Studiul morfologiei

bacteriene
Coloratia simpla
Coloratia Gram
 Examinarile bacteriologice urmaresc
evidentierea si identificarea bacteriilor din
produse patologice.

 Dintre metodele folosite in acest scop,

studiul caracterelor morfologice este o
etapa foarte importanta.
 Bacteriileavind dimensiuni de
ordinul µm, nu pot fi vazute cu
ochiul liber, de aceea examinarea
lor se efectueaza cu ajutorul
microscopului.
Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a
studiat bacterii si alte microorganisme la microscop


 Examenul microscopic se executa fie direct
din produsele patologice (examen
microscopic direct), fie din culturi pure.
 Preparatele microscopice sint de 2 feluri:
 - preparat nativ, cu germeni vii
 - frotiu sau preparat colorat, cu germeni
omoriti
 Examenul microscopic da indicatii asupra
prezentei microorganismelor in preparat si
asupra proprietatilor morfotinctoriale:
 - forma (bacili, coci, spirili)
 - marimea
 - mobilitatea ( in preparatul nativ )
 - existenta eventuala a formatiunilor
neobligatorii ( cili, capsula, spori)
 - asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-,
tetrade, etc)
 - proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )
Examenul microscopic direct din produsele
patologice permit in unele infectii stabilirea
diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos,
stafilococ ) si constituie o etapa esentiala
in identificarea bacteriana.
 Preparatul nativ ( cu germeni vii )
 Ex. microscopic al preparatului nativ
reprezinta examinarea directa intre lama si
lamela a unei suspensii de germeni vii
intr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu
de cultura lichid, precum si a produsului
patologic (singe, sediment urinar, lcr).
 Examinarea prep. nativ are implicatii
restrinse si nu da informatii asupra
tuturor proprietatilor morfologice ale
bacteriilor, de aceea este obligatorie
completarea lui cu examinarea
preparatului colorat.
 Examenul microscopic al unui
preparat colorat (frotiu)
 Proprietatile morfotinctoriale ale
bacteriilor pot fi studiate mai detailat
pe preparate fixate si colorate, cu
germeni omoriti . Mai rar se folosesc
coloratii vitale, spre ex. in reactia de
umflare a capsulei .
 Timpii de executie a preparatului
colorat
 Timpi pregatitori:
 - etalarea = intinderea frotiului
 - uscarea
 - fixarea ( procedee fizice - prin incalzire si
chimice: cu alcool metilic, etilic, alcool -
eter, acid acetic )
 Fixarea
 Scopul fixarii este multiplu:
 - microorganismele sint omorite=preparat
neinfectios
 - preparatul adera mai bine de lama
 - prin omorirea microorganismelor se
mareste permeabilitatea peretelui celular
si se produc modificari ale citoplasmei,
care cresc afinitatea fata de coloranti =
detalii fine de strucura
 Coloratia
 Procedeu fizico-chimic complex, in care
colorantii se combina cu constituenti
celulari, facindu-i vizibili la microscop.
Colorantul se absoarbe, apoi se dizolva si
difuzeaza in continutul celular , unde are
loc formarea unei combinatii stabile.
Colorarea se executa de obicei prin
acoperirea suprafetei frotiului fixat cu
colorant, care se lasa sa actioneze un timp
limitat, la cald sau la rece.
 Tipuri de coloratii
 Coloratia simpla, se executa cu un singur
colorant
 Coloratia combinata, care se realizeaza prin
actiunea succesiva sau simultana a mai multor
coloranti, fiecare colorant actionind independent
si fixindu-se pe anumite elemente
 - coloratii speciale: pentru formatiuni
morfologice celulare si extracelulare: corpusculi,
cili, spori, capsula
 Coloratia simpla
 - frotiul fixat
 - se acopera complet cu un singur
colorant: albastru de metilen sau fuxina,
timp de 1-2 min.
 se spala cu apa si se usuca
 in coloratia cu albastru de metilen toate
elementele se coloreaza in albastru
 in coloratia cu fuxina, toate elementele se
coloreaza in rosu
 Coloratia simpla
 Permite stabilirea unor proprietati
morfotinctoriale ca: forma si marimea
microorganismelor, precum si existenta
unor elemente celulare
 Este utila in diagnosticul prin ex.
microscopic direct din produsul patologic
in gonoree, meningita cerebrospinala
epidemica etc
Coloratii combinate: coloratia Gram

 Largutilizata in microbiologie,
pentru ca deosebeste germenii
gram pozitivi de cei gram
negativi, orientind cercetarea in
directia identificarii lor.
Hans Christian Gram (medic danez)
 Coloratia Gram
Tehnica de colorare
 Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2
min. (Se spală cu apă de la robinet ).
 Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2
min. (Se spală cu apă).
 Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu
se mai dizolva colorant. (Se spală cu apă).
 Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se
spala cu apa )
 Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.
 Germenii gram + rezista la decolorare
si isi mentin culoarea albastru violet
initiala; germenii gram – se
decoloreaza si se recoloreaza in rosu
cu fuxina/safranina.
Coloratia Gram
 Diferenta de comportament in
coloratia Gram se explica prin
structura si compozitia chimica
diferita a peretelui celular la
bacteriile gram+ si gram -.
Christian Gram recognized two different types of bacteria based on
reaction to certain staining procedure.
Coloratia Gram permite constituirea
urmatoarelor grupe de bacterii:
 - coci gram + : streptococi, stafilococi,
pneumococi
 - coci gram - : meningococ, gonococ
 - bacili gram + : bacillus antracis ( bacilul
carbunos), corynebacterium diphteriae
( bacilul difteric), listeria monocitogenes,
clostridium botulinum ( bacilul botulinic),
clostridium tetani ( bacilul tetanic)
 Bacili gram - : E. Coli ( bacilul coli ),
Klebsiella, Pseudomonas ( bacilul
piocianic), Salmonella typhi ( bacilul
tific )
 Cococbacili gram - : haemophilus
influenzae, bordetella pertusis,
brucela
Coci Gram +, dispusi in gramezi
Coci Gram+, dispusi in lanturi
Bacili Gram -
Bacili Gram +
Coci Gram +
Cocobacili Gram +
Coci Gram + si Cococbacili Gram +
Frotiu lcr colorat Gram
Trusa comerciala pt coloratia Gram