PCR

The PCR Song

Denaturing, annealing, and extending.

Well it’s amazing what heating and cooling and heating
There was a time when to amplify DNA,
will do.
You had to grow tons and tons of tiny cells.
Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
PCR, when you need to detect mutations.
Said you can amplify in vitro just as well.
PCR, when you need to recombine.
(repeat chorus)
Just mix your template with a buffer and some
PCR, when you need to find out who the daddy is.
primers,
PCR, when you need to solve a crime.
Nucleotides and polymerases, too.
(http://www.cnpg.com/video/flatfiles/539/ )
 Kary Banks Mullis (Cetus
Corporation) a creat metoda de
amplificare a ADN prin reacția de
polimerizare în lanț (1983-1985),
pentru care a primit Premiul Nobel
(1993).

Kary Mullis
(www.wikipedia.org)

(www.slideshare.net)
 Reacția de polimerizare în lanț (PCR)
este varianta in vitro a sintezei de ADN ce se
petrece in vivo, bazându-se pe denaturare,
renaturare (annealing) si cataliză enzimatică
pentru a amplifica mici cantități de acizi
nucleici.
 Componentele reacției PCR

1. Secvența țintă
segment al unei catene de acid nucleic ce conține locusul de
interes (ex. genă, element reglator, punct de rupere etc), de
lungime variabilă ( 30 kb)

5‘ TAGCAAGGCTCAGTGCTCGA Secvența țintă AGGTCGATTGGTTGGACGGA 3‘

3‘ ATCGTTCCGAGTCACGAGCT TCCAGCTAACCAACCTGCCT 5‘

Secvență cunoscută Secvență cunoscută

 Componentele reacției PCR

2. Primeri
- oligonucleotide (12-30 pb) cu complementaritate de
secvență față de regiunile ce flanchează secvența țintă

5‘ TAGCAAGGCTCAGTGCTCGA Secvența țintă AGGTCGATTGGTTGGACGGA 3‘

3‘TCCAGCTAACCAACCTGCCT 5‘
Forward Reverse
5‘ TAGCAAGGCTCAGTGCTCGA 3‘
3‘ ATCGTTCCGAGTCACGAGCT TCCAGCTAACCAACCTGCCT 5‘

(F: 5' TCCGTCCAACCAATCGACCT 3'

 Componentele reacției PCR

3. Deoxinucleotide trifosfat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)

- monomerii incluși în noua catenă ADN

(www.slideshare.net)
(www.slideshare.net)
Componentele reacției PCR
4. ADN polimeraza Taq
- izolată din Thermus aquaticus (1965)
- activitate catalitică optimă la 75-80°C
- t½ de 40 min la 95°C
- poate replica 1000 pb în mai puțin de 10 min
la 72°C

(www.wikipedia.org)
 Componentele reacției PCR

5. Tampon de reacție
- asigură mediul chimic adecvat pentru activitatea
optimă a ADN polimerazei
- conține cationi divalenți (Mg2+, Mn2+) sau
monovalenți (K+)

6. Apă fără nucleaze

 Etapele reacției PCR
1. Denaturare inițială
2. Denaturare
3. Atașarea primerilor
(annealing)
4. Elongare
5. Elongare finală

6. Păstrarea probelor la (www.slideshare.net)

temperatură scăzută
 ciclul 4
gena țintă
ciclul 3

ciclul 2

ciclul 1 ciclul 35
ADN matriță

22= 23=
235 ~ 34,3 miliarde copii
4 copii 8 copii 16 copii 32 copii

(www.slideshare.net)
 Vizualizarea rezultatelor

(www.slideshare.net)

1h, 80 V
 Tipuri de PCR
• AFLP PCR • Methylation-specific PCR
• Allele-specific PCR • Miniprimer PCR
• Assembly PCR • Multiplex ligation-dependent probe
• Asymmetric PCR amplification (MLPA)
• Colony PCR • Multiplex PCR
• Digital PCR • Nested PCR
• Inverse PCR • Overlap extension PCR
• Helicase-dependent amplification • PAN-AC
• Hot start PCR • Quantitative (real-time) PCR
• In Situ PCR • Reverse transcription PCR
• Intersequence-specific PCR • Solid phase PCR
(ISSR) • Standard PCR
• Ligation-mediated PCR • Thermal asymmetric integrated PCR
• Long PCR • Touch down PCR
• Long Accurate PCR • Universal fast walking
• Long range PCR etc