UNIVERSITATEA DE VEST “VASILE GOLDIŞ” DIN ARAD

FACULTATEA DE ŞTIINŢE ALE NATURII

SPECIALIZAREA BIOLOGIE

STUDIUL MORFOLOGIC, ANATOMIC ŞI

FARMACEUTIC AL SPECIEI DRYOPTERIS FILIX- MAS
VITROCULTIVATĂ

COORDONATORI ŞTIINŢIFICI:
Prof. univ. dr. CACHIŢĂ DORINA.
Asist. univ. dr. ARDELEAN MIRELA

ABSOLVENT,
VLAD IOANA LOREDANA
 În sistematica plantelor, ferigile deschid subregnul
Cormobionta fiind primele cormofite terestre din care
au evoluat toate celelalte plante cu aparatul vegetativ
diferenţiat.
Ferigile, pe lângã rolul lor de plante decorative, pot avea şi calităţi
terapeutice. Cea mai cunoscută ferigă cu reale calități terapeutice este feriga
comună (Dryopteris filix-mas). Floro-glucin-butiro-fenona, substanţă ce intra
în compoziţia chimică a acestei specii are o acţiune paralizantă asupra
paraziţilor intestinali (din clasa Custodae), care apoi se elimină prin acţiunea
unui purgativ (ulei de ricin).
 SCOPUL CERCETĂRII
Cunoaşterea şi caracterizarea morfologică, anatomică şi farmaceutică a
ferigilor, specii mai puţin intrate în atenţia cercetătorilor noştri din domeniul
botanicii, și identificarea unei modalități de clonare rapidă a plantelor, prin
folosirea tehnicilor de micropropagare.

Motivul pentru care am ales această specie în vederea obţinerii

vitroculturii a fost acela că pe lângă rolul ornamental, principala calitate a
acesteia este terapeutică, utilizăndu-se în tratarea viermilor intestinali, a
insomniilor, a bolilor pulmonare, a cancerului, a rănilor şi a rahitismului.

Ne-am propus ca prin schimbarea concentraţiilor nutriţionale şi

fitohormonale, respectiv a regulatorilor de creștere, din mediul în care se
află cultivate explantele utilizate, precum şi prin reglarea condiţiilor de
cultură, să reușim să elaborăm o tehnologie de propagare rapidă a unei
specii din încrengătura Pteridophyta - Dryopteris filix-mas, în regim de
vitrocultură. Totodată, am efectuat şi studii anatomice la nivelul organelor
unor specii din încrengătura Pteridophyta, recoltate din mediul natural.
 GENERALITĂŢI
Ferigile, sunt primele plante vasculare apărute pe uscat, care au corpul
vegetativ reprezentat de generația sporofitică, care devine dominantă. Se
cunosc peste 20000 specii de ferigi, clasificate în aproximativ 300 genuri.

Fig. 1. Ciclul de viață al ferigilor

http://www.google.ro/search?ciclul+de+dezvoltare+la+ferigi
PARTICULARITĂȚI ALE SPECIEI DRYOPTERIS FILIX-MAS

Specie ierboasă perenă, înaltă până la 1,20-1,40 m;

-rizom oblic-ascendent; prezintă la suprafaţă resturi ale
peţioliior din anii precedenţi, spre partea inferioară a
rizomului se găsesc rădăcini adventive subţiri,
negricioase, iar spre vârf inserţia peţioliior frunzelor tinere
şi muguri foliari;

-tulpina aeriană lipseşte;

-frunzele: tinere apar circinat, peţiol scurt acoperit cu

scvame membranoase brun-roşcate, limb dublu penat-
sectat, Deoarece frunzele au dublu rol, atât asimilator cât
şi de sporofile, pe fata inferioară se găsesc grupări de
sporangi numite sori, protejate de membrane numite
induzii;

