziduală nu interferează în analiza acestor două specii de crom
în condițiile experimentale.
 Concluzie
• Metoda propusă a fost aplicată pentru analiza ionilor de crom în
diferite probe de ceai, sol și apă și s-a constatat că prezintă o limită
scăzută de detectare.
• .Avantajul utilizării BDAS ca ligand fluorogenic pentru analiza
cromului este acela că prezintă proprietăți luminiscente atractive.
• acest nou sistem fluorimetric de uz casnic minimizează timpul de
analiză și forța de muncă necesară în laboratoare în comparație cu
alte sisteme off-line și on-line.
• Metoda propusă ar putea fi utilizată pentru analizele de rutină în
laboratoarele clinice pentru tratarea termică a Cr (III) în lichide
apoase sau biologice.