Fig. 2. Morfologia speciei

 MATERIALELE ŞI METODELE DE LUCRU UTILIZATE

În laboratorul de Biotehnologie vegetală a Universităţii de Vest „Vasile Goldiş”

din Arad, s-a creat o fitobază de vitroplantule de Dryopteris filix-mas.
Pentru iniţierea vitroculturilor de Dryopteris filix-mas am folosit ca material
vegetal, fragmente de rizomi prelevaţi de la plante tinere din flora spontană cu
înălţimea de cca. 30 cm, din zona Deva.
Fragmente de rizomi cu dimensiunea de cca. 2 cm au fost inoculate in vitro, pe
mediu aseptic cu adaos de variați regulatori de creştere, respectiv Murashige-Skoog
(1962), agarizat, modificat de noi și suplimentat cu variați regulatori de creştere, de
aceeași concentrație, analizându-se în acest sens care este cel mai eficient compus de
acest tip în iniţierea unei vitroculturi de ferigi. Urmărirea creşterii vitroplantulelor s-
a făcut prin efectuarea de observaţii ochiometrice, biometrizări periodice şi
fotografierea aspectelor importante.
Vitroplantulele regenerate din aceste fragmente de rizomi, după 60 de zile de
cultivare a lor în regim aseptic pe mediile menționate anterior, au fost transferate pe
un mediu de cultură proaspăt, Murashige-Skoog (1962), modificat de noi, cu adaos de
variați regulatori de creștere, procedură ce poartă denumirea de subcultivare.
Laboratorului de vitroculturi vegetale din cadrul Institutului de Știinţe Ale Vieţii,
U.V.V.G din Arad

Fig. 3. A - H: Dotările
încăperilor cuprinse în
perimetrul Laboratorului de
culturi de celule şi ţesuturi
vegetale din cadrul Institutului
de Ştiinţe ale Vieţii al U.V.V.G.
din Arad.
 Compoziţia mediului de cultură utilizat pentru operarea experimentelor
efectuate
Substratul de cultură utilizat în cadrul experimentelor :

Mediu de bază (MB) Murashige-Skoog (1962) (MS) agarizat,

- macroelemente,
- Fe EDTA,
- microelemente,
-amestec mineral conform cu rețeta originală,
- adaos sporit de vitamine: piridoxină HCl, tiamină HCl şi acid nicotinic
(câte 1 ml/l fiecare față de rețeta originală unde se indică 0,5 mg/l ),

Compoziție la care s-a adăugat:

- m– inozitol 100 mg/l,
- zaharoză 30 g/l
- agar - agar 7 g/l (față de 10 g/l în rețeta originală);

- la o parte din acest mediu de bază (MB) am adăugat regulatori de

creştere (citochinine şi auxine),
- cealaltă cantitate de mediu utilizată fiind lipsită de regulatori de
creștere.
 Prelucrarea materialului vegetal în vederea obţinerii de preparate care au
fost examinate la microscopul optic românesc MC 1
a). Fixare şi conservare
Fixarea şi conservarea materialului proaspăt s-a realizat în alcool etilic 70%.
b). Secţionare
Secţionarea s-a realizat manual, cu ajutorul microtomului de mână şi al briciului botanic,
folosind drept suport măduvă de soc.
c). Îndepărtarea conţinutului celular
Secţiunile obţinute au fost supuse procesului de javelizare (cu hipoclorit de sodiu) timp de
20-35 minute (funcţie de material), după care au fost spălate cu apă acetică şi cu apă distilată.
d). Colorarea secţiunilor
Secţiunile au fost colorate folosind o dublă coloraţie, şi anume: verde iod şi roşu carmin
alaunat (coloraţia clasică utilizată în studiile de histo - anatomie vegetală – Şerbănescu-Jitariu şi
colab., 1983; Andrei şi Paraschivoiu, 2003). Secţiunile au fost colorate mai întâi cu verde iod (1
minut), spălate cu alcool etilic 90%, iar apoi colorate cu roşu carmin alaunat (20 minute) şi
spălate cu apă distilată.
e). Realizarea preparatelor permanente
Secţiunile colorate au fost montate în picături de glicero-gelatină, între lamă şi lamelă,
realizând astfel preparate permanente.
f). Valorificarea preparatelor
După preparatele astfel obţinute s-au realizat desene la microscopul fotonic românesc
MC1, cu oglindă de proiecţie (Projektionszeichenspiegel), precum şi fotografii color la
microscopul fotonic NOVEX (HOLLAND), cu cameră foto digitală Canon A95.
 REZULTATE ŞI DISCUŢII

Pentru iniţierea vitroculturii de Dryopteris filix mas - în luna iulie - au fost

colectate plante, de circa 30 cm lungime din cadrul natural. De la acest material
vegetal s-au prelevat rizomi de cca. 10 cm dimensiune.

Substratul de cultură a fost constituit din mediu de bază Murashige-Skoog (1962)

În cadrul cercetărilor noastre a fost constituită varianta experimentală martor
(V0), mediu Murashige - Skoog lipsit de regulatori de creştere şi alte variante de medii
de cultură la care am adăugat diferiți regulatori de creştere (citochinine şi auxine),
respectiv benziladenină (BA) şi acid–indolilbutiric (AIB), administrați singuri sau în
amestec.

Variantele astfel constituite au fost

V0 - varianta experimentală pe mediu MB-MS (1962) lipsit de regulatori de creştere;
V1- varianta experimentală pe mediu MB-MS (1962) cu adaos de BA în concentraţie de 1 mg/l;
V2 - varianta experimentală pe mediu MB-MS (1962) cu adaos de AIB în concentraţie de 1 mg/l;
V3 - varianta experimentală pe mediu MB-MS (1962) cu adaos de BA şi de AIB, ambele în concentrație
de 1 mg/l.
 Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor de Dryopteris filix-mas
Determinările biometrice efectuate în a 7-a zi de vitrocultură din fitoinoculi de Dryopteris filix-mas L., au arătat o
creştere a întregii plantule la o valoare medie absolută maximă de 0,76 cm (Fig.4A) la inoculii crescuţi pe varianta
de mediu V3 (mediu de bază MB–MS suplimentat cu 1 mg/l BA în amestec cu 1 mg/l AIB) înregistrând o valoare
procentuală de 76% (Fig. 4A), diferenţa față de martor V0 - termen de referință considerat ca 100% fiind foarte
semnificativă din punct de vedere statistic.

V0 V1 V2

Fig.4. Evoluţia comparativă a vitroplantulelor de Dryopteris filix-mas, la 7

zile de la inocularea in vitro a rizomilor prelevaţi de la plante cultivate în
cadrul natural, inoculaţi și vitrocultivaţi pe mediul de cultură Murashige-
Skoog (1962) cu adaos de diferiţi regulatori de creştere, unde: V 0-mediu
MB-MS lipsit de regulatori de creştere; V1-mediu MB-MS cu 1 mg/l BA; V2-
mediu MB-MS cu 1 mg/l AIB; V3-mediu MB-MS cu 1 mg/l BA şi 1 mg/l AIB.

V3
 V0 V1
Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor de Dryopteris filix-mas
Observaţiile efectuate asupra primelor vitroculturi realizate din rizomi de plante de Dryopteris filix mas
colectate din cadrul natural, au scos în evidenţă faptul că, upă 30 de zile de la inoculare, varianta de mediu V3 -
respectiv MB-MS cu adaos de BA şi AIB, în concentraţie de 1 mg/litru, a prezentat cele mai bune rezultate în ceea
ce priveşte rizogeneza şi caulogeneza (după cum se poate observa în imaginile din Fig.5).

V0 V1 V2

V3
Fig.5. Evoluţia comparativă a vitroplantulelor de Dryopteris filix-mas, la 30 de zile de
la inocularea in vitro a rizomilor prelevaţi de la plante cultivate în cadrul natural,
inoculaţi și vitrocultivaţi pe mediul de cultură Murashige-Skoog (1962) cu adaos de
diferiţi regulatori de creştere, unde: 1V 0-mediu MB-MS lipsit de regulatori de
creştere; 1V1-mediu MB-MS cu 1 mg/l BA; 1V2-mediu MB-MS cu 1 mg/l AIB; 1V3-
mediu MB-MS cu 1 mg/l BA şi 1 mg/l AIB.
Fig.6 Repezentarea grafică a valorilor medii corespunzătoare parametrilor biometrizaţi la nivelul unui inocul constând din rizomi prelevaţi de la plante de Dryopteris filix- mas
la 7, 14 şi 30 de zile, pe variantele de medii: V0 - (lot control) mediu mineral de bază MB-MS lipsit de regulatori de creştere; V1 - mediu mineral de bază MB-MS suplimentat
cu un adaos de 1 mg/l benziladenină (BA); V2-mediu mineral de bază MB-MS suplimentat cu un adaos de 1 mg/l acid indolilbutiric (AIB); V3-mediu mineral de bază MB-MS
suplimentat cu 1 mg/l benziladenină (BA) în amestec cu 1 mg/l acid indolilbutiric (AIB), date exprimate în valori absolute (unde: A-lungimea medie a întregii plantule; B-
număr mediu de frunzuliţe; C- lăţimea medie a celei mai mari frunzuliţe; D-număr mediu de ramificaţii caulinare prezente pe fitoinocul; E-lungimea medie a ramificaţiei; F-
numărul de rădăciniţe; G-lungimea medie a rădăciniţei; H-lungimea medie a tulpiniței principale).
 Rezultate obţinute în urma examinării la microscopul optic a unor organe
prelevate de la specia Dryopteris filix-mas

Fig. 7. Secțiune transversală prin rizom de

Dryopteris filix mas cu fascicule înconjurate de inel
de fibre cu pereți groși
Fig. 8. Secțiune transversală prin tulpina de Dryopteris filix-mas cu fascicule
conducătoare (plectostel)
 Fig. 9. Secțiune prin sporocarp la
Dryopteris filix-mas

Fig. 10. Secțiune prin frunză la Dryopteris

fili-mas, induzie cu sporangi
PRODUSE FARMACEUTICE PE BAZĂ DE DRYOPTERIS FILIX- MAS
 CONCLUZII
1. În ceea ce priveşte micropopagarea in vitro, în urma observaţiilor efectuate în
acest experiment, respectiv asupra primei vitroculturi care a fost realizată din
fragmente de rizomi prelevaţi de la plante tinere recoltate din cadrul natural,
putem concluziona faptul că această specie este uşor de cultivat in vitro, după 30
de zile de la inocularea rizomilor pe mediul de cultură, varianta V3 - mediul de
cultură Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu amestec de citochinină, respectiv
benziladenină (BA) şi auxină (AIB), în concentraţie de 1 mg/litru din fiecare a
prezentat cele mai bune rezultate în ceea ce priveşte rizogeneza şi caulogeneza.

2. Dacă pe mediu lipsit de regulatori de creștere (varianta V 0 - lot martor), la 30 de

zile de la inocularea minibutașilor pe mediul de cultură MB - MS (1962), nu a
avut loc regenerarea de mugurași, tulpinițe și rădăcinițe, în cazul variantei V 1
(MB - MS cu adaos de BA 1mg/l), s-a observat o stimulare a creșterii mugurilor
axilari situați la baza pețiolurilor frunzulițelor, în timp ce la varianta V 2 (MB –
MS - cu adaos de AIB 1mg/l) a fost stimulată rizogeneza.

3. Comparativ cu frunzuliţa de la muşchi, frunza (fronda) ferigilor prezintă o

structură mult mai complexă şi diversificată. La cele mai multe ferigi celulele
epidermice conţin cloroplaste, iar prezenţa stomatelor spre deosebire de briofite,
devine o însuşire constantă.
 VĂ MULȚUMESC
PENTRU ATENȚIE!